本发明涉及到基因工程和生物催化领域，提供了一种新的6磷酸塔格糖4位差向异构酶，该酶具有能够使6磷酸果糖(fructose6-phosphate)的4位碳进行差向异构，转化为6磷酸塔格糖(tagatose6-phosphate)以及将6磷酸塔格糖转化为6磷酸果糖的功能。本发明还提供了该酶在塔格糖生产中的应用。
背景技术：
6碳糖的4位差向异构在制造稀少糖及其衍生物中具有重要的作用，例如一篇韩国专利(申请号：wo2015016544a1)报道可将6磷酸果糖转化进行4位差向异构变成6磷酸塔格糖，随后将6磷酸塔格糖脱磷成为塔格糖。该专利中报道的6磷酸塔格糖4位差向异构酶是来自于大肠杆菌的1，6二磷酸果糖醛缩酶(fructose1，6-phosphatealdolase)，该酶具有两套不同的催化氨基酸催化不同的反应(scirep2017；7:1934.)，一套催化氨基酸催化1，6二磷酸果糖醛缩为甘油醛3-磷酸和磷酸二羟丙酮，另一套催化氨基酸催化6磷酸塔格糖转化为6磷酸果糖，两套催化氨基酸互不干扰，突变催化1，6二磷酸果糖醛缩为甘油醛3-磷酸和磷酸二羟丙酮的氨基酸不会影响催化6磷酸塔格糖转化为6磷酸果糖的酶活。但由于该酶的热稳定性不高，不适合塔格糖的规模化生产。另外wichelecki等在研究根癌农根菌(agrobacteriumtumefaciens)中阿卓糖醇和半乳糖醇的代谢时，发现有一个基因atu3167所编码的酶能够催化6磷酸塔格糖转化为6磷酸果糖(jbiolchem2015；290:28963-28976.)，但该酶的热稳定性同样不高，不适合塔格糖的规模化生产。因此在稀少糖的制备特别是规模化生产稀少糖的工艺中迫切需要一种热稳定性高的、工艺步骤简单的且能够完成4位差向异构的6磷酸塔格糖4位差向异构酶，该耐热酶可应用于体外多酶体系生产塔格糖。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的第一方面提供了一种用于催化6磷酸果糖和6磷酸塔格糖相互转化的6磷酸塔格糖4位差向异构酶(tit4e)，所述6磷酸塔格糖4位差向异构酶选自下组：
(a)具有seqidno:1所示氨基酸序列的蛋白；或
(b)将seqidno:1所示氨基酸序列的蛋白经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化6磷酸果糖和6磷酸塔格糖相互转化活性的衍生蛋白；或
(c)序列中含有(a)或(b)中所述蛋白序列的衍生蛋白；或
(d)氨基酸序列与seqidno:1所示氨基酸序列的相同性≥60％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)，且具有催化6磷酸果糖和6磷酸塔格糖相互转化活性的衍生蛋白。
在另一优选例中，所述6磷酸塔格糖4位差向异构酶来源于嗜热菌thermoanaerobacterindiensis。
在另一优选例中，所述6磷酸塔格糖4位差向异构酶的氨基酸序列如seqidno:1所示。
本发明的第二方面提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸选自下组：
(a)编码如seqidno:1所示蛋白的核苷酸序列；或
(b)如seqidno:2所示的核苷酸序列；或
(c)与seqidno:2所示核苷酸序列的相同性≥50％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)的核苷酸序列；或
(d)与(a)-(c)任一所述的核苷酸序列互补(较佳地为完全互补)的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述核苷酸序列如seqidno:2所示。
本发明的第三方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞，如细菌细胞，较佳地，为大肠杆菌。
本发明的第五方面提供了一种应用，所述应用为本发明第一方面所述的6磷酸塔格糖4位差向异构酶或其衍生蛋白或第四方面所述宿主细胞在催化6磷酸果糖和6磷酸塔格糖相互转化中的应用。
本发明的第六方面提供了一种应用，所述应用为本发明第一方面所述6磷酸塔格糖4位差向异构酶(tit4e)或第三方面所述载体或第四方面所述宿主细胞的应用，其特征在于，用于构建体外多酶催化体系制备塔格糖。
在另一优选例中，所述多酶催化体系含有α葡聚糖磷酸化酶(αgp)、磷酸葡萄糖变位酶(pgm)、葡萄糖磷酸异构酶(pgi)、6磷酸塔格糖4位差向异构酶(tit4e)、6磷酸塔格糖磷酸酶(t6p)。
在另一优选例中，所述多酶催化体系以淀粉或麦芽糊精为底物制备塔格糖。
本发明的多核苷酸序列能用下列方法获得：1)从基因组dna扩增获得双链dna序列；2)化学合成dna序列以获得所述多肽的双链dna。
本发明中，编码该耐热的6磷酸塔格糖4位差向异构酶(tit4e)的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于t7启动子的表达载体(gene，1987，56：125)，如pet20b载体；在哺乳动物细胞中表达的pmsxnd表达载体(jbiochem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含tit4e的多核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等(molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory.newyork，1989)。所述的多核苷酸序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的pl启动子；真核启动子包括cmv立即早期启动子、hsv胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、反转录病毒的ltrs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于大肠杆菌的氨苄青霉素抗性、四环素和卡那霉素等，或真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。
本发明中，编码6磷酸塔格糖4位差向异构酶(tit4e)的多核苷酸或含有该多核苷酸的载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇s2或sf9；动物细胞如cho、cos或bowes黑素瘤细胞等。
用本发明所述的多核苷酸序列或含有所述多核苷酸序列的载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
通过常规的重组dna技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的6磷酸塔格糖4位差向异构酶(tit4e)，一般来说有以下步骤：(1)用本发明的编码6磷酸塔格糖4位差向异构酶(tit4e)的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；(3)从细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在步骤(3)中，蛋白质可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的dna或rna，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。类似地，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。
衍生蛋白是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列。所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换。衍生蛋白可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。衍生蛋白也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。
“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。
“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“c-t-g-a”可与互补的序列“g-a-c-t”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。
“相同性百分率”是指在两种或多种氨基酸或核酸序列比较中序列相同或相似的百分率。可用软件测定相同性百分率，如通过genedoc程序。
附图说明
图1.6磷酸果糖转化为6磷酸塔格糖的示意图，涉及到6磷酸果糖的4位的碳原子的差向异构反应。
图2.可在大肠杆菌中表达tit4e的质粒pet20b-tit4e的载体示意图。
图3.(a)在不同温度下对含有pet20b-tit4e的bl21(de3)大肠杆菌，用终浓度为100μm的iptg进行诱导表达，并在60℃对上清液热处理进行部分纯化。lanem,蛋白marker，lane1，tit4e在37℃诱导表达的细胞破碎液，lane2，tit4e在37℃诱导表达的细胞破碎液上清液，lane3，tit4e在37℃诱导表达的细胞破碎液上清液的热处理后的上清液，lane4，tit4e在18℃诱导表达的细胞破碎液，lane5，tit4e在18℃诱导表达的细胞破碎液上清液，lane6，tit4e在18℃诱导表达的细胞破碎液上清液的热处理后的上清液，(b)利用ni-nta对可溶的tit4e蛋白质进行纯化，lanem,蛋白marker，lanes，tit4e的细胞破碎上清液，lane20-500，指的是含有不同浓度的咪唑(20mm-500mm)的缓冲液洗脱下来的tit4e。
图4.tit4e的6磷酸果糖转化为6磷酸塔格糖的酶活测定。
图5.利用tit4e和α-葡聚糖磷酸化酶(αgp)，磷酸葡萄糖变位酶(pgm)，磷酸葡萄糖异构酶(pgi)和6磷酸塔格糖磷酸酶(t6p)催化淀粉生产塔格糖。该图为在反应过程中对反应液进行检测的高效液相色谱(hplc)图，箭头表明塔格糖的生成。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验材料
麦芽糊精，aldrich公司产品，产品编号419672；
pet20b载体，novagen，madison，wi；
大肠杆菌表达菌bl21(de3)，invitrogen，carlsbad，ca；
6磷酸果糖，sigma公司产品，产品编号f3627；
6磷酸塔格糖，sigma公司产品，产品编号50661；
实施例1tit4e基因的克隆
我们从ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上获得了该多肽6磷酸塔格糖4位差向异构酶的氨基酸序列，该序列的ncbireferencesequence为wp_019907213.1(seq.no.1)，我们将该多肽命名为tit4e，tit4e在ncbi上注释为假定蛋白(hypotheticalprotein)，并被归类于6磷酸塔格糖激酶，是将塔格糖在atp的作用下磷酸化生成6磷酸塔格糖的酶。我们随后委托无锡青兰生物科技有限公司(http://qinglanbiotech.com/)根据该氨基酸序列设计编码该多肽的多核苷酸(dna)序列，并对大肠杆菌表达系统进行密码子优化，优化后的多核苷酸序列如seq.no.2所示。
无锡青兰将该密码子优化好的序列克隆至pmv载体上，形成pmv-tit4e质粒。随后我们利用正向引物gaacatatgaacaccgaacatccgctg(下划线显示ndei酶切位点)和反向引物ccgctcgagaatcagtttgaattcaccgc(下划线显示xhoi酶切位点)，以pmv-tit4e质粒为模版，扩增出tit4e片段，通过ndei和xhoi双酶切后，与同样经过ndei和xhoi双酶切后的pet20b载体连接后，获得pet20b-tit4e表达载体(图2)。在该表达载体中，由t7启动子(t7promotor)和t7终止子(t7terminator)等元件负责tit4e的表达，表达出的tit4e的c端有6xhis标签，可用ni-nta树脂进行蛋白质的纯化。
实施例2tit4e的表达和纯化
将pet20b-tit4e转化至大肠杆菌bl21(de3)中，挑取单克隆至3ml含有100μg/ml氨苄霉素的lb培养基，37℃，220rpm培养过夜。取1ml过夜菌至200ml含有100μg/ml氨苄霉素的lb培养基中，37℃，220rpm至od600值达到0.8左右，加入终浓度为100μm的isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside(iptg)，分别在37℃和18℃诱导蛋白质表达。37℃诱导4小时，18℃诱导20小时。诱导结束后，离心收集菌体，用30mm磷酸缓冲液(ph7.0)重悬菌体，超声破壁，既得到细胞破碎液，用sds-page检测酶的表达量，如图3a的lane1和lane4，对细胞破碎液进行高速离心(12000rpm，10min)，对上清液也用sds-page进行检测，如图3a的lane2和lane5。可以看到，不管是18℃诱导或是37℃诱导，tit4e几乎都是可溶性表达。由于tit4e来自于耐高温菌thermoanaerobacterindiensis，我们采用了对细胞破碎液的上清在60℃处理20min，进行部分纯化，然后使用sds-page检测纯化效果(图3a的lane3和lane6)，可以看到，目的蛋白获得了部分纯化，但纯度并不高。随后我们采用ni-nta柱对酶进行了纯化，如图3b所示，可以看到含有50mm-200mm咪唑的30mm磷酸缓冲液就能洗脱下较纯的tit4e。对含有咪唑的tit4e进行透析去除多余的咪唑，用于下一步的酶活测定。
实施例3tit4e的酶活测定
tit4e的酶活的测定方法为，在一个反应体系中含有6磷酸果糖，6磷酸塔格糖磷酸酶，缓冲液，镁离子，反应结束后测定反应体系的无机磷的增长量。具体来说，在一个反应体系中含有100mmhepes缓冲液，10mm的6磷酸果糖，10u/ml的6磷酸塔格糖磷酸酶(来自于archaeoglobusfulgidus，基因在kegg上的编号为af_0444，该基因也在大肠杆菌中异源表达，通过ni-nta柱纯化获得大量的酶)，5mm的硫酸镁，0.005或0.02g/l的tit4e，在60℃反应8分钟。反应结束后，冰浴终止反应。利用文献(anal.chem.1956,28,1756-1759)提供的测定无机磷的方法测定释放出的无机磷离子。由于6磷酸塔格糖磷酸酶对6磷酸果糖也有微弱的磷解作用，对照实验组是未添加tit4e的反应体系。反应过程中释放出的无机磷离子如图4a所示，可以看到酶的反应是线性反应，也就是说所释放出的无机磷离子和反应时间与酶浓度是成正比的。通过酶的浓度和生产无机磷离子的速度作图(图4b)，计算出tit4e的将6磷酸果糖转化为6磷酸塔格糖在60℃的酶活是2.82u/mg。所以该多肽tit4e具有将果糖6磷酸转化为6磷酸塔格糖的活性。一个酶活单位表示一分钟内产生1μmol的产物所需要的酶量。
随后我们对tit4e对6磷酸塔格糖转化为6磷酸果糖的酶活进行了测定，反应体系中含有100mmhepes缓冲液，10mm的6磷酸塔格糖，5mm的硫酸镁，0.005或0.02g/l的tit4e，在60℃反应8分钟。反应结束后，冰浴终止反应。在最终样品中加入1u/ml的磷酸葡萄糖异构酶(pgi，购于sigma，产品编号p5381)，5u/ml的6磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh，购于sigma，产品编号g6378)，5mmnad+，37℃反应，直到od340不再增加，通过增加的od340计算所生成的6磷酸果糖。多肽tit4e将6磷酸塔格糖转化为6磷酸果糖在60℃的酶活是3.7u/mg。
由此可以断定，具有seqno.1所示氨基酸序列的蛋白具有将6磷酸塔格糖和6磷酸果糖相互转化的酶活性，该蛋白被定义为6磷酸塔格糖4位差向异构酶。
实施例4tit4e的稳定性
纯化后的tit4e稀释到30mm磷酸缓冲液(ph7.0)，5mm硫酸镁离子中，终浓度为0.1mg/ml,在70℃处理不同时间(30分钟-6小时)，然后测定tit4e对果糖6磷酸转化为6磷酸塔格糖的残余活性，并由此残余活性计算tit4e在70℃的稳定性。通过计算，tit4e在70℃的t1/2时间(酶活失去一半的时间)为4.7小时。该结果表明该酶在70℃处理4.7小时后会失去50％的酶活，所以我们在后续酶在塔格糖生产的应用中将酶的使用温度降到60℃反应，这样能保证酶的长期稳定。
实施例5tit4e制备塔格糖
我们构建了含有α葡聚糖磷酸化酶(αgp)、磷酸葡萄糖变位酶(pgm)、葡萄糖磷酸异构酶(pgi)、6磷酸塔格糖4位差向异构酶(tit4e)、6磷酸塔格糖磷酸酶(t6p)的体外多酶催化体系，以淀粉为底物生产塔格糖。其中αgp从淀粉和无机磷离子生产1磷酸葡萄糖，pgm将1磷酸葡萄糖转化为6磷酸葡萄糖，pgi将6磷酸葡萄糖转化为6磷酸果糖，tit4e将6磷酸果糖转化为6磷酸塔格糖，t6p将6磷酸塔格糖转化为塔格糖，释放出磷离子。整个反应过程中磷离子是平衡的。其中，αgp来源于thermotogamaritima，基因在kegg上的编号为tm1168；pgm也来源于thermotogamaritima，基因在kegg上的编号为tm0769；pgi来源于clostridiumthermocellum，基因在kegg上的编号为cthe0217；t4e为tit4e，来自于本发明；t6p来源于archaeoglobusfulgidus，基因在kegg上的编号为af_0444。以上所有酶都是在大肠杆菌中异源表达并进行了纯化。
在一个1.0毫升的反应体系中含有40mm的磷酸缓冲液(ph7.0)、5mm的二价镁离子、1u/ml的αgp、1u/ml的pgm、1u/ml的pgi、1u/ml的tit4e，1u/ml的t6p，150g/l的可溶性淀粉，在60℃进行催化反应，反应48个小时后，利用装配了美国伯乐(bio-rad)hpx–87h的柱子的高效液相色谱(hplc)仪检测反应液中的组分。该hplc分析仪可以用来区分反应液中的塔格糖、葡萄糖、1-磷酸葡萄糖或6-磷酸葡萄糖(如图5所示)；并且可以对塔格糖进行定量，塔格糖的浓度与hplc图中塔格糖特征峰的强度是成正比的；hplc的流动相为5mm的稀硫酸。
如图5，可以看到，塔格糖的浓度是随着反应时间的增加而增加的，反应结束后，最终塔格糖的终浓度是83g/l(图1)，转化率为55％。
由此可以看到，本发明中tit4e具有能将果糖6磷酸转化为6磷酸塔格糖的活性，并可与其他的酶组建体外多酶分子机器，用于将淀粉生产塔格糖的反应中。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>一种新的6磷酸塔格糖4位差向异构酶及其应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>446
<212>prt
<213>thermoanaerobacterindiensis
<400>1
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