专利名称：：抗重金属铜的单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及抗重金属铜的单克隆抗体及其制备方法。
背景技术：
：随着科技的进步和工业的发展，人们的生活水平有了很大的提高。但是在工业高速发展的同时，也带来了一系列环境问题。1931-1972年发生于日本富山县神通川流域的痛痛病和1953年发生于日本熊本县水鱼湾渔村的水俣病都是由食物受到重金属污染引发的，这些悲剧事件引发了人们对环境中重金属污染的关注。什么是重金属呢？重金属系指密度4.0以上约60种元素或密度在5.0以上的45种元素。环境污染方面所指的重金属主要是指生物毒性显著的汞、镉、铅、铬以及类金属砷，也包括具有一定毒性的金属，如铜、锌、镍、锡等元素。重金属不能被微生物降解为无害物，它们在水体中富集起来，造成水体污染，最终危害人类身体健康。有些重金属元素，例如铜，是人体和其它生物体必需的元素，但无论必须元素还是有毒元素，人体对它的忍受都要有一定的限度，超过这个限度后便会引起中毒对生命造成危害。随着现代工业的迅猛发展，重金属在工农业生产中的广泛应用，人们在制造⑶P和财富的同时，人为活动引起的环境污染也在加剧。重金属是有毒并对环境有着持久污染的物质，重金属可以在生物体内长期积累不可降解，在环境中可长时间结合在土壤或沉淀物中，随着环境的变化使金属发生移动，大大提高了它们的毒性和可吸收性。因此重金属在环境、农产品中残留检测都是非常重要的。土壤和农产品中的重金属与人类健康密切相关。铜在常量下对作物或人体为营养物质，而过量时就会产生危害(TylerG..Heavy-metalecologyofterrestrialplants,microorganismsandinvertebrates.WaterAirandSoilPollution，1989，47:189-225)。随着工农业生产的快速发展，铜的用途越来越广泛，用量不断增加，在当代人类使用的金属中，按金属用量计，铜(Cu)是仅次于铁、铝之后的第三大用量的重金属，含铜污染物排放越来越多，对土壤等环境的污染也逐渐显现出来。过量的铜在体内特别是肝脏的大量蓄积，会出现肝脏异常、胃肠反应、肾脏病变及溶血，在养殖业配制饲料过程中，铜作为微量元素添加的促长剂，添加时过量，动物吸收不完全，通过粪便排出进入生物链，造成污染。高铜饲料在畜牧生产中使用普遍，过量的铜会引发母畜流产等。铜极难在自然界降解，造成土壤、水源、植被的严重污染(许梓荣，周勃，王敏奇.长期饲喂高铜饲粮对猪生长的影响及其机理讨论.浙江农业学报，2000,12(2):55-60.)。水生生物可以富集铜，通过食物链的富集，最终使大量铜进入人体；农作物可通过根吸收土壤中的铜，其中一部分也可经食物进入人体。重金属铜的污染来源具多样性，作物中积累的重金属铜离子通过食物链的生物放大作用进入人畜体内，威胁着人畜健康。重金属污染是食品、环境、卫生监测的重要内容之一(倪才英，陈英旭，骆永明.土壤-植物系统铜污染与修复的研究进展[J].浙江大学学报，2003，四(3)=237-243.；ValcboD.Zbejazkov.Effectofheavymetalsonpeppermintandcommint.PlantandSoil,1996,178:59-66；郎明林，张玉秀，柴团耀.基因工程改良植物重金属抗性与富集能力的研究进展.生物工程学报,2004，2(K2):157-164；DianeAB，JonesRM,RobertCB,etal.Antibody-basesensorsforheavymetalions.BiosenBioelec,2001,16:799-809.),在重金属铜污染的预防和治理中，重金属铜污染物的监测和识别至关重要。总之，重金属是一种很危险的污染物。污染环境中存在的高浓度重金属，对生物的生理活动能产生多种影响，使一些生物发生病害甚至死亡，最终使生态系统平衡被破坏、生态环境恶化。重金属通过食物链可以在人体中积累，引起多种疾病甚至癌症，而且危害还可以遗传到下一代。因此，痕量重金属的定量分析在食品和环境检测等方面都是非常重要的。对重金属的常规性检测方法已经有很多种，有些也已经是非常成熟的技术，但因为重金属离子存在的范围很广，根据检测精度、方便程度和检测成本，每种技术都有它们的局限性，同时还需合适的场所，因此都不利于在生产中推广应用。建立更快速、更经济的免疫分析法检测铜离子是生产及经济发展的需要。传统的重金属离子检测方法主要有原子吸收光谱法(AtomicAbsorptionSpectroscopy)、紫夕卜分光光度法(Ultra-violetSpectroscopy)、阳极溶$^(AnodicStrippingVoltammeter)>^^1if夕去(Oscillopolarography)禾口各种仪器联用技术，如电感耦合等离子体质谱法(InductivelyCoupledPlasma-MassSpectrometry)、电感耦合等离子体原子发射光谱分析GnductivelyCoupledPlasma-AtomicEmissionSpectrometry)>S1^^^^“J^nItBt^(HydrideGeneration-AtomicAbsorptionSpectrometry)等。传统的重金属检测方法多采用化学仪器检测，如利用AAS、ICP-AES或电化学方法等，检测仪器昂贵，样品要经过湿法消解或微波消解，逐个测定单种重金属浓度，测量精度虽可达到mg/kg或更高，但检测步骤繁琐，检测成本高，需耗时2天左右，不适应实践中快速简便的需要，难以适应环境及市场产品的现场抽查及产品进出口快速通关的要求。重金属的免疫分析方法作为一种新型的检测技术，与传统检测方法相比，具有快速、灵敏和便携等优点(KhosravianiM,PavlovAR,FlowersGC,etal.Detectionofheavymetalsbyimmunoassay!optimizationandvalidationofarapid,portableassayforioniccadmium.EnvironSciTtechnoy,1998,32(1)137-142；BlakeRC,DelehantyJB,KhosravianiM.Allostericbindingpropertiesofamonoclonalantibodyanditsfabfragment.Biochemistry,2003,42(2):497-508.),njM^点检测和补救工作的费用，并且能极大的提高风险评估工作的效率和质量，可用于环境和农产品重金属污染的现场检测，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验(BlakeRC,DelehantyJB,KhosravianiΜ.Allostericbindingpropertiesofamonoclonalantibodyanditsfabfragment.Biochemistry,2003,42(2):497_508.)。
发明内容本发明的一个目的是提供杂交瘤细胞株及其分泌的抗重金属铜的单克隆抗体。本发明所提供的杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株C9D11，其保藏编号为CCTCCN0201087。由杂交瘤细胞株C9D11CCTCCNO:C201087分泌得到的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种抗原。本发明所提供的抗原是按照包括如下步骤的方法制备得到1)将可溶性铜盐溶液与螯合剂溶液混合，进行络合反应，得到铜离子与螯合剂的络合物；2)在步骤1)的基础上，再加入载体蛋白溶液和偶联缓冲液，进行偶联反应，得到载体蛋白与所述络合物的偶联物，即为抗原。上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述可溶性铜盐与所述螯合剂的投料比满足如下条件所述可溶性铜盐中的Cu2+与所述螯合剂的物质的量比为11;上述抗原制备中，所述步骤2、中，所述螯合剂与所述载体蛋白的投料比满足如下条件所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的物质的量的比为51。上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述络合反应在pH值为7.4的条件下进行；上述抗原制备中，所述步骤2)中，所述偶联反应在pH值为9.0的条件下进行。上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述络合反应的温度为25°C，所述络合反应的时间为10分钟；上述抗原制备中，所述步骤2)中，所述偶联反应的温度为25°C，所述偶联反应的时间为12小时。上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述螯合剂的分子式为C22H28N4OltlS·3HC1；上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述可溶性铜盐溶液按照包括如下步骤的方法制备得到将铜片溶于浓度为68%(体积百分含量)的HNO3水溶液中，待铜片完全反应后，得到所述可溶性铜盐溶液；上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述螯合剂溶液按照包括如下步骤的方法制备得到将所述螯合剂加入PH值为9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液中，再调节pH值至9.0，得到所述螯合剂溶液；上述抗原制备中，所述步骤幻中，载体蛋白BSA溶液按照包括如下步骤的方法制备得到将所述载体蛋白BSA溶于pH值为7.4、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液，得到所述载体蛋白溶液；上述抗原制备中，所述步骤幻中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白；上述抗原制备中，所述步骤2)中，所述偶联缓冲液为pH9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液。本发明的另一个目的是提供一种不完全包被原。本发明所提供的不完全包被原，按照包括如下步骤的方法制备得到将螯合剂、载体蛋白和反应缓冲液混合，在PH至9.0、25°C的条件下反应12小时，得到螯合剂与载体蛋白的不完全包被原。上述不完全包被原制备中，所述螯合剂与所述载体蛋白的投料比满足如下条件所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的物质的量的比为51。上述不完全包被原制备中，所述偶联反应在pH值为9.0的条件下进行。上述不完全包被原制备中，所述反应的温度为25°C，所述偶联反应的时间为12小时。上述不完全包被原制备中，所述螯合剂溶液按照包括如下步骤的方法制备得到6将螯合剂加入PH值为9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液中，再调节pH值至9.0，得到所述螯合剂溶液；上述不完全包被原制备中，所述螯合剂的分子式为C22H28N4OltlS·3HC1。上述不完全包被原制备中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白；上述单克隆抗体在检测样品中是否含有铜中的应用也属于本发明的保护范围。上述单克隆抗体在检测样品中铜的含量中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的抗重金属铜的单克隆抗体的效价高。利用本发明的抗体可以用于铜离子残留的免疫学检测。并利用其快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，发展便于现场检测的便携方法，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验。对提高风险评估工作的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。图1为Cu-DTPA-BSA，DTPA-BSA，BSA的紫外扫描图谱；图2为Cu-DTPA-KLH、KLH的紫外扫描图谱；图3为Cu-DTPA-BSA,DTPA-BSA及载体蛋白BSA的SDS-PAGE电泳图图4为Cu-DTPA-KLH，载体蛋白KLH的SDS-PAGE电泳图5为小鼠六免后的差异率比较；图6细胞株C9D11分泌抗体与DTPA结合系数测定结果；图7为杂交瘤细胞株C9D11分泌抗体的亚型；图8为单克隆抗体效价的检测图9为细胞株C9D11分泌抗体特异性鉴定；图10为C9D11分泌抗体的稳定性。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、抗原与不完全包被原的制备一、制备p-Scn-Bn-DTPA购自美国Macrocyclics，货号为B-305。产品名p-SCN-Bn-DTPA英文名2-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaaceticacid别名:S-2-(4-Isothiocyanatobenzyl)-DiethylenetriaminePentaaceticAcid分子式=C22H28N4OltlS·3HC1。pH值为9.73的HEPES缓冲液1.4165gHEPES,去离子水溶解，用IOmol/L的KOH调pH至9.73，定容至50mL，配后过滤除菌，4°C保存。(浓度为1.4165g/50mL)。pH值为7.4的HEPES缓冲液14.165gHEPES,去离子水溶解，调pH至7.4，定容至500mL。(浓度为1.4165g/50mL)。A液llg铜片溶于IOOmL体积百分含量为68%的HN03水溶液中，得到浓度为110mg/mL的Cu(N03)2溶液。B液10.668mgp-SCN-Bn-DTPA，加入0.4mLpH9.73的HEPES缓冲液，终浓度为26.67mg/mL。C液20mgBSA溶于0.4mLpH7.4的HEPES缓冲液，得到浓度为50mg/mL的溶液。Bl液称取IOmgp-SCN-Bn-DTPA溶于0.6mLpH9.73的HEPES缓冲液，得到浓度为16.67mg/mL的溶液Cl液浓度为5.9mg/mL的匙孔血蓝蛋白(KLH)溶液1.695mL。Cl液购自Sigma，货号H^83。中文名匙孔血蓝蛋白(KLH)。产品英文名:HemocyaninfromMegathuracrenulata(keyholelimpet)。1、Cu-DTPA-BSA和Cu-DTPA-KLH的制备Cu-DTPA-BSA的制备(1)取0.4mL的B液加入反应器，再加入9.5μLA液，在ρΗ为7.4、室温(250C)下反应10分钟，得到Cu-DTPA液；(2)再向其中加入1.2mLρΗ9·73的HEPES缓冲液、C液0.4mL,再加ρΗ9·73的HEPES缓冲液将调节ρΗ至9.0，室温(25°C)下搅拌，反应12小时，得到Cu-DTPA-BSA。步骤(1)中，Cu(NO3)2中的Cu2+与p-SCN-Bn-DTPA的物质的量比为11。步骤O)中，P-SCN-Bn-DTPA与BSA中的赖氨酸的物质的量的比为5I0Cu-DTPA-KLH(1)取0.133mL的Bl液加入反应器，再加入A液9.9μL，在ρΗ为7.4、室温(250C)下反应10分钟，得到Cu-DTPA液；(2)再向其中加入0.420mLρΗ9·73的HEPES缓冲液、Cl溶液1.695mL，调节ρΗ至9.0，室温(25°C)下搅拌，反应12小时。步骤(1)中，Cu(NO3)2中的Cu2+与p-SCN-Bn-DTPA的物质的量比为1:1。步骤(2)中，p-SCN-Bn-DTPA与KLH中的赖氨酸的物质的量的比为51。CentriconYM-30超滤离心管预先用0.lmol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)溶液浸泡过夜，然后用PH9.73的HEPES缓冲液充分冲洗。偶联反应后，用CentriconYM-30超滤离心管对蛋白质复合物进行分离纯化，即用CentriconYM-30过滤除去没有参与反应的过量的金属离子Cu2+和螯合剂DTPA及Cu-DTPA，分离纯化时先用pH9.73的HEPES缓冲液洗涤超滤管一次，再用PH7.4的HEPES缓冲液洗涤两次。2、DTPA-BSA的制备DTPA-BSA取0.4mL的B液加入反应器，再向其中加入1.2mLpH9.73的HEPES缓冲液、C液0.4mL,再加pH9.73的HEPES缓冲液将调节ρΗ至9.0,室温(25°C)下搅拌，反应12小时，得到DTPA-BSA。反应中p-SCN-Bn-DTPA与BSA中的赖氨酸的物质的量的比为5I0分离纯化步骤同步骤1。纯化后所得的抗原分装于_20°C保存，长期保存存于-80°C。二、抗原的鉴定1、抗原的浓度测定参照BCA试剂盒步骤，用BCA法构建浓度检测标准曲线。蛋白浓度测定标准曲线的绘制在聚苯乙烯微孔板上，分别将ang/mL的BSA标准蛋白稀释至浓度为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL,0μg/mL。用BCA蛋白定量试剂盒测定570nm的光吸收值。以吸收值减去空白值得到的数值对BSA含量作图，绘出标准曲线。KLH的标准曲线绘制原理同BSA。抗原浓度的测定将分离纯化后的抗原样品适当稀释，用BCA蛋白定量试剂盒测定570nm的光吸收值，通过标准曲线计算样品溶液中抗原浓度。结果表明，利用BCA法检测分离纯化后的的Cu-DTPA-BSA、Cu-DTPA-KLH、DTPA-BSA中蛋白的实际浓度依次为6.3175士0.035mg/mL，6.314士0.024mg/mL29.65士0.03Img/mL(见表1)。表1、BCA法检测抗原中蛋白浓度权利要求1.杂交瘤细胞株C9D11，其保藏编号为CCTCCN0:C201087。2.由杂交瘤细胞株C9D1ICCTCCNO:C201087分泌得到的单克隆抗体。3.—种抗原，按照包括如下步骤的方法制备得到1)将可溶性铜盐溶液与螯合剂溶液混合，进行络合反应，得到铜离子与螯合剂的络合物；2)在步骤1)的基础上，再加入载体蛋白溶液和偶联缓冲液，进行偶联反应，得到载体蛋白与所述络合物的偶联物，即为完全抗原。4.根据权利要求3所述的抗原，其特征在于所述步骤1)中，所述可溶性铜盐与所述螯合剂的投料比满足如下条件所述可溶性铜盐中的Cu2+与所述螯合剂的物质的量比为11;所述步骤幻中，所述螯合剂与所述载体蛋白的投料比满足如下条件所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的物质的量的比为51。5.根据权利要求3或4所述的抗原，其特征在于所述步骤1)中，所述络合反应在PH值为7.4的条件下进行；所述步骤2、中，所述偶联反应在PH值为9.0的条件下进行。6.根据权利要求3-5中任一所述的抗原，其特征在于所述步骤1)中，所述络合反应的温度为25°C，所述络合反应的时间为10分钟；所述步骤2)中，所述偶联反应的温度为25°C，所述偶联反应的时间为12小时。7.根据权利要求3-6中任一所述的抗原，其特征在于所述步骤1)中，所述螯合剂的分子式为C22H28N4OltlS·3HC1；所述步骤1)中，所述可溶性铜盐溶液按照包括如下步骤的方法制备得到将铜片溶于浓度为68%(体积百分含量)的HNO3水溶液中，待铜片完全反应后，得到所述可溶性铜盐溶液；所述步骤1)中，所述螯合剂溶液按照包括如下步骤的方法制备得到将所述螯合剂加入PH值为9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液中，得到所述螯合剂溶液；所述步骤幻中，载体蛋白BSA溶液按照包括如下步骤的方法制备得到将所述载体蛋白BSA溶于pH值为7.4、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液，得到所述载体蛋白溶液；所述步骤幻中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白；所述步骤2)中，所述偶联缓冲液为pH9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液。8.一种不完全包被原，按照包括如下步骤的方法制备得到将螯合剂、载体蛋白和反应缓冲液混合，在PH至9.0、25°C的条件下反应12小时，得到螯合剂与载体蛋白的不完全包被原。9.根据权利要求8所述的不完全包被原，其特征在于所述螯合剂与所述载体蛋白的投料比满足如下条件所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的物质的量的比为51。和/或，所述反应在PH值为9.0的条件下进行。和/或，所述反应的温度为25°C，所述反应的时间为12小时；和/或，所述螯合剂溶液按照包括如下步骤的方法制备得到将螯合剂加入PH值为9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液中，再调节pH值至9.0，得到所述螯合剂溶液；和/或，所述螯合剂的分子式为C22H28N4OltlS·3HC1；和/或，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。10.权利要求2所述单克隆抗体在检测样品中是否含有铜中的应用；权利要求2所述单克隆抗体在检测样品中铜的含量中的应用。全文摘要本发明公开了一种抗重金属铜的单克隆抗体。该单克隆抗体是由杂交瘤细胞株C9D11CCTCCNOC201087分泌得到的。本发明的抗重金属铜的单克隆抗体的效价高。利用本发明的抗体可以用于铜离子残留的免疫学检测。并利用其快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，发展便于现场检测的便携方法，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验。对提高风险评估工作的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。文档编号C07K14/795GK102071170SQ201010533370公开日2011年5月25日申请日期2010年11月5日优先权日2010年11月5日发明者李霞,杨慧,赵丽申请人:北京农产品质量检测与农田环境监测技术研究中心,北京市农林科学院