一株防治辣椒疫病的高效生防菌株及其应用的制作方法

本发明涉及植物病害生物防治领域，特别涉及一株多粘类芽孢杆菌以及该菌在辣椒疫病防治中的应用。

背景技术：

辣椒，茄科辣椒属蔬菜，主要作为调味品食用。辣椒的果实含有辣椒素而有辣味，能增进食欲，辣椒中维生素c的含量位居蔬菜第一位。目前，辣椒已成为我国第二大蔬菜作物，经济效益位居蔬菜作物之首。

辣椒疫病是辣椒生产中最常见的病害，在世界范围内广泛分布，在我国各辣椒产区均有发生。辣椒疫病是典型的土传和水传病害，辣椒疫霉以卵孢子、厚垣孢子或菌丝体的形式在土壤或病残体中度过不良环境。环境适宜时，各种休眠体萌发，形成游动孢子囊，释放游动孢子囊或直接萌发形成菌丝体进行侵染传播。辣椒疫病发病周期短、蔓延迅速。高温高湿、地势低洼积水以及重茬地发病重。发病后，植株3-5天开始萎蔫，条件适宜时7-10天后整株枯死。一般发病率为10%-20%，严重发生时达50%以上，甚至全田枯死而绝收。

化学防治是目前辣椒疫病发生后防治的最主要方式。辣椒疫病的防控主要通过轮作换茬、种植前土壤处理、抗病育种、栽培避病和化学防治等措施进行。辣椒疫霉的卵孢子和厚垣孢子在土壤中能存活多年，必须多年轮作才有明显效果。辣椒栽培多在保护地进行，即使露天栽培，由于栽培习惯等原因，适宜种植的土地面积有限，多年轮作难以大面积推广。由于商品性和栽培习惯等原因，目前生产中辣椒品种多为辣椒疫病敏感或中抗品种，辣椒疫病的发生比较普遍。因此，目前控制辣椒疫病离不开要药剂防控，而防控辣椒疫病的药剂多为化学药剂。

化学防治具有自身缺陷。化学防治由于见效快、杀菌谱广、生产成本低等优点，在植物病害防治中起到了重要作用。目前，防治辣椒疫病的化学药剂相对较少，主要有甲霜灵、精甲霜灵、氟吗啉、烯酰吗啉、双炔酰菌胺、氟吡菌胺、嘧菌酯、霜脲氰等。然而，化学农药的大量使用不但造成了残留污染，影响食品安全，同时由于防治辣椒疫病的大部分化学药剂的作用位点单一，极易产生抗药性，连续使用将导致辣椒疫霉的抗药性急剧上升，不但防治成本高，而且防治效果越来越差。因此，寻找有效替代化学药剂防治辣椒疫病的方法对保障辣椒高产稳产至关重要。

生物防治是目前病害防控研究的热点之一。生物防治是利用生物活体或其代谢产物来控制有害生物的发生和为害。由于其利用的是自然界中已经存在的生物或其代谢产物，环境友好，对人畜安全，有害生物不易产生抗性。生物防治与化学防治相比具有天然的优势。但是，由于生产成本高、货架期短、使用技术难度大等原因，生产应用相对较少。近年来，通过筛选高效生防菌株、优化生产工艺等措施，有效促进了生物农药的应用。美国的枯草芽孢杆菌gb03、mb1600、fzb24等生防菌株获得商品化生产应用许可；南京农业大学开发的麦丰宁（枯草芽孢杆菌b3）对小麦纹枯病的田间防效达到50-80%；江苏农科院植保所开发登记的枯草芽孢杆菌b916，对水稻纹枯病的田间防效持续10年稳定在50-80%。

芽孢杆菌是植物病害生物防治研究的重点之一。芽孢杆菌是一类革兰氏染色阳性、能产生内生芽孢的细菌。由于其产生的芽孢具有耐热、抗干旱等不良环境的能力，有利用生防制剂的生产、剂型加工、存放以及在环境和作物表面的存活与定殖，且生长速度快、营养需求间的、对人畜无害、不污染环境，利用芽孢杆菌进行生物防治具有天然的优势。

应用芽孢杆菌防治植物病害是目前生物防治研究的重点之一。徐刘平等从根围促生细菌中筛选出b.cereusnj02，辣椒苗移栽后60d后处理防效为75.81%；专利公开号cn105907683a公开了一株解淀粉芽孢杆菌cd5bc，其盆栽试验结果表明：提前在辣椒根际注入发酵液，生防菌接种2d后，再接种辣椒疫病病原菌，其防治效果达到82.36%，高于对照药剂50%烯酰吗啉wg的防治效果；专利公开号cn104357351a公开了一株枯草芽孢杆菌wdcjxq2266，温室盆栽试验表明：移栽前浸种处理30min，移栽时菌剂灌根，三周后枯草芽孢杆菌wdcjxq2266对辣椒疫病的防效为69.06%。

虽然已经筛选出了一批对辣椒疫霉菌丝有抑制作用，对辣椒疫病有生防效果的生防菌株，但是大部分生防菌株则停留在实验室阶段，难以应用于生产实践。即使部分对辣椒疫病防控效果达到70%以上的生防效果，多为提前使用生防制剂，而实际病害防治中大部分情况是先在田间出现了辣椒疫病再去进行防治。由于病害潜育期的存在，在发生辣椒疫病的周边的辣椒，部分已经被辣椒疫霉侵染，此时使用上述生防菌剂的防治效果不一定能达到在侵染前使用的效果。同时，实际栽培中的环境因素多变，更影响着生防制剂的田间生防效果。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有辣椒疫病防控技术的缺点与不足，提供一种防治辣椒疫病的高效生防细菌菌株多粘类芽孢杆菌wt3。

本发明另一目的在于提供上述生防菌多粘类芽孢杆菌wt3的在植物病害生物防治上的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：从大别山区高山地区连续种植蔬菜30年以上的菜园地中采集土样，分离土样中的芽孢杆菌，通过对峙培养法筛选出一株高效防治辣椒疫病的生防菌株，经过形态学和分子生物学分析，鉴定为多粘类芽孢杆菌；该菌株多粘类芽孢杆菌wt3对辣椒疫霉菌的菌丝生长具有显著的抑制效果，抑菌带宽度达20mm，盆栽试验表明，该菌株的发酵液灌根能有效控制辣椒疫病的发生，防治效果达到91.3%，田间试验防治效果达到85.0%。本发明提供的生防菌株具有对植物非致病性，能高效防治辣椒疫病，具有良好的生防潜力，为辣椒疫病的生物防治提供了新的资源。

本发明的具体实施方式

以下为本发明的具体实施方式，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

菌株的鉴定

菌体、菌落形态观察及染色反应。

将多粘类芽孢杆菌wt3接种于乳糖酵母粉液体培养基中，28-35℃、150-200转/min培养24h，挑取菌液进行菌体形态观察、革兰氏染色和芽孢染色；将上述培养液用无菌水进行梯度稀释，取稀释倍数为10⁵、10⁶的稀释液100µl于ca培养基（胡萝卜培养基）平板上，涂布均匀，倒置于28-35℃下恒温培养24h观察菌落形态。结果表明：该菌菌体为杆状，2.48mm×1.2mm；革兰氏染色阳性，产芽孢；菌落呈圆形，干燥，半透明，菌落中心后期有乳黄色色素沉积。

dna转旋酶β亚基核苷酸序列分析。

借助引物up-1(gaagtcatcatgaccgttctgcaygcnggnggnaarttyga)和up-2r(agcagggtacggatgtgcgagccrtcnacrtcngcrtcngtcat)，扩增菌株wt3的dna转旋酶β亚基（gyrb）基因序列，得到1168个碱基序列。序列比对结果表明，该菌株与多粘类芽孢杆菌sqr-21等多个多粘类芽孢杆菌的同源性均大于99%，而与非多粘类芽孢杆菌菌株的最大相似度只有87%。因此，将该菌鉴定为多粘类芽孢杆菌。

多粘类芽孢杆菌wt3的dna转旋酶β亚基的碱基序列为：aggcggagggtacaaggtgtctggtggtctgcacggggttggtgtatccgtggtgaacgcgctctccagcaaaatgattgttcatgttaaacgggatggacatgtatatgagcaggaataccatcgtggtgccccacagtatgatgtcagagtcatcggtgacaccgaagagacaggtacccagacaaccttctatccggacgaacaaatctttaccgaaacgaccgtatatgactatgatacgctgcagacgcggattcgtgagctggctttcctgaacaaaggcattgcaattagcttgaccgatgaacggacaggcgccagcgatacattccactatgagggtggaatcagtgaatatgtgcagtttctgaatcaaaaaagagaagccctgcatgaacagccgatttatgtcgaaggctctcgtgacatgattcaagtcgaagttgcattgcaatataacgacagctataccgagaatatttattctttcgccaacaatatcaatactcatgagggcggaactcatgaatcaggtttcaagagtgcattaacccggattattaacgattatgcacgcaaaaatggcttgattaaggacaacaatgccaatttgaccggtgacgatgtacgcgaaggtttgacagcgattatctccgtcaaaattcctgaaccacagtttgagggtcagactaaaacaaagcttggcaacagtgaagttcgaggaattgtcgagtccctgttcgcagagaaacttcaggaatttctggaggagaacccgtccgtctcccgccgtgtagttgataaatcgttacaagcagctcgtgcccgggaagcagcacgcaaagcgcgtgaacttacacgtcgcaaaagtgcgctggaaatcagttcgctcccaggtaagctggcggattgctcctctaaggatgcttcgatcagtgaactgtacatcgtcgaaggtgactcagcagggggatcggccaagcaggggcgtgatcgtcactttcaagcgattttgccaatccgcggtaagatcctgaatgtggaaaaggcacgcttggaccgtattttgtccagtgatgaaatacggtcaatggtaacagcaatgggtacagggattggagatgattttgacatcagcaaagcccgttaccacaaggttattatc。

实施例2

多粘类芽孢杆菌wt3对辣椒疫霉菌丝生长的抑制作用。

采用平板对峙法，测试多粘类芽孢杆菌wt3对辣椒疫霉的抑制作用。具体方法如下：

将辣椒疫霉菌株pc-fd22接种于ca培养基（胡萝卜琼脂培养基）平板中央，倒置于26℃，黑暗条件下恒温培养3-5天备用；

将活化后的多粘类芽孢杆菌wt3接种于乳糖酵母粉液体培养基中，28-35℃、150-200转/min培养24h备用；

在上述pc-fd22菌落边缘打直径为5mm的菌碟，接种于ca培养基平板中央，分别用微量移液器吸取少许多粘类芽孢杆菌wt3，点接于菌碟四周距离菌碟边缘25mm处，置于26℃，黑暗条件下恒温培养5天，以只接种辣椒疫霉pc-fd22的做对照。

试验结果表明：多粘类芽孢杆菌wt3与辣椒疫霉pc-fd22的抑菌带宽度为20mm。

实施例3

盆栽防治辣椒疫病

采用盆栽试验，评价多粘类芽孢杆菌wt3对辣椒疫病的防治作用效果。

辣椒苗准备：在温室内进行辣椒育苗，直至辣椒苗5-6片真叶时，移栽至盆口直径130mm的营养钵中，每钵栽5苗。试验前一天浇透水备用。

辣椒疫霉游动孢子准备：接种辣椒疫霉pc-fd22在ca培养基平板中央，于26℃，黑暗条件下恒温培养3-5天，再光照48小时刺激游动孢子囊产生，备用；试验前1小时，在产生产生大量游动孢子囊的ca平板中加入约20ml无菌水，置于5-10℃下低温处理15分钟，再放到25-26℃下30分钟刺激游动孢子释放；将上述游动孢子悬浮液稀释至5×10³/ml备用；

生防菌制备：将活化后的多粘类芽孢杆菌wt3接种于乳糖酵母粉液体培养基中，28-35℃、150-200转/min培养24h备用；

生防菌灌根：按每株辣椒苗上述发酵液100倍液5毫升灌根，以72%甲霜灵可湿性粉剂600倍液和清水做对照，用液（水）量与生防菌的处理相同，每处理5盆，重复3次；

辣椒疫霉接种：生防菌灌根30分钟后，将上述辣椒疫霉游动孢子悬浮液灌根接种，避免直接与辣椒茎基部接触，每株辣椒苗接种5毫升；

结果调查：将上述辣椒苗置于25-30℃下保湿24小时，15天后调查发病株数和发病等级，计算病情指数和防治效果。

结果表明：多粘类芽孢杆菌wt3的防效达到91.3%，对照药剂甲霜灵为89.3%。

实施例4

防治辣椒疫病田间药效试验

2016年夏季于安徽省池州市石台县八棚村进行田间药效试验，试验田所在地辣椒疫病在露天栽培时为常发性病害，并且发病迅速，危害重。试验于辣椒移栽45d左右，田间初见辣椒疫病时进行，试验前将可见病株全部拔除。将多粘类芽孢杆菌wt3的乳糖酵母粉发酵液稀释100倍，对辣椒茎基部喷淋，每株50ml左右。以72%甲霜灵可湿性粉剂600倍液和清水做对照，用液（水）量与生防菌的处理相同。14d后调查发病株数，计算发病率和防治效果。试验结果表明：多粘类芽孢杆菌wt3处理的辣椒病株率为14.0%，对照药剂和空白对照的病株率分别为12.7%和93.3%；多粘类芽孢杆菌wt3的防效为85.0%，对照药剂的防效为86.4%，两者间差异不显著。