一种基于DNA特异片段的熊本牡蛎（Crassostreasikamea）鉴定方法与流程

本专利属于水生动物种质鉴定领域，涉及到一种基于dna特异性片段的熊本牡蛎物种鉴别的、全新的分子生物学方法，能从广泛分布的牡蛎中，高效、特异性地鉴别出熊本牡蛎。

背景技术：

中国沿海牡蛎资源丰富，种类繁多选择合适的的造礁牡蛎是生态学中的重要命题。牡蛎(ostreidae)为世界性广分布种类，俗称蚝，别名蛎黄、蚝白、海蛎子。它肉味鲜美，质地柔软细嫩，营养丰富，欧洲人称牡蛎是“海洋的玛娜”，“海洋的牛奶”，古罗马人把它誉为“海上美味圣鱼”。日本人则称其为“根之源”、“海洋之超米”。牡蛎是世界上第一大养殖贝类，共有100多种，在我国沿海常见的有5种，即:熊本牡蛎(crassostreasikamea)、近江牡蛎(c.ariakensis)、长牡蛎(c.gigas)、香港巨牡蛎(c.hongkongensis)、葡萄牙牡蛎(c.angulata)。牡蛎礁(oysterreef)是由大量牡蛎聚集生长于硬底物表面所形成的一种生物礁系统，它广泛分布于温带河口和滨海区。除为人类提供大量鲜活牡蛎以供食用外，牡蛎礁还具有十分重要的生态功能与环境服务价值。牡蛎是牡蛎礁生态系统的“基石物种(keystonespecies)”。据报道，在中国沿海分布的所有牡蛎中，有造礁能力的物种有近江牡蛎、长牡蛎、和熊本牡蛎；而葡萄牙牡蛎和香港牡蛎目前尚未报道。

准确鉴别牡蛎种类(包括成体和幼体)，对于深入分析牡蛎的空间生态位及造礁能力，检验牡蛎对附着底物空间的竞争利用及定殖能力，阐明牡蛎礁生境复杂性与生态功能之间的相关性，都是至关重要的，可以为牡蛎礁恢复工程中目标物种的筛选提供科学指导。

牡蛎种类从形态上不易区分。牡蛎礁恢复已成为养护近岸渔业资源、修复近岸渔业水域生态系统的重要手段之一。牡蛎(ostreidae)为世界性广分布种类,由于牡蛎是营固着生活的软体动物，其外部形态常随生活环境的不同而发生极大的变化，大多数种类单纯依靠贝壳的外部形态是很难区分的。

牡蛎幼体难以鉴定。牡蛎幼体由于相似度大，鉴别更是困难重重；而传统的形态学分类指标，大多是经验性、专家依赖型的，对于普通人员，特别是基层工作者，使用起来不够方便和实用。因此，在日常的管理和研究中，迫切需要简明、快速、稳定的鉴别方法。dna是遗传信息的载体，非常稳定，不易受环境的影响，是常用的种质鉴别标记。

中国专利cn105734133a公开了一种基于线粒体特异片段的近江牡蛎和熊本牡蛎的鉴定方法。包括：提取近江牡蛎和熊本牡蛎的基因组dna；利用上游引物和下游引物对基因组dna进行pcr扩增，得到目的片段的pcr产物；其中，上游引物为5’-gttccgttccatccttat-3’，下游引物为5’-agaccacttatccctcca-3’；将pcr产物直接进行凝胶电泳，根据得到的pcr产物条带并结合测序的结果，来判断物种类别。该发明申请用到的dna的目的片段为1506±2bp，不能够快速、简便的区分出熊本牡蛎和其他4种牡蛎，最后还要进行结合测序来判断结果。

技术实现要素：

为了解决牡蛎成体和幼体鉴别中，传统的形态学指标难以鉴定的问题，本发明基于牡蛎基因组，开发出dna特异片段，利用pcr方法扩增出该特异片段，是一种操作简便、成本低、耗时短、准确率高的熊本牡蛎的分子鉴别方法。

本发明提供的基于dna特异片段的熊本牡蛎鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取牡蛎基因组dna；

(2)用引物对步骤(1)中的牡蛎基因组dna进行pcr扩增，得到目的片段的pcr产物；其中，上游引物为cs-f2：

5`-cgaagaggggcatgataaatgagg-3`，下游引物为cs-r2：

5`-atatgaacttctccaacctcccc-3`；

(3)将步骤(2)中的pcr产物进行凝胶电泳，在100bp出现信号带的即为熊本牡蛎，其他牡蛎没有信号条带。

其中，步骤(1)中提取牡蛎基因组dna的方法为用海洋动物组织基因组dna提取试剂盒提取。

其中，步骤(2)中pcr产物条带中熊本牡蛎的目的片段为114bp。

其中，步骤(2)中pcr扩增的条件为先95℃预变性3min,然后是35个循环，每个循环包括95℃变性15sec，55℃复性15sec，72℃延伸15sec，最后是72℃延伸3min。

其中，步骤(3)中凝胶电泳的条件为3％的琼脂糖凝胶。

其中，步骤(3)中凝胶电泳的条件为：电压200v，时间28min，缓冲液为tbe。

采用本发明能够经济、快速、简便的进行熊本牡蛎的鉴别，测序验证的结果显示鉴别的准确率为100％；这种鉴定方法将在水产养殖、资源调查、环境保护、生态修复中发挥重要作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)方法简单易行，不需要进行测序工作；

(2)根据琼脂糖凝胶电泳可直观地进行检测；

(3)本方法准确可行，应用广泛，可对牡蛎成体甚至对水体环境中牡蛎幼体进行检测。

附图说明

图1为实施例1中通过人工设计引物得到上游引物及其用mega7比对后在线粒体基因组的位置；

图2为实施例1中通过人工设计引物得到下游引物及其用mega7比对后在线粒体基因组的位置；

图3为实施例1中pcr产物电泳结果图；其中，左起第1泳道为marker、2-5泳道为熊本牡蛎、6-9泳道为近江牡蛎10-13泳道为葡萄牙牡蛎、14-17泳道为长牡蛎、18-21泳道为香港牡蛎、22-25泳道为阴性对照。

图4为pcr产物测序结果。从上至下各序列依次为：1-17为熊本牡蛎；20为熊本基因组。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例

1、实验材料

在我国主要海区(浙江宁波；上海芦潮港；江苏海门；山东渤海：威海、大连湾；福建宁德；广东阳江)的潮间带采集5种牡蛎进行试验，包括熊本牡蛎、近江牡蛎、葡萄牙牡蛎、长牡蛎、香港牡蛎。采集样本肌肉组织，-20℃保存备用。

2、基因组dna提取

采用海洋动物组织基因组dna提取试剂盒提取牡蛎的基因组dna。

3、pcr扩增

以牡蛎基因组dna为模板，根据熊本牡蛎与我国沿海出现的其他牡蛎种的线粒体dna序列，通过比对设计引物(引物序列为：cs-f2：5`-cgaagaggggcatgataaatgagg-3`，下游引物为cs-r2：5`-atatgaacttctccaacctcccc-3`)，进行pcr扩增。引物位置见图1和图2。

其中，用我们设计的上述上下游引物扩增线粒体dna的目的片段pcr反应条件为：先95℃预变性3min,然后是35个循环，每个循环包括95℃变性15sec，55℃复性15sec，72℃延伸15sec，最后是72℃延伸3min。

4、pcr产物电泳

pcr产物在3％的琼脂糖凝胶中电泳，电泳条件为：电压200v，时间28min，缓冲液为tbe。结果显示确定在100bp处有条带的为熊本牡蛎(图3)。熊本牡蛎目的片段长度为114bp，而其他牡蛎种在100bp处均无条带。

5、对pcr产物的测序验证

利用sanger的双脱氧链终止法对pcr产物进行测序，然后用vectornti软件比对，结果显示和此引物的设计位置一致(见图4)。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

序列表

<110>中国水产科学研究院东海水产研究所

<120>一种基于dna特异片段的熊本牡蛎鉴定方法

<141>2017-10-30

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

cgaagaggggcatgataaatgagg24

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

atatgaacttctccaacctcccc23