一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法及用途与流程

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种鉴定牵牛属及近缘属分类地位和物种的方法及用途。

背景技术：

牵牛属是旋花科下的一个属，是一年生或多年生缠绕草本。该属约24种，广布于温带和亚热带。我国有3种，牵牛、变色牵牛、圆叶牵牛，南北均产。针对牵牛属及近缘属的相关植物，现有技术中一直存在这尚未确定分类地位的和物种的植物，例如针对国内常见的三种“牵牛”，即裂叶牵牛(pharbitishederaceajacq.)、牵牛(pharbitisnil(l.)roth.)和圆叶牵牛(pharbitispurpurea(l.)roth)。林奈在1762年最早将它们归为convolvulu属，roth1787年又最早将圆叶牵牛转移到番薯属(ipomoea)，而choisy随后又将牵牛和裂叶牵牛归到牵牛属(pharbitis)。美国学者austin在1986年的专著中认为这是三个独立的物种，而我国分类学者方瑞征等人在《中国植物志》(1976)及《floraofchina》(1995)中则认为他们是两个独立的物种，其中裂叶牵牛和牵牛应归为一个物种。上述方式的鉴定一般是基于形态学特征上的偏好凭经验和直觉做出的判断，没有可以重复的检验的方法。针对这三种牵牛长期的分类地位不确定性，还给诸多实践工作带来了混乱和冲突。如在《中国药典》中将三种牵牛的种子统称为“牵牛子”作为同一味药材认定，而在植物检疫中将圆叶牵牛从“牵牛”中区别出来认定为有害物种进行铲除和防范。

虽然国内有相关学者做了一些分子学方面的探索性研究，但是存在实验设计和方法学上的缺陷，且得到的结论和《中国植物志》或《中国药典》矛盾，因此无法作为参考标准。目前现有的研究一般都是一个物种及一个样品，这样的取样方法忽略了物种的种内遗传多样性和种间遗传多样性的关系，得到的结果只能判定物种之间的亲缘关系远近，不能判定其分类地位和物种，只有种内多样性小于种间多样性时其物种鉴定才能成立。因此建立一种标准方法准确确定牵牛属及近缘属尤其是上述的三种常见牵牛分类地位具有重要的实际应用价值。

技术实现要素：

本发明针对上述技术问题，提出一种鉴定牵牛属及近缘属分类地位和物种的方法及用途。该方法利用多个步骤包括：获取序列矩阵、建立进化树、建立dna条形码分别独立分析进行鉴定，将获取的鉴定结果相互印证，具有重复性，使实验结论更可靠且使用性更广。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法，包括以下步骤：

步骤1：提取待测植物的基因组dna；以待测植物的基因组dna为模板，以分子标记的引物进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行双向测序，对序列进行拼接和纠正，获取得到序列矩阵；

步骤2：基于所述序列矩阵建立进化树，比较待测植物在进化树的位置和支系情况；

步骤3：基于所述序列矩阵建立dna条形码，确定dna条形码的间隔区的大小和位置；

步骤4：对比步骤2和步骤3获取待测植物相应的鉴定结果，当步骤2和步骤3的鉴定结果均一致则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。

作为优选：所述步骤1中分子标记为叶绿体dna的rbcl基因，所述rbcl基因的上游引物的序列为seqidno：1所示，下游引物的序列为seqidno：2所示。

作为优选：所述rbcl基因在步骤1中的扩增程序为：94℃预热4min；94℃30s，50℃30s，72℃1.0min，36个循环；72℃10min。

作为优选：所述步骤1中分子标记为核糖体dna的its基因，所述its基因的上游引物的序列为seqidno：3所示，下游引物的序列为seqidno：4所示。

作为优选：分别取以rbcl基因和its基因作为分子标记获取的步骤2和步骤3的鉴定结果进行对比，如鉴定结果一致，则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。

作为优选：建立进化树的方法为邻接法。

作为优选：如进化树显示支系数量为单系，则步骤2鉴定多个待测物种之间属于不同分类地位和物种，如进化树显示支系数量为多个且每个支系中同时混杂着多个待测物种，则步骤2鉴定多个待测物种之间属于相同分类地位和物种；

如进化树显示支系数量为多个，且满足每个支系中同时混杂着多个待测物种，当多个支系之间存在产生杂交的两个物种，则步骤2鉴定多个待测物种之间属于相同分类地位和物种。

作为优选：当dna条形码中有间隔，则步骤3鉴定多个待测物种之间不属于相同分类地位和物种；当dna条形码中无间隔，则步骤3鉴定多个待测物种之间属于相同分类地位和物种。

作为优选：所述的牵牛属及近缘属为裂叶牵牛(pharbitishederaceajacq.)、牵牛(pharbitisnil(l.)roth.)和圆叶牵牛(pharbitispurpurea(l.)roth)。

一种上述鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法在鉴定裂叶牵牛(pharbitishederaceajacq.)、牵牛(pharbitisnil(l.)roth.)和圆叶牵牛(pharbitispurpurea(l.)roth)的分类地位和物种的应用。

一种权上述鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法在鉴定中药材牵牛子中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、已知常用的rbcl基因仅能部分扩增待测产物的dna，通过设计牵牛属及近缘属的特异pcr扩增引物，实现对待测物种和已知物种的扩增效率为100％，同时对中药材“牵牛子”的扩增效率为83.3％，满足pcr实验要求，使最终获取的鉴定结果更加可靠准确。

2、本发明可以分别独立采用rbcl基因和its基因进行pcr扩增获取相应的序列矩阵，针对分别获取的序列矩阵建立进化树和条形码，将两组序列矩阵获取的最终鉴定结果进行比较，以相互印证鉴定结果，使获取的鉴定结果更加准确。

3、本发明的牵牛属及近缘属通用的分子标记及其用途和鉴定牵牛属及近缘属分类地位和物种的方法，能够对多个不同来源的牵牛属及近缘属样品进行分析，不仅能够得到牵牛属及近缘属物种之间的关系，同时还能获取到每种牵牛属或近缘属的植物的分类地位和物种。

4、提供了可确立国内三种常见牵牛即裂叶牵牛(pharbitishederaceajacq.)、牵牛(pharbitisnil(l.)roth.)和圆叶牵牛(pharbitispurpurea(l.)roth)的分类地位的基因、扩增引物和扩增条件，解决了实际应用中涉及到的“牵牛”的身份问题，如可用于中药材“牵牛子”(黑丑和白丑)、海关和出入境检疫的“圆叶牵牛”。

5、本发明将建树分析结果与dna条形码间隔分析结果相互验证、杂交现象与生物学物种概念相印证，同时基于不同基因的鉴定结果相互验证，使本发明最终获取的鉴定结果更加准确，且可重复性性强。

附图说明

图1为本发明实施例所述进化树构建方法筛选比较图；

图2为本发明实施例采用rbcl基因和its基因构建的进化树比较图；

图3为本发明实施例采用rbcl基因获取的遗传距离对比柱状图；

图4为本发明实施例采用its基因获取的遗传距离对比柱状图；

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法，包括以下步骤：

步骤1：提取待测植物的基因组dna；以待测植物的基因组dna为模板，以分子标记的引物进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行双向测序，对序列进行拼接和纠正，获取得到序列矩阵；

步骤2：基于所述序列矩阵建立进化树，比较待测植物在进化树的位置和支系情况；

步骤3：基于所述序列矩阵建立dna条形码，确定dna条形码的间隔区的大小和位置；

步骤4：对比步骤2和步骤3获取待测植物相应的鉴定结果，当步骤2和步骤3的鉴定结果均一致则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。

作为一可选实施例：所述步骤1中分子标记为叶绿体dna的rbcl基因，所述rbcl基因的上游引物的序列为seqidno：1所示，下游引物的序列为seqidno：2所示。

作为一可选实施例：所述rbcl基因在步骤1中的扩增程序为：94℃预热4min；94℃30s，50℃30s，72℃1.0min，36个循环；72℃10min。

作为一可选实施例：所述步骤1中分子标记为核糖体dna的its基因，所述its基因的上游引物的序列为seqidno：3所示，下游引物的序列为seqidno：4所示。

作为一可选实施例：分别取以rbcl基因和its基因作为分子标记获取的步骤2和步骤3的鉴定结果进行对比，如鉴定结果一致，则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。

作为一可选实施例：分别取rbcl基因和its基因作为引物经扩增后获取的序列矩阵构建的进化树进行比较，判断两个进化树的鉴定结果是否一致，如一致则所述牵牛属及近缘属的分类地位和物种均为该鉴定结果。

作为一可选实施例：建立进化树的方法为邻接法。

nj法和mp法构建进化树分析：

将比对后的序列矩阵导入mega6.0计算k2-p遗传距离及构建进化树；使用puap构建mp树，采用启发式搜索，搜索设置是随机增加序列和tbr分支交换法，1000次重复的bootstrap分析来检验生成树拓扑结果的可靠性。结果如图1所示，mp方法(左图)未能将部分物种(使用颜色显示)聚在一起，因此它们与相邻支系的关系并未解决，相比之下使用nj方法(右图)将这些物种聚成了单系解决了与相邻支系的关系。此外，nj方法得到的树图各支系的支持率明显高于mp方法。这些结果证明了使用nj方法的优越性，nj建立进化树的方法也可叫做邻接法。

作为一可选实施例：如进化树显示支系数量为单系，则步骤2鉴定多个待测物种之间属于不同分类地位和物种，如进化树显示支系数量为多个且每个支系中同时混杂着多个待测物种，则步骤2鉴定多个待测物种之间属于相同分类地位和物种；

如进化树显示支系数量为多个，且满足每个支系中同时混杂着多个待测物种，当多个支系之间存在产生杂交的两个物种，则步骤2鉴定多个待测物种之间属于相同分类地位和物种。

作为一可选实施例：当dna条形码中有间隔，则步骤3鉴定多个待测物种之间不属于相同分类地位和物种；当dna条形码中无间隔，则步骤3鉴定多个待测物种之间属于相同分类地位和物种。

作为一可选实施例：所述的牵牛属及近缘属为裂叶牵牛(pharbitishederaceajacq.)、牵牛(pharbitisnil(l.)roth.)和圆叶牵牛(pharbitispurpurea(l.)roth)。

一种上述鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法在鉴定裂叶牵牛(pharbitishederaceajacq.)、牵牛(pharbitisnil(l.)roth.)和圆叶牵牛(pharbitispurpurea(l.)roth)的分类地位和物种的应用。

一种权上述鉴定牵牛属及近缘属的分类地位和物种的方法在鉴定中药材牵牛子中的应用。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的牵牛属及近缘属通用的分子标记及其用途和鉴定牵牛属及近缘属分类地位和物种的方法，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1：

针对裂叶牵牛(pharbitishederaceajacq.)、牵牛(pharbitisnil(l.)roth.)和圆叶牵牛(pharbitispurpurea(l.)roth)分类地位和物种的鉴定方法：

1、待测植物：共64份待测植物，其中裂叶牵牛7份、牵牛21份、圆叶牵牛18份。

实验仪器：珠磨式组织研磨器、台式高速离心机、pcr仪、电泳仪、凝胶成像分析系统。

2、dna提取：取硅胶干燥叶片材料20mg或牵牛种子1-2粒加入2ml离心管后，使用珠磨式组织研磨器粉碎40s至材料成粉末状。后续使用植物基因组dna提取试剂盒进行dna提取，具体方法参考dna提取试剂盒说明书。

3、pcr扩增：

(1)反应体系：为25ul，即10×buffer(含mg²⁺)，2.5ul；2.5mmdntp，1ul；10umprimer，0.5ul；模板dna，1ul；extaq，0.125ul；ddh2o，19.375ul；

(2)反应引物及条件：以核糖体dna的its基因的扩增引物对待测植物进行pcr扩增，its基因的上游引物的序列为seqidno：3所示，下游引物的序列为seqidno：4所示。

pcr扩增程序：94℃预热4min；94℃30s，50℃30s，72℃1.0min，36个循环；72℃10min。

以叶绿体dna的rbcl基因的扩增引物对待测植物进行pcr扩增，rbcl基因的上游引物的序列为seqidno：1所示，下游引物的序列为seqidno：2所示。

pcr扩增程序：94℃预热4min；94℃30s，52℃30s，72℃1.0min，36个循环；72℃10min。

4、测序：

对两组pcr产物直接进行双向测序，测序引物同上述对应的pcr扩增引物。

5、序列拼接和比对：

使用contigexpress对两组序列进行拼接和纠正，根据峰图去除两端测序质量较差的序列，使用bioedit对序列矩阵进行自动比对辅以人工校正。

6、基于nj法(邻接法)构建进化树：将rbcl基因和its基因的引物对作为引物分别经扩增后获取两组序列矩阵，并将两组序列矩阵导入mega6.0分别构建两个进化树，其结果如图2所示，左侧图为its基因作为引物经扩增后获取的序列矩阵构建的进化树，右侧图为its基因作为引物经扩增后获取的序列矩阵构建的进化树。如图2可知，两种基因均将牵牛属物种聚成支持率较高的单系p，这验证了牵牛属地位的合理性。在牵牛属的内部，两种基因都将研究材料聚成了相同的两个支系，在两个支系中即a和b中，分别同时混杂着三种牵牛的样本，这说明目前的牵牛是一个多系，三种待测植物属于相同的分类地位和物种；另外在不同的支系，即a和b两个支系中存在可以杂交物种，则进一步印证了三种待测植物属于相同的分类地位和物种。

7、dna条形码间隔分析：

采用taxondna软件，对不同序列的种间和种内变异进行统计分析，并构建种间、种内变异分布的柱状图以估不同的序列是否存在种间和种内界限，即“barcodinggap”。结果如图3和图4所示，所述图中每一横向坐标对应遗传距离相应数值的柱状图，其左侧为种内遗传距离值对应的配对数量，其右侧为种间遗传距离值对应的配对数量。图3所示在假定三种牵牛为地位独立的三个物种的情况下rbcl基因种间遗传距离在0-1.5距离间隔中均有分布，即种间差异和种内差异不明显，这与生物学物种的定义不符，因此三种牵牛为同一个物种。同理，如图4所示使用另外一个基因its所做的分析也出现了与rbcl类似的种间遗传距离和种内遗传距离没有明显差异的情况。因此、dna条形码间隔分析结果显示三种牵牛属于同一个物种。

8、结果分析：

分别取上述步骤6和步骤7的鉴定结果，鉴定结果均一致为：裂叶牵牛(pharbitishederaceajacq.)、牵牛(pharbitisnil(l.)roth.)和圆叶牵牛(pharbitispurpurea(l.)roth)属于同一分类地位和物种。

实施例2：

中药材牵牛子的鉴定方法：其待测植物包括待测中药材和牵牛子，其余步骤和判断原则均与实施例1所述的步骤2～8均一致。具体判断结果如下：待测中药材和牵牛子基于rbcl基因和its基因作为引物分别获取的进化树中，判断待测中药材和牵牛子是否各自聚成单系，如是则判断待测中药材不属于牵牛子，如不是则判断待测中药材属于牵牛子。

计算待测中药材和牵牛子分别在rbcl基因和its基因作为引物经扩增后获取的序列矩阵计算种间遗传距离和种内遗传距离，基于种间遗传距离和种内遗传构建dna条形码，判断dna条形码上是否有明显的间隔，如有则证明待测中药材不属于牵牛子，如没有则待测中药材属于牵牛子。

将上述各步骤的鉴定结果进行对比，如鉴定结果均一致则该鉴定结果为鉴定待测植物的分类地位和物种的结果。本发明实施例最终获取的鉴定结果可靠性更高，更加准确。

序列表

<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>一种鉴定牵牛属及近缘属分类地位和物种的方法及用途

<141>2017-09-27

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

tattagtattaggattaggtgggaa25

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

gaaacggtctctccaacgcat21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

tcctccgcttattgatatgc20

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

ggaaggagaagtcgtaacaagg22