一种襄麦冬内生黑曲霉菌及在制备甾体皂苷中的应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体地是一种襄麦冬内生真菌，该内生真菌是能够产生襄麦冬甾体皂苷的内生黑曲霉菌。

背景技术：

襄麦冬甾体皂苷，是国家地理标志产品、湖北道地中药材植物——襄麦冬liriopespicatavar.proliferay.t.ma块根的主要活性成分，它的皂苷元基本骨架属于螺甾烷(spirostane，共有27个碳原子组成)的衍生物，依照螺甾烷结构中c25的构型和环的环合状态，可将其分为螺甾烷醇类（c25为s构型）、异螺甾烷醇类（c25为r构型）、呋甾烷醇类（f环为开链衍生物）、变形螺甾烷醇类（f环为五元四氢呋喃环）四种类型。现已从襄麦冬块根中分离出14种皂苷，其主要苷元是薯蓣苷元(diosgenin)和鲁斯可苷元(ruscogenin)，均为c25(s)异构体，其中以山麦冬皂苷c(ls-s3)含量较高。研究表明：甾体皂苷具有抗心肌缺血、抗血栓形成、耐缺氧、抗衰老、降血糖等方面的药理作用，它对改善机体免疫系统、增进胃肠运动机能等方面都有着积极的影响，最新的研究表明它还具有抗肿瘤作用。

尽管随着手性合成和寡糖合成方法的进展，已有一些关于襄麦冬甾体皂苷化合物全合成的报道，但是由于甾体皂苷结构的复杂性，合成难度非常大，且化学合成对环境造成巨大的污染，目前主要是通过分离块根提取物直接获得。但是，在襄麦冬实际生产中，存在着诸如“连作障碍种植面积小”、“受气候条件影响较大”、“块根生产周期长”、“甾体皂苷含量低”、“皂苷提取成本高”等因素，导致襄麦冬甾体皂苷的市场投放受到限制。目前，关于一种能够通过微生物发酵产生襄麦冬甾体皂苷的内生真菌及其应用，还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种制备襄麦冬甾体皂苷的内生真菌，内生真菌是分离自湖北省襄阳市欧庙镇襄麦冬gap基地生产的襄麦冬活体块根，是通过微生物发酵产生襄麦冬甾体皂苷的内生黑曲霉菌及在制备襄麦冬甾体皂苷中的应用。

本发明的技术解决方案在于：所述的内生黑曲霉菌分离自襄麦冬（liriopespicatavar.proliferay.t.ma）的活体块根，经18srdna序列鉴定为黑曲霉菌（aspergillusnigerstrainef026），已保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏日期为2016年12月15日,保藏编号为cctccno.m2016753。

本发明的技术解决方案中所述的黑曲霉菌的分离步骤是：

(1)将清洗干净的襄麦冬块根用75%(v/v)乙醇浸泡2min，用无菌水漂洗；再用有效氯含量4-6%的次氯酸钠溶液浸泡2min，最后用无菌水漂洗、蘸干；

(2)将上述襄麦冬块根在无菌条件下剪去两头褐变部分，切割成0.5cm×0.5cm组织小片，置于pda培养基(含氨卞青霉素，终浓度为50ug/ml)上，每皿植入2片，用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养；

(3)5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的pda培养基上纯化培养，最终得到襄麦冬内生黑曲霉菌(ef026)。

本发明的技术解决方案中所述的黑曲霉菌在马铃薯葡萄糖琼脂（pda）培养基上28℃培养，最初为白色，渐变为边缘白色，中间灰褐色，边缘整齐，背面蓝黑色。

利用本发明的技术解决方案中所述的襄麦冬内生黑曲霉菌制备甾体皂苷是采用所述的黑曲霉菌株通过液体发酵制备得到甾体皂苷。

利用本发明的技术解决方案中所述的襄麦冬内生黑曲霉菌液体发酵的培养基是马铃薯液体培养基（pdb），所述的液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水。

利用本发明的技术解决方案中所述的襄麦冬内生曲霉菌用于制备襄麦冬甾体皂苷的步骤如下：

(1)取所述的内生黑曲霉菌(ef026)菌株菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的pda培养基试管，于28℃活化培养72小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；

(3)将配制液体发酵培养基分别装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10%的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；

(4)发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物，研磨粉碎；

(5)将发酵粉碎物转入锥形瓶中，加入100ml75%乙醇60℃水浴1.5小时后，过滤，得滤液；同时，滤渣再加入100ml的75%乙醇，继续水浴1.5小时后再次过滤，合并2次滤液；

(6)对滤液采用减压浓缩方法，去除乙醇，得到浸膏，加入100ml纯水溶解；

(7)将上述浸膏水溶液转入分液漏斗中，加入40ml乙醚进行充分萃取，去除乙醚层（含油脂、色素等），保留水层；

(8)将水层溶解物转至新的分液漏斗中，加入100ml水饱和正丁醇进行充分萃取，去除水层（含糖类等），保留正丁醇层，减压浓缩去除正丁醇后，得浸膏，加入甲醇复溶得襄麦冬甾体皂苷。

本发明所述的襄麦冬内生黑曲霉菌，其18srrna基因序列如下：

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本发明是利用产自湖北省襄阳市欧庙镇襄麦冬原产地——襄麦冬gap基地生产的襄麦冬，从其活体块根中分离、纯化可自身代谢产生甾体皂苷的内生真菌菌株，并通过微生物发酵进行“快速化”、“工厂化”来大量生产襄麦冬甾体皂苷。内生黑曲霉菌ef026菌株，可通过液体发酵生产襄麦冬甾体皂苷，它可避免化学合成对环境造成的污染，更能规避襄麦冬药材种植生产中的各种不利因素，是寻找襄麦冬甾体皂苷新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

附图说明

图1是本发明所述内生黑曲霉菌ef026在pda平板培养基上的形态图。

内生黑曲霉菌ef026样品的保藏信息：

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；

地址：中国武汉武汉大学

保藏日期：2016年12月15日；

保藏编号：cctccno.m2016753；

分类命名：黑曲霉菌（aspergillusnigerstrainef026）。

图2是本发明所述内生黑曲霉菌发酵提取物(b)中襄麦冬甾体皂苷与标准品山麦冬皂苷b（a）hplc比对图谱。

具体实施方式

本发明的第一方面，提供一种内生真菌，其分类归属为黑曲霉菌aspergillusniger。

(1)本发明所述的内生真菌ef026菌株是从百合科山麦冬属植物襄麦冬liriopespicatavar.proliferay.t.ma的活体块根中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经18srdna序列鉴定为黑曲霉菌（aspergillusniger）。该菌株已保藏，保藏编号为cctccno:m2016753，保藏日期为2016年12月15日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（cctcc），地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072。

(2)在马铃薯葡萄糖琼脂（pda）培养基上28℃培养，最初为白色，渐变为边缘白色，中间灰褐色，边缘整齐，背面蓝黑色，如图1所示；

(3)本发明所述的内生真菌ef026菌株的its和5.8srdna碱基序列，如seqidno.1所示。将测序结果于ncbi网站进行序列比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）。同aspergillusnigerstrainan0512，kp036601.1，同源性99%；

本发明的第二方面，提供上述襄麦冬内生真菌在制备襄麦冬甾体皂苷中的应用。

(1)所述的襄麦冬甾体皂苷是采用所述的内生真菌ef026菌株通过液体发酵制备得到。

(2)所述的液体发酵培养基是马铃薯液体培养基（pdb），所述的液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水。

(3)襄麦冬甾体皂苷，英文名steroidalsaponins，是一类甾体皂苷的混合物，其主要苷元是薯蓣苷元(diosgenin)和鲁斯可苷元(ruscogenin)，均为c25(s)异构体。其化学结构式分别如下：

薯蓣苷元c27h42o3鲁斯可苷元c27h42o4

(4)本发明所述的襄麦冬内生真菌，经发酵可得襄麦冬甾体皂苷，其工艺步骤如下：

菌种活化→种子培养→发酵培养→发酵产物冷冻干燥→75%乙醇浸提→减压浓缩→乙醚萃取除脂→正丁醇萃取除糖→减压浓缩→襄麦冬甾体皂苷→hplc分析。

其中，发酵原料为马铃薯液体培养基(pdb)，发酵方式为液体摇瓶培养；菌种活化采用平板固体培养基，培养基为pda；种子培养为马铃薯液体培养基（pdb）；发酵培养基为马铃薯液体培养基（pdb）。培养时间：菌种平板培养活化72小时，种子液摇床培养72小时，发酵培养7天。培养温度：平板活化、种子摇床培养和发酵培养均为28℃。摇床转速：种子摇床培养和发酵培养均为180rpm。发酵物提取：发酵完毕，将固液混合物快速超低温冰冻成固态，低温冷冻干燥、粉碎，得发酵粉碎物，75%乙醇浸提，滤液减压浓缩得浸膏，纯水溶解后分别进行乙醚、正丁醇萃取，对最终保留的正丁醇溶液进行减压浓缩，即得发酵提取物，甲醇溶解，与标准品保留时间对照，明确该提取物含襄麦冬甾体皂苷。

本发明的第三方面，采用上述内生真菌经液体发酵制备襄麦冬甾体皂苷的方法。

实施例1

本发明的襄麦冬内生真菌ef026菌株分离所用的襄麦冬活体块根，来自湖北省襄阳市欧庙镇襄麦冬的原产地——襄麦冬gap基地。

本发明的襄麦冬内生真菌按以下步骤分离获得：

(1)使用大量自来水充分清洗块根表面泥土，然后装入干净的烧杯中，加入去离子水，置于超声波清洗器中反复清洗，直至清洗后的水变得极为清澈。

(2)用无菌滤纸蘸干块根表面的水分后，再按下述步骤处理：先用75%(v/v)乙醇浸泡块根2min，用无菌水漂洗3次；再用有效氯含量4-6%的次氯酸钠溶液浸泡2min，后用大量无菌水连续漂洗4次，再用无菌滤纸蘸干水分。

(3)取上述表面消过毒的块根样品，无菌条件下剪去块根两头褐变部分，剩余部分用解剖刀片切割成0.5cm×0.5cm组织小片（横向切片、纵向切片），尽可能切割薄一些以便其能与培养基表面充分接触，有利于真菌从培养基中吸收养分，置于pda培养基(含氨卞青霉素，终浓度为50ug/ml)上，用镊子均匀的在组织小片上轻轻压一压，使其紧紧贴服于平板上，每皿植入2片，并设五个重复，最后用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养。

(4)每天观察样品真菌生长的情况，5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的pda培养基上纯化培养，最终得到本发明的内生真菌ef026。其分类命名为黑曲霉菌aspergillusniger，保藏编号为cctccno:m2016753。

实施例2

利用上述襄麦冬内生真菌制备襄麦冬甾体皂苷的步骤：

(1)取本发明的内生真菌ef026菌株菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的pda培养基试管，于28℃活化培养72小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；

(3)将配制好的液体发酵培养基分别装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10%的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；

(4)发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物，研磨粉碎；

(5)将发酵粉碎物转入锥形瓶中，加入100ml75%乙醇60℃水浴1.5小时后，过滤，得滤液；同时，滤渣再加入100ml的75%乙醇，继续水浴1.5小时后再次过滤，合并2次滤液；

(6)对滤液采用减压浓缩方法，去除乙醇，得到浸膏，加入100ml纯水溶解；

(7)将上述浸膏水溶液转入分液漏斗中，加入40ml乙醚进行充分萃取，去除乙醚层（含油脂、色素等），保留水层；

(8)将水层溶解物转至新的分液漏斗中，加入100ml水饱和正丁醇进行充分萃取，去除水层（含糖类等），保留正丁醇层，减压浓缩去除正丁醇后，得浸膏，加入甲醇复溶得襄麦冬甾体皂苷。

如图2所示，hplc色谱条件如下：色谱仪岛津lc-20高效液相色谱仪（检测器：spd-m20a，柱温箱：cto-20a并配真空脱气机dgu-20a3，色谱柱inertsustainc18)；利用46%乙腈进行等度洗脱，流速1ml/min；光谱数据采集通道：ch1(210nm)；进样量10μl；记录20min数据；信号强度单位为mau。

经以上hplc分析，表明本发明的内生黑曲霉菌ef026菌种液体发酵能够产生襄麦冬甾体皂苷。

本发明所述的襄麦冬内生黑曲霉菌18srrna基因序列如下：

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