本发明属于生物检测
技术领域：
，具体涉及一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法。
背景技术：
：nasidze等通过对全球12个国家和地区的120例健康人群唾液样本进行分析，发现204个细菌基因属，其中39个是以前从没有被描述过的口腔菌属，64个为未知种属。该研究同时发现，口腔细菌组具有个体特异性，但多样性几乎不受地理结构的影响。另有研究采集了特定牙位的龈上菌斑和龈下菌斑以及唾液等26种样本并将其混合，鉴定出9个门的247种细菌，这些细菌在种和株水平上存在明显的个体差异，与肠道细菌在属的水平上存在显著的差异。有研究者将核心微生物按丰度高低依次排列为：链球菌属(25％)、普雷沃菌属(16％)、嗜血杆菌属(12％)、罗思菌属(7％)、韦荣球菌属(6％)、奈瑟菌属(6％)、梭杆菌属(6％)和卟啉菌属(4％)。研究者认为当口腔内环境发生变化时，原有的口腔微生态平衡受到破坏形成新的生态环境或滞留区，对口腔内定居微生物会产生影响，口腔微生物的种类、数量、微生物与微生物之间、微生物与宿主之间的相互关系均发生变化，这些变化都可能会导致基牙产生龋病和牙周病变。因此口腔相关微生物的变化是口腔微环境的重要指标之一。口含型无烟气烟草制品是一种湿润的烟草粉末制品，起源于19世纪瑞典。瑞典口含烟产品呈现细的颗粒状，含水量通常在40％以上，含水量低于40％的半干制品也有售。产品放在上唇与牙龈之间，使用时不需要唾出唾液，有散装和袋装产品。在产品使用的过程中，产品对人口腔健康的影响是一个重要考察指标。目前的烟草制品仅针对产品本身进行一些物理化学指标的检测，而对人口腔中的微生物影响研究较少，尤其是针对口腔中唾液总细菌的研究未曾涉及。因此如何克服现有技术的不足是目前生物检测
技术领域：
亟需解决的问题。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，该方法首先首先采集志愿者的唾液，并针对口含型产品的使用特点，模拟口含型烟草制品的使用过程，并对唾液总细菌含量进行荧光定量pcr分析，从而考察在使用口含型烟草制品前后唾液总细菌含量的变化，为口含型烟草制品的口腔健康提供参考。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，包括如下步骤：步骤(1)，采集健康志愿者唾液；步骤(2)，采用步骤(1)采集到的唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；步骤(3)，将步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的采集到的唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的唾液总细菌dna，同时提取多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna；步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna作为模板进行荧光定量pcr分析，之后绘制荧光定量pcr标准曲线；同时，分别以各时间点的培养液中唾液总细菌dna作为模版进行荧光定量pcr分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量；其中，荧光定量pcr反应所使用的上游引物为5’-cgctagtaatcgtggatcagaatg-3’；下游引物为5’-tgtgacgggcggtgtgta-3’；探针为fam-cacggtgaatacgttcccgggc-tamra。进一步，优选的是，步骤(2)的具体方法为：向口含烟烟草制品0.8-1.2g中注入步骤(1)采集的唾液于37℃下恒温震荡进行提取，提取多次，每次提取所用唾液10ml，每次提取时间为5min，分别收集提取液。进一步，优选的是，所述的震荡速度为150-300rpm；提取次数为3次。进一步，优选的是，步骤(3)的具体方法为：(3.1)共培养：取步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)采集到的唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；(3.2)培养液中的唾液总细菌dna的提取：取出步骤(3.1)的培养后的培养液在4℃离心，去上清液，再加入微生物pcr裂解液，混合均匀后，置于75-85℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的唾液总细菌dna；所述的微生物pcr裂解液的加入体积为培养液体积的5％；(3.3)多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna的提取：取不少于5种口腔细菌标准菌株的混合物，混合物中每种口腔细菌标准菌株浓度均为108cfu/ml，离后，弃上清，加入体积是混合物体积5％的微生物pcr裂解液，在75-85℃下热变性15min，离心，取上层清液，即得到多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna；所述的微生物pcr裂解液为lysisbufferformicroorganismtodirectpcr。进一步，优选的是，口腔细菌标准菌株的混合物中包括变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌、放线菌中的至少一种。进一步，优选的是，(3.2)中培养液的离心的转速为11000-12000r/min，时间为10min；热变性后离心的转速为800-1000r/min，时间为1min。进一步，优选的是，(3.3)中，混合物的离心的转速为11000-12000r/min，时间为5min；热变性后离心的转速为800-1000r/min，时间为10s。进一步，优选的是，在进行荧光定量pcr分析前需要对多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna、各时间点培养液中唾液总细菌dna的纯度判定，判定方法是：将待测样品的dna分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.7～1.9时，表明纯度合格，能进行荧光定量pcr分析，反之，则表明纯度不合格，不能进行荧光定量pcr分析。进一步，优选的是，步骤(4)的具体方法为：向多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna中加入体积是变形链球菌的标准菌株原始dna体积9倍的水，并充分混匀，再依次做10倍浓度梯度稀释，共稀释6次，作为标准曲线模板；取各培养液中的唾液总细菌dna与无菌水按1:8体积比例稀释后作为测试样品模板；采用灭菌双蒸水作为空白对照模板；荧光定量pcr反应体系：荧光定量pcr试剂盒中的mastermix(2x)kit10μl，共20μl；荧光定量pcr反应条件为：预变性95℃下5min，变性95℃下15s，退火/延伸60℃下1min，进行45个循环；之后绘制唾液总细菌荧光定量pcr标准曲线，并根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量。进一步，优选的是，荧光定量pcr分析检测时，每个样本检测均重复三次，取其平均值进行计算。本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明提供了一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，为口含型烟草制品对口腔健康的影响提供参考。本发明采用了荧光定量pcr方法对唾液总细菌进行分析，可实时定量跟踪唾液中微生物含量的变化，保证了试验的准确性及高效性。同时设计了3个动态唾液采集点及咀嚼后3个共培养时间段，动态唾液采集点以模拟人在使用口含型烟草制品时的动态过程，共培养时间段以模拟人在咀嚼后的口腔静态过程，使检测更为全面精确。本发明可模拟人使用口含型烟草制品过程中口腔中唾液总细菌发生的变化，对于了解口含型烟草制品对口腔健康的影响有一定的指导意义，可根据检测结果提供抑制有害细菌的产品，起到健康保护的作用。附图说明图1是实时荧光定量pcr检测唾液总细菌标准曲线图；具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本发明实施例所用的变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌、放线菌和血链球菌的标准菌株购自广东省微生物菌种保藏中心；本发明实施例中口含型烟草制品为snusgeneralwhiteminiportion，swedish。本发明空白对照模板采用灭菌双蒸水是为了校正标准曲线的基线值。lysisbufferformicroorganismtodirectpcr购自宝生物工程(大连)有限公司，说明书参见网址http://www.docin.com/p-317504172.html。本发明所采用的荧光定量pcr试剂盒购自kapaprobefastqpcr。本发明配制人工唾液按本
技术领域：
的常规方法配制即可。实施例1一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，包括如下步骤：步骤(1)，采集健康志愿者唾液；步骤(2)，采用步骤(1)采集到的唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；具体方法为：向口含烟烟草制品0.8g中注入步骤(1)采集的唾液于37℃下恒温震荡进行提取，震荡速度为150rpm，提取3次，每次提取所用唾液10ml，每次提取时间为5min，分别收集提取液；步骤(3)，将步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的采集到的唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的唾液总细菌dna，同时提取多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna；具体方法为：(3.1)共培养：取步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)采集到的唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；(3.2)培养液中的唾液总细菌dna的提取：取出步骤(3.1)的培养后的培养液在4℃离心，去上清液，再加入微生物pcr裂解液，混合均匀后，置于75℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的唾液总细菌dna；所述的微生物pcr裂解液的加入体积为培养液体积的5％；(3.3)多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna的提取：取不少于5种口腔细菌标准菌株的混合物，混合物中每种口腔细菌标准菌株浓度均为108cfu/ml，离后，弃上清，加入体积是混合物体积5％的微生物pcr裂解液，在75℃下热变性15min，离心，取上层清液，即得到多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna；所述的微生物pcr裂解液为lysisbufferformicroorganismtodirectpcr。步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna作为模板进行荧光定量pcr分析，之后绘制荧光定量pcr标准曲线；同时，分别以各时间点的培养液中唾液总细菌dna作为模版进行荧光定量pcr分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量；其中，荧光定量pcr反应所使用的上游引物为5’-cgctagtaatcgtggatcagaatg-3’；下游引物为5’-tgtgacgggcggtgtgta-3’；探针为fam-cacggtgaatacgttcccgggc-tamra。在进行荧光定量pcr分析前需要对多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna、各时间点培养液中唾液总细菌dna的纯度判定，判定方法是：将待测样品的dna分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.7～1.9时，表明纯度合格，能进行荧光定量pcr分析，反之，则表明纯度不合格，不能进行荧光定量pcr分析。具体方法为：向多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna中加入体积是变形链球菌的标准菌株原始dna体积9倍的水，并充分混匀，再依次做10倍浓度梯度稀释，共稀释6次，作为标准曲线模板；取各培养液中的唾液总细菌dna与无菌水按1:8体积比例稀释后作为测试样品模板；采用灭菌双蒸水作为空白对照模板；荧光定量pcr反应体系：荧光定量pcr试剂盒中的mastermix(2x)kit10μl，共20μl；荧光定量pcr反应条件为：预变性95℃下5min，变性95℃下15s，退火/延伸60℃下1min，进行45个循环；之后绘制唾液总细菌荧光定量pcr标准曲线，并根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量。其中，(3.2)中培养液的离心的转速为11000r/min，时间为10min；热变性后离心的转速为800r/min，时间为1min。(3.3)中，混合物的离心的转速为11000r/min，时间为5min；热变性后离心的转速为800r/min，时间为10s。口腔细菌标准菌株的混合物中包括变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌，其余三种不限制。实施例2一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，包括如下步骤：步骤(1)，采集健康志愿者唾液；步骤(2)，采用步骤(1)采集到的唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；具体方法为：向口含烟烟草制品.2g中注入步骤(1)采集的唾液于37℃下恒温震荡进行提取，震荡速度为300rpm，提取2次，每次提取所用唾液10ml，每次提取时间为5min，分别收集提取液；步骤(3)，将步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的采集到的唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的唾液总细菌dna，同时提取多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna；具体方法为：(3.1)共培养：取步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)采集到的唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；(3.2)培养液中的唾液总细菌dna的提取：取出步骤(3.1)的培养后的培养液在4℃离心，去上清液，再加入微生物pcr裂解液，混合均匀后，置于85℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的唾液总细菌dna；所述的微生物pcr裂解液的加入体积为培养液体积的5％；(3.3)多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna的提取：取不少于5种口腔细菌标准菌株的混合物，混合物中每种口腔细菌标准菌株浓度均为108cfu/ml，离后，弃上清，加入体积是混合物体积5％的微生物pcr裂解液，在85℃下热变性15min，离心，取上层清液，即得到多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna；所述的微生物pcr裂解液为lysisbufferformicroorganismtodirectpcr。步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna作为模板进行荧光定量pcr分析，之后绘制荧光定量pcr标准曲线；同时，分别以各时间点的培养液中唾液总细菌dna作为模版进行荧光定量pcr分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量；其中，荧光定量pcr反应所使用的上游引物为5’-cgctagtaatcgtggatcagaatg-3’；下游引物为5’-tgtgacgggcggtgtgta-3’；探针为fam-cacggtgaatacgttcccgggc-tamra。在进行荧光定量pcr分析前需要对多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna、各时间点培养液中唾液总细菌dna的纯度判定，判定方法是：将待测样品的dna分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.7～1.9时，表明纯度合格，能进行荧光定量pcr分析，反之，则表明纯度不合格，不能进行荧光定量pcr分析。具体方法为：向多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna中加入体积是变形链球菌的标准菌株原始dna体积9倍的水，并充分混匀，再依次做10倍浓度梯度稀释，共稀释6次，作为标准曲线模板；取各培养液中的唾液总细菌dna与无菌水按1:8体积比例稀释后作为测试样品模板；采用灭菌双蒸水作为空白对照模板；荧光定量pcr反应体系：荧光定量pcr试剂盒中的mastermix(2x)kit10μl，共20μl；荧光定量pcr反应条件为：预变性95℃下5min，变性95℃下15s，退火/延伸60℃下1min，进行45个循环；之后绘制唾液总细菌荧光定量pcr标准曲线，并根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量。其中，(3.2)中培养液的离心的转速为12000r/min，时间为10min；热变性后离心的转速为1000r/min，时间为1min。(3.3)中，混合物的离心的转速为12000r/min，时间为5min；热变性后离心的转速为1000r/min，时间为10s。口腔细菌标准菌株的混合物中包括金黄色葡萄球菌和放线菌，其余三种不限制。实施例3一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法，包括如下步骤：步骤(1)，采集健康志愿者唾液，编号为1#液体；步骤(2)，采用步骤(1)采集到的唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；具体方法为：向口含烟烟草制品1g中注入步骤(1)采集的唾液于37℃下恒温震荡进行提取，震荡速度为200rpm，提取3次，每次提取所用唾液10ml，每次提取时间为5min，分别收集提取液，编号为2#、3#、4#液体；步骤(3)，将步骤(2)收集到的2#、3#、4#液体与步骤(1)的采集到的1#液体一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的唾液总细菌dna，同时提取多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna；具体方法为：(3.1)共培养：取步骤(2)收集到的2#、3#、4#液体与步骤(1)采集到的1#液体，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；(3.2)培养液中的唾液总细菌dna的提取：取出步骤(3.1)的培养后的培养液1ml置于无菌1.5mlep管中在4℃离心，去上清液，再加入50μl微生物pcr裂解液，混合均匀后，置于80℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的唾液总细菌dna；(3.3)多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna的提取：取不少于5种口腔细菌标准菌株的混合物1ml置于无菌1.5mlep管中，混合物中每种口腔细菌标准菌株浓度均为108cfu/ml，离后，弃上清，加入50μl微生物pcr裂解液，在80℃下热变性15min，离心，取上层清液，即得到多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna；所述的微生物pcr裂解液为lysisbufferformicroorganismtodirectpcr。步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna作为模板进行荧光定量pcr分析，之后绘制荧光定量pcr标准曲线；同时，分别以各时间点的培养液中唾液总细菌dna作为模版进行荧光定量pcr分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量；其中，荧光定量pcr反应所使用的上游引物为5’-cgctagtaatcgtggatcagaatg-3’；下游引物为5’-tgtgacgggcggtgtgta-3’；探针为fam-cacggtgaatacgttcccgggc-tamra。在进行荧光定量pcr分析前需要对多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna、各时间点培养液中唾液总细菌dna的纯度判定，判定方法是：将待测样品的dna分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值(opticaldensity，od)；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.7～1.9时，表明纯度合格，能进行荧光定量pcr分析，反之，则表明纯度不合格，不能进行荧光定量pcr分析。具体方法为：取多种口腔细菌标准菌株混合物的原始dna5μl加入45μl水，并充分混匀，再依次做10倍浓度梯度稀释，共稀释6次，作为标准曲线模板；取各培养液中的唾液总细菌dna与无菌水按1:8体积比例稀释后作为测试样品模板；采用灭菌双蒸水作为空白对照模板；荧光定量pcr反应体系：荧光定量pcr试剂盒中的mastermix(2x)kit10μl，共20μl；荧光定量pcr反应条件为：预变性95℃下5min，变性95℃下15s，退火/延伸60℃下1min，进行45个循环；之后绘制唾液总细菌荧光定量pcr标准曲线，并根据标准曲线计算各时间点培养液中唾液总细菌含量。其中，(3.2)中培养液的离心的转速为11500r/min，时间为10min；热变性后离心的转速为900r/min，时间为1min。(3.3)中，混合物的离心的转速为11700r/min，时间为5min；热变性后离心的转速为900r/min，时间为10s。本实施例中口腔细菌标准菌株的混合物中为变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌、放线菌和血链球菌。结果如图1和表1所示，表1是各提取液中唾液总细菌的检测结果。其中，标准曲线为y＝-4.030log(x)+42.74，r2＝0.9981；之后将各时间点培养液的ct值代入到标准曲线中，求得对应的唾液总细菌含量。表1注：单位为cfu/ml，m±sd。通过表1，使用口含型烟草制品后的唾液总细菌含量变化大不大，但生长速度有所降低，其中2#液体降低最为显著，这可能是由于口含型烟草制品提取物具有抑制唾液总细菌生长的作用。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表如表2所示。表2引物及探针序列5’-3’forwardprimer5’-cgctagtaatcgtggatcagaatg-3’(seqidno.1)reverseprimer5’-tgtgacgggcggtgtgta-3’(seqidno.2)探针fam-cacggtgaatacgttcccgggc-tamra(seqidno.3)序列表<110>云南中烟工业有限责任公司<120>一种口含型烟草制品对唾液总细菌影响的检测方法<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列()<400>1cgctagtaatcgtggatcagaatg24<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列()<400>2tgtgacgggcggtgtgta18<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列()<400>3cacggtgaatacgttcccgggc22当前第1页12