本发明属于生物工程技术领域，涉及融合型脂肪酶，尤其一种热稳性提高的融合型华根霉脂肪酶及其应用。
背景技术：
脂肪酶能逐步地将甘油三酯水解成脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油；同时它还能催化酯的酸解、醇解、氨解以及转酯化和酯合成等反应，因其有独特的催化活性而被广泛地应用到食品加工、油脂加工、皮革加工、生物能源以及饲料添加等过程中，并且脂肪酶在再生能源的开发和环境保护中也起着至关重要的作用。虽然在工业生产中已经有很多种来源于根霉的脂肪酶可供选择，但天然根霉脂肪酶大多为中温脂肪酶，热稳定性不高，高温条件下易失活，而油脂加工反应一般都需要在较高温度下进，天然根霉脂肪酶不耐高温这一缺陷使得工业生产成本大幅度提高，也限制了脂肪酶在工业生产的应用。
华根霉脂肪酶的热稳定性比较差，工业生产损失量比较大，因此生产成本也会大幅度提高。若能将华根霉脂肪酶的热稳定性提高，则其生产成本也会随之下降。因此，本发明通过对华根霉脂肪酶基因上的改造使其成为一种耐热性比较高的脂肪酶。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种融合型脂肪酶及其应用，旨在解决华根霉脂肪酶的耐热性较差和在工业生产上不理想的问题。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种热稳性提高的融合型华根霉脂肪酶，是由华根霉脂肪酶的氨基酸序列分别在n端融合了一段由30～32个氨基酸组成的双亲短肽，其中华根霉脂肪酶氨基酸序列如seqidno.1所示。
具体的，所述的双亲短肽为双亲短肽1或双亲短肽2，所述的融合型脂肪酶由华根霉脂肪酶氨基酸序列seqidno.1中分别在n端融合了一段由30～32个氨基酸组成的双亲短肽1、双亲短肽2而获得。
所述的双亲短肽1和双亲短肽2的氨基酸序列分别如seqidno.2和seqidno.3所示。
本发明所述的融合型脂肪酶的氨基酸序列如seqidno.4或seqidno.5所示。
所述的融合型脂肪酶的酶促反应最适ph值为9.0；最适温度为40℃；在ph4-ph10、37℃条件下，ph耐受1小时，残活还在50％，在ph7-ph10、37℃条件下，ph耐受1小时，残活还在80％以上，脂肪酶融合双亲短肽1在60℃耐受45min残活都在50％以上；脂肪酶融合双亲短肽2在60℃耐受30min残活都在50％以上。
在本发明的另一方面，所述的氨基酸序列seqidno.4或seqidno.5经修饰、缺失或添加一或几个氨基酸获得氨基酸序列，且保持只有90％的同源性的序列也在本发明的保护范围内。
所述的融合型脂肪酶编码基因的核苷酸序列如seqidno.6或seqidno.7所示。
在本发明另一方面，与所述的编码基因seqidno.6或seqidno.7编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与seqidno.6或seqidno.7所示的核苷酸序列或其互补序列不同的核苷酸序列也在本发明的保护范围内。
在本发明另一方面，本发明还包括携带有编码基因序列为seqidno.6或seqidno.7的脂肪酶突变体的质粒。
本发明一并提供上述融合型脂肪酶的构建方法，包括以下步骤：
1)设计引物f1和r1、f2和r2进行无模板pcr，从而获得双亲短肽1、双亲短肽2；再设计引物f3和r3、f3和r4分别将双亲短肽1、双亲短肽2进行pcr扩增；
2)以华根霉脂肪酶基因连接到载体上的重组质粒为模板，设计引物f4和r5、f5和r5分别进行pcr扩增脂肪酶1、脂肪酶2；
3)以f3、r5为引物，分别以双亲短肽1与脂肪酶1、双亲短肽2与脂肪酶2为模版进行融合pcr扩增。
4)将融合pcr扩增产物与载体进行重组；
5)将5μl重组产物于50μldh5α感受态细胞中，经冰浴冷却、热激，冷却后，加500μllb培养基，37℃180转培养1h，离心保留部分清液悬浮沉淀，取全部菌液涂板，37℃过夜培养；
6)进行阳性克隆子筛选验证，挑取单菌落于相应抗性的lb培养基中，培养2-3h后pcr鉴定，将筛选出的阳性克隆子送出测序，测序结果与原序列比对。
上述引物f1、r1、f2、r2、f3、r3、f4、r4、f5、r5的核苷酸序列分别如seqidno.8～17所示。
在本发明另一方面，本发明还提供了两种融合型脂肪酶的基因的工程菌，所述的工程菌含有具有seqidno.6或seqidno.7所示基因的载体。
所述的工程菌通过将seqidno.6或seqidno.7所示的基因克隆到表达载体上，然后进行细胞转化，获得重组基因工程菌。
本发明所述的编码基因seqidno.4、seqidno.5的表达载体选自ppic9k、ppic9、ppiczaa\b\c、ppicza\b\c或pgapzaa\b\c。
在本发明另一方面，本发明提供的两种融合型脂肪酶在饲料添加剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果为：
本发明提供的融合型脂肪酶，融合后的基因除与ppic9k构建重组质粒外，还可以与ppic9、ppiczaa\b\c、ppicza\b\c、pgapzaa\b\c等表达载体构建重组质粒，转化相应宿主菌中，通过在平板中加入g418、zeocin等抗生素，筛选获得脂肪酶基因工程菌，然后通过发酵获得新的脂肪酶。使其成为耐热性高的脂肪酶，这两种脂肪酶与野生型脂肪酶在高温下耐受经实验证明，60℃耐受20min脂肪酶融合双亲短肽1相对酶活大约还有67.98％，脂肪酶融合双亲短肽2相对酶活大约还有59.65％，而野生型脂肪酶仅仅剩余50.68％。在60℃时野生型脂肪酶相对酶活剩余一半时的时间大约为20min，而脂肪酶融合双亲短肽1相对酶活剩余一半时的时间大约为45min，脂肪酶融合双亲短肽2相对酶活剩余一半时的时间大约为30min。这两种脂肪酶的耐热性有了明显的提高，工业化生产中损失率有一定的降低。
附图说明
图1是本发明实施例提供的融合型脂肪酶的构建方法流程图；
图2是本发明实施例提供的最适ph的测定曲线图；
图3是本发明实施例提供的最适温度曲线图；
图4是本发明实施例提供的ph耐受曲线图；
图5是本发明实施例提供的60℃耐受曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
通过对对华根霉脂肪酶的蛋白质空间结构进行模拟分析，对其分别融合了双亲短肽1，双亲短肽2。具体实施方案为以华根霉脂肪酶基因为模板，通过基因的融合pcr方法，进行华根霉脂肪酶基因与双亲短肽融合，获得了两种融合型脂肪酶基因，将两种融合型脂肪酶基因与ppic9、ppiczaa\b\c、ppicza\b\c、pgapzaa\b\c等载体相连构建重组质粒，转入相应宿主菌(gs115或x33、smd1168、pichiapink)中进行异源表达，发酵可以获得两种脂肪酶。该两种脂肪酶能在酸性环境中很好发生作用，并且具有较理想耐热特性，适合耐高温制粒，因此适合工业上生产。
本发明实施例的脂肪酶融合后的氨基酸序列如seqidno.4或seqidno.5所示。
1、实验材料和试剂：
基因来源菌株：由本实验室筛选并保存的华根霉rhizopuschinensiscctccm201021；表达宿主菌及载体：gs115和ppic9k均购于novagen公司；脂肪酶重组质粒由实验室构建；宿主菌：dh5α感受态细胞购于北京全式金公司。
主要试剂：dnamarker、蛋白marker(takara公司)；plasmidminikiti(omega公司)。琼脂糖购自tiangen生化科技(北京)有限公司；核酸染料购自百泰克生物公司；限制性核酸内切酶、pcr扩增酶均购自takara公司。
实验仪器：离心机(eppendorf)；pcr扩增仪(bio-rad)；核酸电泳仪(bio-rad)；蛋白电泳仪(amershambioscience)；凝胶成像仪(bio-rad)。
主要培养基:ypd、lb、酵母发酵培养基(fa与fb)均按照“invitrogen公司操作手册”的推荐方法来配制。
2、脂肪酶酶活力的测定
在一定条件下每分钟水解p-np底物而生成1μmol的对硝基苯酚所需要的酶量，即一个酶活单位，以u表示。
1)实验仪器：恒温水浴锅；ph仪器；酶标仪(bio-rad)等。
2)实验材料：对硝基苯酚棕榈酸酯(p-npc16)(sigma公司)。
3)溶液配制：
ph缓冲液：0.1mol/l一水合柠檬酸缓冲液和0.1mol/l磷酸缓冲液(ph2-7)；
0.1mol/ltris-hcl缓冲液(ph7-9)；
0.1mol/l甘氨酸-naoh缓冲液(ph9-12)。
底物溶液：10mmol/l对硝基苯酚棕榈酸酯(p-npc16)。
4)采用对硝基苯酚法(p-nitrophenol)：总体系为500μl，其中含有50mmol/l缓冲液420μl，10mmol/l底物p-np30μl和稀释的酶液50μl。底物和缓冲液混合后在反应温度下预热2min，加入稀释酶液混匀，反应5min加入50μl1.0mol/l的sds终止反应，并加入500μl1.0mol/l的na2co3显色；在波长为405nm下测定其od值。
实施例1脂肪酶融合双亲短的制备
如图1所示，本发明实施例的两种脂肪酶的获得方法包括以下步骤：
(1)rcr扩增：设计引物(f1,r1)、(f2,r2)进行无模板pcr，从而获得双亲短肽1、双亲短肽2；再设计引物分别将双亲短肽1(f3,r3)、双亲短肽2(f3,r4)进行pcr扩增；以华根霉脂肪酶基因连接到载体上的重组质粒为模板，设计引物(f4,r5)(f5,r5)进行pcr扩增脂肪酶基因1、脂肪酶基因2；
(2)以f3、r5为引物，分别用双亲短肽1与华根霉脂肪酶基因1、双亲短肽2与华根霉脂肪酶基因2为模版分别进行融合pcr扩增；
(3)重组质粒构建：将融合pcr产物与载体37℃进行重组30min；
(4)转化：加入5μl突变后的产物于50μldh5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；42℃准确热激45s后立即置于冰上冷却l0min；加500μllb培养基，180转，37℃培养lh；7000rpm离心3min，弃上部分清液，保留100-150μl上清轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，37℃过夜培养；
(5)阳性克隆子验证：挑取单菌落于500μl相应抗性的lb培养基中，200rpm培养2-3h后pcr鉴定；将筛选出的阳性克隆子送出测序，测序结果与原序列比对；
(6)找融合正确的重组质粒；将突变质粒转入毕赤酵母gs115或x33、smd1168、pichiapink中进行表达，发酵并进行对比测酶活，研究酶学及应用特性。
其中，上述方法中设计得到引物具体如下：
双亲短肽1、双亲短肽2的氨基酸序列分别如seqidno.2和seqidno.3所示。
华根霉脂肪酶基因融合双亲短肽1、2，按上实验方法进行融合后送华大基因公司测序，结果如序列seqidno.4和seqidno.5，对应脂肪酶核苷酸序列如序列seqidno.6和seqidno.7，转化的酵母菌株具有脂肪酶活性，各选取一株发酵酶活性单位高的菌株进行发酵获得酶液进行酶学性质测定。
实施例2脂肪酶最适ph测定
将缓冲液ph调成2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，将酶液稀释到适应的倍数，依照脂肪酶活测定方法在37℃测出最适ph之后在最大值两侧补半点继续检测最适值(例如最适ph为9，则再取ph8、8.5、9、9.5和10按照脂肪酶活测定方法进行测定)。
脂肪酶酶促反应最适ph值结果如图2所示。脂肪酶融合双亲短肽1、2与野生型脂肪酶最适均为9，无明显变化。
实施例3脂肪酶最适温度测定
依照脂肪酶活测定方法测定，在上述最适ph的条件下，将反应物放在不同温度下反应0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，测出最适温度后，在最大值两侧补半点(例如最适温度是40℃，则补充30℃、35℃、40℃、45℃、50℃按照脂肪酶活测定方法测定)。
脂肪酶酶促反应最适温度值如图3所示，脂肪酶基因融合双亲短肽1、2与野生型脂肪酶最适温度分别为40℃。
实施例4脂肪酶ph耐受测定
将缓冲液调节到不同ph：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，用这些不同的缓冲液稀释酶液，从放入酶液之时开始计时，稀释好的酶液放入37℃水浴锅中耐受1小时放后在冰上，立即按照脂肪酶活测定方法在最适ph和最适温度下进行反应。对照组的酶液是未耐受过的酶液。
由图4可知，三种脂肪酶的耐受曲线趋势是相同的，在ph为4-9之间37℃耐受1小时相对酶活有了明显的升高。
实施例5脂肪酶温度耐受测定
将酶液稀释到相应倍数，然后放入不同温度：60℃下耐受1min、3min、5min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、45min、60min之后按照脂肪酶活测定方法在最适ph和最适温度下反应。对照实验组酶液是未温度耐受过的酶液。
高温下脂肪酶的温度耐受情况如图5所示，随着温度的升高，相对酶活不断降低，随着时间的增加，相对酶活也逐渐降低。无论在任何温度和时间下，融合后的相对酶活都高于突变前的，60℃耐受20min融合型脂肪酶1相对酶活大约还有67.98％，融合型脂肪酶2相对酶活大约还有59.65％，而野生型脂肪酶仅仅剩余50.68％。在60℃时野生型脂肪酶相对酶活剩余一半时的时间大约为20min，而融合型脂肪酶1相对酶活剩余一半时的时间大约为45min，融合型脂肪酶2相对酶活剩余一半时的时间大约为30min。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110>云南师范大学
<120>一种热稳性提高的融合型华根霉脂肪酶及其应用
<160>17
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