一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法与流程

本发明涉及细胞的体外培养领域，具体涉及一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法。

背景技术：

成肌细胞位于骨骼肌细胞膜和细胞基膜之间，主要来源于动物胚胎的中胚层，属于单核梭型细胞。动物的成肌细胞最早于1961年从青蛙的骨骼肌肌纤维中发现并分离培养。研究表明，成肌细胞在动物的骨骼肌生长、发育、修复与维持中发挥极其重要的作用。

通过多年的研究，人们发现体外分离培养培养的成肌细胞可广泛应用在遗传分析、基因功能鉴定、基因治疗、组织工程等许多领域。成肌细胞主要以单核小圆形细胞分布于肌纤维外周。当骨骼肌遭受外界刺激或受到损伤后，成肌细胞被激活并表达生肌调节因子，融合形成新的肌核从而导致骨骼肌纤维的肥大和延伸，使骨骼肌的结构和功能得以恢复。

目前已发现的矮小型鸡共有8种类型，其中由性连锁矮小型基因(dw)引起的矮小型鸡，因ghr基因缺失突变引起，在鸡的育种实践中具有广泛用途，主要是这一突变可使鸡的体重降低30％左右，具有体型变小、耗料减少、饲养成本降低等优点。因此，开展对ghr基因缺失突变引起的性连锁矮小鸡的骨骼肌生长、发育的遗传机制的研究具有重要的理论和实践意义。因此，需要对ghr缺失型矮小鸡的成肌细胞进行体外分离培养培养，以为矮小型鸡骨骼肌生长和发育的细胞生物学机制及分子机理研究提供技术和手段支持。

技术实现要素：

本发明的目的是提供是鸡提供ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

(1)取孵化至11天龄的ghr缺失型矮小鸡鸡胚，用75％的酒精涂抹蛋壳表面进行彻底消毒；沿着鸡蛋气室边缘将蛋壳剪开，取出鸡胚并保持胚体完整，将两侧腿部从胚体分离出来，置于含20％fbs的dmem培养液中；

(2)剔除血管、脂肪，用洗涤液洗涤3次后，将肌肉组织剪碎后放入离心管中，离心后静置，分离后在离心管底部得到肌肉组织；

(3)将0.1％的胶原酶ⅰ加入离心管中，消化30分钟；加入0.25％的胰酶，继续消化1小时，再加入含20％fbs的dmem培养基终止消化；

(4)使用200目筛过滤并收集滤液，离心后除去上清液，得到成肌细胞；

(5)加入含15％fbs的dmem培养液使细胞重新悬浮，然后转移至培养皿中，置于细胞培养箱中培育；

(6)观察到培养的细胞贴壁生长达到90％时，除去原来的培养液后，用pbs溶液冲洗；加入2ml0.25％胰酶消化液作用1分钟，最后加入含血清的完全培养基终止消化；

(7)离心除去上清液后，加入含血清的完全培养基中，按照1:3的比例接种到新的培养瓶中继续培养后，即得鸡ghr缺失型突变体成肌细胞。

优选地，步骤(2)中的洗涤液为ph7.4的含双抗的pbs溶液。

优选地，步骤(2)中离心的转速为1000转/分钟，时间为1-2min。

优选地，步骤(3)中消化的温度为37℃

优选地，步骤(4)中离心的转速为1000转/分钟，离心时间为5-7min后。

优选地，步骤(6)中的pbs溶液含双抗且不含ca²⁺和mg²⁺。

优选地，步骤(7)中离心的转速为1000转/分钟，离心时间为5-7min后。

本发明的有益效果：本发明以ghr基因缺失型突变体矮小型鸡的鸡胚为材料，采用胶原酶和胰酶消化法和差速贴壁法进行ghr基因缺失型突变体矮小型鸡成肌细胞的分离培养，并采用免疫荧光法进行特异性鉴定，为鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养提供了一种新方法。

附图说明

图1是使用本发明的分离培养方法培养6小时时细胞的生长状态；

图2是本发明的使用本发明的分离培养方法培养48小时时细胞的生长状态；

图3是对分离培养的细胞进行细胞核染色后的显微镜图片；

图4是对分离培养的细胞中的肌肉特异表达蛋白进行免疫荧光标记后观察到的图片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细说明。

以下实施例使用的主要材料的来源：

m199培养基，dmem培养基购自美国gibco公司；

胰蛋白酶、i型胶原酶购自美国sigma公司；

胎牛血清(fbs)购买自美国life公司。

实施例1鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养

(1)取孵化至11天龄的ghr缺失型矮小鸡鸡胚，用75％的酒精涂抹蛋壳表面进行彻底消毒；沿着鸡蛋气室边缘将蛋壳剪开，取出鸡胚并保持胚体完整，将两侧腿部从胚体分离出来，置于含有20％fbs的dmem培养液中；

(2)剔除血管、脂肪，用ph7.4的含双抗的pbs溶液洗涤3次后，将肌肉组织剪碎并放入离心管中，在1000转/分钟转速下离心1min后静置，分离后在离心管底部得到肌肉组织；

(3)将0.1％的胶原酶ⅰ加入离心管中，在37℃消化30分钟；然后加入0.25％的胰酶，继续消化1小时，最后加入含20％fbs的dmem培养基终止消化；

(4)使用200目筛过滤并收集滤液，在1000转/分钟转速下离心5min后除去上清液，得到成肌细胞；

(5)加入含15％fbs的dmem培养液使细胞重新悬浮，然后转移至培养皿中，置于细胞培养箱中培育；

(6)观察到培养的细胞贴壁生长达到90％时，除去原来的培养液，用含双抗的无ca²⁺、mg²⁺的pbs缓冲液冲洗；然后加入2ml0.25％胰酶消化液作用1分钟，最后加入含血清的完全培养基终止消化；

(7)在1000转/分钟的转速下离心5min后除去上清液，加入含血清的完全培养基中，按照1:3的比例接种到新的培养瓶中继续培养后，即得鸡ghr缺失型突变体成肌细胞。

由图1可以看出，经过6小时培养后细胞贴壁生长，大部分细胞呈梭形或纺锤形。其形态特征是细胞有两极、体积较小、胞核的折光性较强。由图2可以看出，经过48小时培养后细胞密度达到90％以上，增殖迅速，细胞形态呈现长梭型，并且平行排列，呈现规律性，细胞之间紧密相邻。

实施例2鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的鉴定

经过48h培养后，采用成肌细胞的特异标志dapi、desmin进行细胞免疫荧光鉴定。具体操作为：当观察到24孔培养板中的细胞生长密度达到90％以上时，用pbs清洗细胞2-3次，每次清洗时间为5分钟。然后除去pbs，再向24孔培养板中加入200～300μl4％的多聚甲醛，在室温下固定20分钟。然后加入pbs清洗3次，每次清洗每5分钟。除去pbs，每孔加入1ml的1‰triton破膜液，在室温下破膜15-20分钟，最后将破膜液吸干。然后，每孔加入200μl与二抗相同宿主的血清封闭液，室温下密封30分钟，再将封闭液除去，不用清洗，然后加入desmin或者myhc一抗，放入4℃的冰箱中过夜，保持培养板平整。第2天取出培养板，用pbs清洗3次，每次清洗3分钟，接着往每个孔中加入经1：50稀释的fitc溶液，避光孵育1小时。用pbs清洗3次，每次清洗5分钟，再向每个孔中加入200μldapi，染核5分钟。最后使用pbs清洗3次，每次清洗5分钟。往载玻片上添加一滴glycerol封片液，在荧光显微镜下观察并且拍照。

由图3可以看出，用dapi对分离培养后的细胞核染色，可在荧光显微镜下管产道细胞核成蓝色。由图4可以看出，对分离培养的细胞中的肌肉特异表达蛋白进行免疫荧光标记后，可在荧光显微镜下观察到蓝色。染色的结果表明分离培养的是鸡ghr缺失型突变体的成肌细胞。