本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种盐角草漆酶及其编码基因和应用。
背景技术：
木质化(lignification)，指的是木质素产生并在细胞壁沉积的一系列复杂过程，主要经历三个过程：木质素单体在细胞质中合成，单体跨细胞膜转运到细胞壁以及单体氧化聚合形成大分子聚合物沉积在细胞壁上。木质素单体分子的合成途径是苯丙烷代谢的一条重要支路，始于苯丙氨酸，经过脱氨基和一系列羟基化、甲基化和氧化还原反应，形成香豆醇(p-coumarylalcohol)、松柏醇(coniferylalcohol)和芥子醇(sinapylalcohol)三种单体分子。单体分子在细胞质合成后转运到细胞壁，在氧化还原酶的催化作用下，以自由基偶联的方式氧化聚合，分别形成甲氧基化程度不同的对羟基苯基木质素(p-hydroxyphenyllignin，hunit)、愈创木基木质素(guaiacyllignin，gunit)和紫丁香基木质素(syringyllignin，sunit)，作为木质素的三种主要组分。近年来的研究发现，除过氧化物酶以外，漆酶(laccase，lac)也参与了植物木质素单体的氧化聚合过程。
漆酶(laccase，p-diphenol:dioxygenoxidoreductase，ec1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，属于多铜氧化酶(multicopperoxidases，mcos)家族。漆酶在细菌、真菌、植物和昆虫中广泛分布，多以基因家族的形式出现，例如，长绒毛栓菌(trametesvillosa)和黑尾叶蝉(nephotettixcincticeps)分别含有5个和3个漆酶，而模式植物拟南芥基因组中含有17个漆酶基因。植物漆酶最早于1883年从日本漆树(rhusvernicifera)的生漆液中分离得到。迄今，研究人员已从漆树科以外的多种植物中鉴定到漆酶，包括火炬松(pinustaeda)，欧亚槭树(acerpseudoplatanus)，烟草(nicotianatabacum)，北美鹅掌楸(liriodendrontulipifera)，黑麦草(loliumperenne)，拟南芥(arabidopsisthaliana)，水稻(oryzasativa)，玉米(zeamays)，油菜(brassicanapus)，甘蔗(saccharumofficenarum)，杨树(populustrichocarpa)和短柄草(brachypodiumdistachyon)等。
早在20年前，就有有关漆酶参与火炬松、欧亚槭树木质素合成的报道，但皆系体外实验，缺乏遗传学证据。直至2011年，berthet等人发现拟南芥lac4或lac17突变导致植株木质素含量小幅下降，而lac4和lac17双突变导致木质素含量显著下降20-40％，同时lac17的互补表达可以使lac17突变体木质素水平恢复正常。该研究提供了漆酶参与木质素合成的直接遗传学证据，是漆酶研究史上的重要里程碑。随后的研究发现拟南芥lac11也参与了木质素合成，lac4lac11以及lac11lac17双突变体的木质素含量相比野生型和单突变体显著下降，并且lac4lac11lac17三突变体生长严重阻滞，根中的木质素沉积近乎废除，木质素含量降低更加显著。此外利用甘蔗soflac互补拟南芥lac17突变体的实验发现，互补株系木质素s/g的比例没有变化，但木质素含量恢复到野生型水平；短柄草bdlac5的突变体bd4442茎中木质素显著下降，s单体比例显著升高；利用反义rna技术对美洲黑杨(populusdeltoides)pdlac2进行敲除，转基因杨树苗的木质素含量虽未变化，但植株生物量增加，木质素单体s/g比例升高，这些研究表明甘蔗soflac、短柄草bdlac5以及美洲黑杨pdlac2均具有催化木质素合成的作用，也揭示了利用漆酶调控植物木质素含量和/或组成的可能性。
逆境胁迫能引起植物木质化程度的改变，具体表现为木质素合成相关基因的表达变化、植株木质素含量、木质素组分改变以及木质素异位沉积等。水稻在5mg·dm-3mn处理下木质素含量升高，尤其在对mn胁迫敏感的水稻中，木质素含量显著上升。桉树(eucalyptusgundal)幼苗在长时间低温胁迫处理下以及成苗在秋冬季节时，参与木质素合成的基因表达水平整体显著上调，细胞壁相关的很多myb和nac转录因子也被诱导表达，茎中木质素含量明显提高。在150和200mmnacl处理下，大豆(glycinemaxl.merrill)根中细胞壁结合的过氧化物酶活性显著升高，木质素含量以及h和s型木质素的含量均显著提高。此外，生物胁迫也能引起植物木质化程度的改变。例如，拟南芥在被根肿病菌plasmodiophorabrassicae侵染的早期，木质素合成途径显著增强；对尖孢镰刀菌fusariumoxysporum耐受性强的枣椰树(phoenixdactyliferal.)品种，根中木质素含量是敏感品种的1.8倍；拟南芥幼苗在植物毒素(thaxtomina)处理下，下胚轴会出现异位木质素沉积。这些研究表明，木质化是植物响应逆境胁迫的一种重要机制。
盐胁迫是一种普遍存在的非生物胁迫，植物在漫长的进化过程中逐渐形成了一系列盐响应机制。盐角草(salicorniaeuropaeal.)隶属藜科盐角草属，是一种可耐受1000mmnacl的真盐生植物，其体内积累的nacl可占干重的50％，且不具备盐腺、盐囊泡等特化结构，是研究挖掘抗盐基因资源和进行耐盐机理研究的理想实验材料。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种盐角草漆酶及其编码基因和应用。
第一方面，本发明要求保护一种蛋白质。
本发明所要求保护的蛋白质来源于盐角草(salicorniaeuropaeal.)，命名为selac1，具体为如下任一所示蛋白质：
(a1)氨基酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示的蛋白质；
(a2)氨基酸序列如seqidno.1的第28-585位或seqidno.2的第28-584位所示的蛋白质；
(a3)将seqidno.1或seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(a4)与(a1)-(a3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(a5)在(a1)-(a4)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。
第二方面，本发明要求保护编码前文第一方面所述蛋白质的核酸分子。
进一步，所述核酸分子为编码所述蛋白质的基因；所述基因是如下任一所述的dna分子：
(b1)seqidno.3或seqidno.4所示的dna分子；
(b2)seqidno.3的第82-1758位或seqidno.4的第82-1755位所示的dna分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质的dna分子；
(b4)与(b1)-(b3)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述蛋白质的dna分子。
上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。
seqidno.1(selac1a)由585个氨基酸组成，其中第1-27位为信号肽。seqidno.2(selac1b)由584个氨基酸组成，其中第1-27位为信号肽。seqidno.3由1758个核苷酸组成，编码seqidno.1所示蛋白质；seqidno.4由1755个核苷酸组成，编码seqidno.2所示蛋白质。
第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
所述表达盒由启动子、所述基因和转录终止序列顺次连接而成。
所述重组载体可为重组克隆载体也可为重组表达载体。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如prokii、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
在本发明中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35s启动子。所述重组表达载体中终止所述基因转录的终止序列为nos终止序列。
更加具体的，所述重组载体为将所述基因插入到pcambia1301载体的多克隆位点(如bamhi和saci)处后得到的重组质粒。
在本发明中，所述转基因细胞系为非繁殖材料。
第四方面，本发明要求保护第一方面所述蛋白质或第二方面所述核酸分子或第三方面所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：
(a1)制备具有漆酶活性的产品；
(a2)催化植物中木质素合成；
(a3)促进植物木质部导管分化；
(a4)促进植物细胞壁形成。
第五方面，本发明要求保护第一方面所述蛋白质或第二方面所述核酸分子或第三方面所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：
(b1)提高植物木质素含量；
(b2)提高植物木质素单体组成s/g比值；
(b3)提高植物木质素单体分子间β-o-4连接比例；
(b4)增加植物茎中导管数目；
(b5)增加植物根中导管细胞初生壁和/或次生壁的厚度；
(b6)提高植物抗盐性。
第六方面，本发明要求保护一种培育植物品种的方法。
本发明所要求保护的培育植物品种的方法为培育具有如下(c1)-(c6)所示性状中至少一种的植物品种的方法，包括使受体植物中第一方面所述蛋白质的表达量和/或活性提高的步骤；
(c1)木质素含量提高；
(c2)木质素单体组成s/g比值提高；
(c3)木质素单体分子间β-o-4连接比例提高；
(c4)茎中导管数目增加；
(c5)根中导管细胞初生壁和/或次生壁的厚度增加；
(c6)抗盐性提高。
进一步，本发明要求保护一种培育转基因植物的方法。
所述培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达第一方面所述蛋白质的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比具有如下(c1)-(c6)所示性状中的至少一种：
(c1)木质素含量提高；
(c2)木质素单体组成s/g比值提高；
(c3)木质素单体分子间β-o-4连接比例提高；
(c4)茎中导管数目增加；
(c5)根中导管细胞初生壁和/或次生壁的厚度增加；
(c6)抗盐性提高。
在本发明的一个实施例中，所述抗盐性具体体现为转基因植物在盐胁迫(150mmnacl)下，植物地上部分的生物量(鲜重)高于野生型植物。
第七方面，本发明要求保护一种对漆酶缺失突变体进行表型回复的方法。
本发明所提供的对漆酶缺失突变体进行表型回复的方法，可包括向所述漆酶缺失突变体中导入能够表达第一方面所述蛋白质的核酸分子的步骤。
进一步地，所述漆酶缺失突变体可为漆酶缺失的植物突变体或漆酶缺失的酵母突变体。
在本发明的一个实施例中，所述漆酶缺失突变体具体为拟南芥lac4lac17双突变体。
在第六方面和第七方面中，能够表达所述蛋白质的核酸分子具体可通过重组载体的形式导入所述受体植物或所述漆酶缺失突变体。所述重组载体可为前文所述重组表达载体。
在上述方法中，将所述重组表达载体导入受体植物，具体可为：通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。
在上述各方面中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。
进一步地，所述双子叶植物可为十字花科植物。
更进一步地，所述十字花科植物可为拟南芥(如columbia-0野生型(wt)、lac4lac17突变体)。
本方面从盐角草中克隆了编码漆酶的selac1基因，分析了其基因表达模式和蛋白亚细胞定位，进一步通过在野生型拟南芥和lac4lac17双突变体中表达selac1发现该基因参与木质素合成和植物抗盐。本发明为培育耐盐作物提供理论依据和基因资源。
附图说明
图1为selac1的序列、表达和进化分析。(a)selac1a和selac1b氨基酸序列比对，星号对应的位点为差异氨基酸。蛋白n-端信号肽以浅黄色突出表示，三个铜离子结合结构域分别用浅蓝色、粉色和绿色突出表示，红色方框标识的序列为l1-l4特征序列。(b)200mmnacl处理下，selac1在盐角草地上部分(s)和根(r)中的表达量，数据为平均值±se(n＝3)，误差线上的不同字母代表基因表达量在p<0.05水平上(邓肯检验)具有显著差异。(c)selac1的进化分析。
图2为selac1的亚细胞定位。(a)亚细胞定位载体示意图。(b)利用质壁分离，观察selac1的亚细胞定位。白色箭头所示为发生质壁分离的区域。标尺均为25μm。
图3为过表达拟南芥纯合株系的selac1表达量和漆酶活性。(a)过表达载体示意图。(b)过表达拟南芥纯合株系中selac1的表达水平(n＝3)。(c)过表达拟南芥纯合株系的漆酶活性(n＝4)。数据为平均值±se，误差线上的不同字母代表基因表达量或漆酶活性在p<0.05水平上(邓肯检验)具有显著差异。
图4为转基因拟南芥纯合株系的木质素含量。(a)过表达纯合株系。(b)互补纯合株系。数据为平均值±se(n＝9)。误差线上的不同字母代表木质素含量在p<0.05水平上(邓肯检验)具有显著差异。
图5为过表达拟南芥纯合株系木质素的2d-hsqc谱图。(a)芳环区单体组成。(b)侧链区键合形式。
图6为过表达拟南芥纯合株系茎的wiesner染色和半薄切片观察。(a)wiesner染色，(b)半薄切片整体观察，(c)半薄切片的局部放大，标尺均为50μm。(d)木质部导管数目，数据为平均值±se(n≥10)，误差线上的不同字母代表茎中导管数目在p<0.05水平上(邓肯检验)具有显著差异。
图7为过表达拟南芥纯合株系根的wiesner染色和半薄切片观察。(a)wiesner染色，(b)半薄切片整体观察，标尺均为50μm。(c)木质部导管数目，数据为平均值±se(n≥10)，误差线上的不同字母代表根中导管数目在p<0.05水平上(邓肯检验)具有显著差异。
图8为过表达拟南芥纯合株系的超薄切片观察。(a)茎的超薄切片观察。(b)根的超薄切片观察。标尺均为2μm。(c)茎中导管细胞初生壁(pcw)和次生壁(scw)的厚度。(d)根中导管细胞初生壁(pcw)和次生壁(scw)的厚度。数据为平均值±se(n≥15)，误差线上的不同字母代表细胞壁厚度在p<0.05水平上(邓肯检验)具有显著差异。
图9为过表达拟南芥纯合株系在nacl处理下的表型和生长指标。(a)在150mmnacl处理下，oa和ob转基因株系的表型。(b)在150mmnacl处理下，oa和ob转基因株系的根伸长。(c)在150mmnacl处理下，oa和ob转基因株系的地上部分鲜重。标尺为1.5cm。数据为平均值±se(n＝50)，误差线上的不同字母代表wt和oa或ob之间在p<0.05水平上(邓肯检验)具有显著差异。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
拟南芥lac4lac17突变体：记载在文献“sergeberthet,nathaliedemont-caulet,brigittepollet,przemyslawbidzinski,laurentcézard,phillipelebris,neroborrega,jonathanhervé,eddyblondet,sandrinebalzergue,catherinelapierre,lisejouanin.(2011)disruptionoflaccase4and17resultsintissue-specificalterationstolignificationofarabidopsisthalianastems.plantcell,23:1124-1137”中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
pcambia1301载体：北京华越洋生物公司。
pcambia1300-35s::gfp载体：记载在文献“juanjuanfeng,pengxiangfan,pingjiang,sulianlv,xianyangchen,yinxinli.(2013)chloroplast-targetedhsp90playsessentialrolesinplastiddevelopmentandembryogenesisinarabidopsispossiblylinkingwithvipp1.physiologiaplantarum,150(2):292-307”中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
实施例1、盐角草漆酶基因selac1的获得及功能鉴定
一、实验材料与方法
1、材料培养
盐角草(s.europaeal.)种子采自中国江苏省大丰市。种植方式如下：将种子播种于7cm×7cm的花盆中(内含比例1:1的蛭石/营养土，用水浸湿)，萌发后用1/2hoagland营养液浇灌，每周一次。材料培养于中国科学院植物研究所温室，具体条件为温度25-30℃/18-20℃(白天/夜间)，相对湿度60-80％，光照时间16h。
所用拟南芥(a.thaliana)包括两种：columbia-0野生型(wt)和lac4lac17突变体。用70％乙醇和1％次氯酸钠对拟南芥种子进行表面消毒，灭菌水清洗3-4次后播种到1/2ms培养基上。在4℃条件下暗处理3d后，转至光照条件下(16h光照/8h黑暗)培养。种子萌发7d后，将幼苗移至7cm×7cm的花盆中(内含比例1:1的蛭石/营养土，用水浸湿)。每周浇一次1/2hoagland营养液。材料培养于中国科学院植物研究所人工气候室，具体条件为温度22-23℃，相对湿度60-70％，光照时间16h。
本生烟草(nicotianabenthamiana)种子播种于7cm×7cm的花盆中(内含比例1:1的蛭石/营养土，用水浸湿)，萌发后用1/2hoagland营养液浇灌，每周一次。材料培养于中国科学院植物研究所人工气候室，具体条件为温度22-23℃，相对湿度60-70％，光照时间16h。
2、selac1基因的克隆及生物信息学分析
(1)selac1基因的克隆
从转录组中搜索unigene16755，并在ncbi网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)上进行blast，确定已知序列中包含完整的读码框(openreadingframe，orf)。利用primerpremier5，设计基因特异引物16755-f(5’-atgggaacttttcttcattcctttc-3’)和16755-r(5’-aattcactgccaaagtaaaaaatgc-3’)，用高保真的hifidna聚合酶(全式金公司)进行全长cds克隆。pcr反应程序设定为：95℃，5min；30个循环(95℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min)；72℃，10min。
通过1％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测，切取目标条带进行凝胶回收，具体参照普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(天根公司)说明书进行。将回收片段连接到
将阳性克隆的菌液按1:100的比例接种于含有50mg/lkan的5mllb液体培养基中，37℃，220rpm，过夜振荡培养。参照质粒小提试剂盒(天根公司)说明书进行质粒提取。
(2)selac1的生物信息学分析
对selac1进行蛋白结构域分析(smart，http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？normal＝1)和信号肽预测(signalp4.1server，http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)，利用mega软件(http://www.megasoftware.net/)构建进化树。利用targetp1.1server(http://www.cbs.dtu.dk/services/targetp/)对蛋白定位进行预测。
3、selac1的基因表达量检测
在200mmnacl处理12h和7d时，分别收取盐角草地上部分和根材料，用液氮将材料研磨成粉末，利用trizol法提取盐角草总rna(trizol试剂购自全式金公司)。用无rnase的dnaseⅰ(thermo公司)对样品进行dna消化并参照transscriptfirst-strandcdnasynthesissupermix(全式金公司)试剂盒说明书进行rna样品的反转录。利用stratagenemx3000p仪器(agilent公司)和thunderbird
setubulin-f：5’-cagtgcctttgagccatcttc-3’；
setubulin-r：5’-ctgaatggttcgcttggtctt-3’。
selac1-f：5’-agctgcccttatgggaacttttc-3’；
selac1-r：5’-tcaccctccctaataacgatacttg-3’。
设定反应程序为：95℃，60sec；40个循环(95℃，15sec；55℃，20sec；72℃，30sec)；95℃，15sec；55℃，30sec；95℃，30sec。以se-tubulin基因为内参，采用2-△△ct法(livakandschmittgen,2001)计算selac1基因的相对表达量。
4、selac1过表达和亚细胞定位载体构建
将selac1基因分别插入到pcambia1301载体和pcambia1300-35s::gfp载体中，构建过表达载体和亚细胞定位载体(选用的酶切位点分别为bamhⅰ/sacⅰ和salⅰ/bamhⅰ)。所用引物如下：
过表达载体构建引物：
selac1a-oe-f：5’-ggatccatgggaacttttcttcattc-3’；
selac1a-oe-r：5’-gagctctcaacatttaggaaggtcgg-3’。
selac1b-oe-f：5’-ggatccatgggaacttttcttcattc-3’；
selac1b-oe-r：5’-gagctctcaacatttgggaaggtcag-3’。
亚细胞定位载体构建引物：
selac1a-sl-f：5’-gtcgacatgggaacttttcttcattc-3’；
selac1a-sl-r：5’-ggatccacatttaggaaggtcggctg-3’。
selac1b-sl-f：5’-gtcgacatgggaacttttcttcattc-3’；
selac1b-sl-r：5’-ggatccacatttgggaaggtcagctg-3’。
通过双酶切反应以及测序验证基因片段正确插入载体后，将selac1过表达和亚细胞定位载体转化农杆菌。
5、拟南芥转化及纯合株系筛选
参照zhang等人(2006)的方法，利用浸花法转化拟南芥，之后进行转基因拟南芥纯合株系的筛选，具体如下：
(1)成熟的转基因拟南芥t0代种子收取后，参照“1、材料培养”进行表面消毒，然后播种于含有25mg/l潮霉素(hygromycin，hyg)的1/2ms筛选培养基上。在4℃条件下暗处理3d后，转至光照条件下培养。种子萌发7d后挑选阳性苗移至普通1/2ms培养基上，培养约4-5天后，将幼苗移至蛭石/营养土中生长，直至种子成熟，分单株收取t1代种子。
(2)参照t0代种子，对t1代种子进行表面消毒和播种。种子萌发7d后对后代分离比进行统计，选择分离比为3:1的株系，将阳性苗先后转移至普通1/2ms培养基和蛭石/营养土中生长，直至种子成熟，分单株收取t2代种子。
(3)参照t0代种子，对t3代种子进行表面消毒和播种。种子萌发7d后，选择后代不分离的株系(即为纯合系)，对阳性苗进行转移和培养，直至收取t3代种子。
6、烟草瞬时表达体系的建立和selac1蛋白亚细胞定位的观察
(1)挑选含有亚细胞定位载体的农杆菌阳性克隆，菌液按1:100的比例接种于5ml含有50mg/lkan和50mg/lrif的lb液体培养基中扩大培养，然后按1:100的比例接种于25ml含有10mmmes，20μm乙酰丁香酮(acetosyringone，as)，50mg/lkan和50mg/lrif的lb液体培养基中活化，28℃，220rpm，过夜振荡培养至od600≈2.0。
(2)6,000rpm，离心10min，收集菌体。
(3)配制20mllb重悬液(含10mmmes，10mmmgcl2和200μmas)，取适量加入农杆菌，重悬，调节od600＝1.8-2.0，室温静置6h。
(4)挑选长势良好的本生烟草，从叶片背面用无菌注射器进行注射，每个样品注射侵染4-6片叶子。
(5)光照培养2-3d后，在莱卡激光扫描共焦显微镜下镜检。通过注射30％蔗糖溶液使烟草细胞发生质壁分离，比较观察selac1的蛋白亚细胞定位。
7、过表达拟南芥纯合株系selac1基因表达量检测
收取1/2ms培养基上生长约2周的野生型拟南芥和过表达纯合株系材料，用液氮研磨成粉末，参照transzol试剂(全式金公司)说明书进行rna提取，进行dna消化和反转录，并参照“3、selac1的基因表达量检测”，以野生型拟南芥为对照，对转基因拟南芥纯合株系的selac1基因表达量进行检测。
8、过表达拟南芥纯合株系漆酶活性测定
参照wang等人(2004)的方法，以2，2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸铵)(2,2'-azino-di-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonicacid)，abts，sigma公司)为底物，测定拟南芥野生型和过表达纯合株系的漆酶活性，每个样品4个生物学重复。具体如下：
(1)收取生长约2周的野生型拟南芥和过表达纯合株系材料，用液氮研磨。
(2)称取约1g材料，加入5ml蛋白缓冲抽提液(含有25mmmopsph7.0，0.2mcacl2)，4℃，100rpm，4h。
(3)4℃，16,000rpm，离心10min，上清即为蛋白粗提物。以牛血清蛋白为标准品，参照改良型braford法蛋白质浓度测定试剂盒(购自生工公司)说明书进行蛋白含量测定。
(4)取30μl蛋白粗提物于1.5ml离心管中(设定空白对照为30μl蛋白缓冲抽提液)，加入1.4ml检测缓冲液(含有100μmcucl2，50mmch3coona和2mg/mlabts，ph4.5)，30℃反应30min后，加入70μl冰醋酸终止反应。用分光光度计记录od420。根据朗伯比尔定律计算漆酶活性，用单位时间单位量的酶转化的abts表示，其中吸光系数ε420＝3.6×104m-1·cm-1。
9、转基因拟南芥纯合株系木质素含量测定和组分分析
取生长约6周的野生型拟南芥、lac4lac17双突变体、过表达和互补纯合株系的主茎材料，去除分枝、叶、果荚等，70℃烘干后用retschmm400研磨仪研磨成粉末，之后进行木质素含量的测定，具体如下：
(1)细胞壁提取：取60-70mg干粉于2ml离心管，每个样品3个生物学重复。加1.5ml70％乙醇，涡混，10,000rpm离心，10min；去上清，加1.5ml氯仿/甲醇(1:1，v/v)，振荡重悬，10,000rpm离心，10min；去上清，加500μl丙酮重悬，将样品置于氮吹仪中，35℃吹干；加1.5ml0.1m醋酸钠缓冲液(ph5.0)，重悬后80℃水浴加热20min，之后置于冰上冷却；依次添加35μl0.01％叠氮化钠、35μl50μg/ml淀粉酶(α-amylasefrombacillusspecies，sigma公司)、17μl支链淀粉酶(pullulanasefrombacillusacidopullulyticus，sigma公司)，涡混，37℃过夜振荡；100℃加热10min终止反应，10,000rpm离心，10min，弃上清；加1.5ml水，涡混，10,000rpm离心，10min，弃上清。重复清洗三次；加500μl丙酮重悬，将样品置于氮吹仪中，35℃吹干。干物质即为细胞壁抽提物。
(2)用retschmm400研磨仪将细胞壁干样研磨成粉末。称取1-1.5mg细胞壁于2ml离心管，每个细胞壁样品3个生物学重复。轻柔地沿管壁加入100μl新配制的乙酰溴溶液(25％乙酰溴/冰醋酸)，50℃孵育3h，之后冰上冷却至室温。设置不加细胞壁的空白对照。
(3)依次加入400μl2mnaoh，70μl新配制的0.5m盐酸羟胺，涡混，加冰醋酸补足至2ml，颠倒混匀。
(4)用unico紫外分光光度计读取od280，并计算木质素含量(％absl)，公式如下：
10、过表达拟南芥纯合株系的木质素组分分析
参照mansfield等人(2012)和文甲龙(2014)的研究，采用核磁共振的方法，以野生型拟南芥为对照，对过表达纯合株系oa和ob的木质素组分进行分析。具体如下：
(1)参照mansfield等人(2012)的方法，对野生型拟南芥、oa和ob的主茎材料(去除分枝、叶、果荚等)进行球磨以及溶剂抽提，获得纯化的木质素样品。
(2)样品溶解于氚代二甲基亚砜(dmso-d6)(15mg/0.5ml)后，用brukeravance-ⅲ400mhz光谱仪采集二维碳氢图谱(2dhsqc，即13c-1hhsqc)。1h和13c维度的采样点数分别取1024和256，碳氢耦合常数设定为145hz，弛豫时间设定为1.5s，累加64次。利用bruker-topspin2.1软件进行数据处理。
11、过表达拟南芥纯合株系木质素染色
参照berthet等人(2011)的方法，分别切取生长约6周的野生型拟南芥、过表达纯合株系oa11-5和ob4-2的茎和根材料，进行徒手切片。将切片浸于wiesner试剂(含1g/100ml间苯三酚的95％乙醇)中，5min，蒸馏水简单冲洗后用浓盐酸酸化1min，然后在olympuscx31光学显微镜下观察。
12、过表达拟南芥纯合株系半薄和超薄切片的制作和观察
切取生长约6周的野生型拟南芥和过表达纯合株系oa和ob相同部位的茎段和根段，进行半薄和超薄切片的制作。制作完成后分别用olympuscx31光学显微镜和jem-1230透射电子显微镜进行观察。
13、拟南芥材料在胁迫处理下的表型观察
以野生型拟南芥为对照，将萌发3d的拟南芥过表达纯合株系幼苗分别转移到1/2ms培养基和nacl胁迫培养基上，竖直培养10d后观察表型，并对根长和鲜重指标进行统计。
14、数据统计和分析
用spss24.0软件对采集的数据进行分析，采用邓肯检验(duncantest)或t-检验(student’st-test)进行差异分析，显著水平为5％。
二、实验结果与分析
1、selac1基因的克隆和表达模式分析
以盐角草cdna为模板对selac1全长cds进行克隆，经测序得到两条序列，命名为selac1a和selac1b，全长为1758bp和1755bp，分别编码585和584个氨基酸，蛋白序列相似性高达96.92％(图1中(a))。二者的区别在于atg下游649/650/651位，前者比后者多三个碱基gac即一个天冬氨酸(asparticacid，简写d)位点，其他位点也存在核苷酸和氨基酸的差异。对蛋白进行进行信号肽和结构域分析发现，二者n-端起始27个氨基酸为信号肽并且都含有3个保守的cu2+结合结构域(包含l1-l4特征序列)，以selac1a为例，其35-151位氨基酸对应cu2+结合结构域3，161-320位氨基酸对应cu2+结合结构域1，433-569位氨基酸对应cu2+结合结构域2。
selac1a基因如seqidno.3所示，该基因编码seqidno.1所示蛋白质。selac1b基因如seqidno.4所示，该基因编码seqidno.2所示蛋白质。seqidno.1的第1-27位和seqidno.2的第1-27位均为信号肽序列。
用200mmnacl处理盐角草，对基因表达量进行检测发现，在地上部分，nacl处理促进selac1表达，而在根中nacl短时处理导致selac1表达显著下调，随着处理时间的延长其表达量有所恢复(图1中(b))，该结果与转录组测序结果一致。
同源性分析发现，selac1a和selac1b与文献报道的拟南芥atlac17、短柄草bdlac5和甘蔗soflac处于进化树的同一分支，且二者与拟南芥atlac17聚类关系紧密，序列相似度可达65％(图1中(c))，推测selac1a和selac1b有可能参与催化木质素合成。
2、selac1蛋白的亚细胞定位
在targetp1.1server上对selac1a和selac1b的定位进行预测，发现二者均为分泌型蛋白。构建亚细胞定位载体(图2中(a))，利用烟草瞬时表达体系观察融合蛋白的定位，发现转化了selac1a-gfp和selac1b-gfp的烟草叶片细胞的细胞膜上可见明显的gfp荧光，同时在发生质壁分离的区域，细胞壁上也有明显的gfp荧光，说明selac1蛋白可以跨膜运输到细胞壁。相比之下，注射了空载体的叶片细胞中，仅在细胞膜上可以观察到荧光(图2中(b))。
3、selac1过表达和互补表达拟南芥株系的获得
受盐角草转化体系的局限，本发明选择在拟南芥中对selac1进行异源过表达。在构建过表达载体(图3中(a))转化野生型拟南芥后，经过逐代筛选分别获得了7个过表达selac1a和10个过表达selac1b的纯合株系(oetransgeniclines，分别以oa和ob标识)。分别选取4个oa和ob株系进行基因表达水平分析，发现过表达株系的selac1基因表达量普遍显著高于wt(图3中(b))。对应地也检测了不同株系的漆酶活性，发现相比野生型，oa和ob株系的漆酶活性都有显著提高(图3中(c))，与基因表达的结果保持一致，说明selac1在转基因拟南芥中成功表达。此外，利用相同的载体转化纯合的拟南芥lac4lac17双突变体，通过筛选，各获得7个互补纯合株系(cetransgeniclines，以ca和cb标识)。另外，本发明还将pcambia1301空载体导入野生型拟南芥中，得到转入空载体的株系，作为后续功能鉴定试验中转基因株系的空载对照。
4、转基因拟南芥木质素含量和组分测定
利用乙酰溴法测定过表达拟南芥纯合株系的木质素含量，发现相比野生型，oa和ob转基因植株的木质素含量显著提高(图4中(a))。相比野生型，拟南芥lac4lac17双突变体的木质素含量显著降低，而selac1a和selac1b的互补表达可以使木质素含量得到不同程度的恢复(图4中(b))。而空载对照株系中木质素含量与野生型基本一致，无统计学差异。这表明盐角草selac1可以催化木质素合成。
此外利用核磁共振技术分析了过表达纯合株系的木质素组分，如图5中(a)所示，oa和ob株系的单体s/g比例相较wt均显著上升，与之对应地单体分子间β-o-4连接的比例也有所升高，尤其ob株系β-o-4连接的比例高达73％(图5中(b))。而空载对照株系中单体s/g比例以及β-o-4连接的比例与野生型基本一致，无统计学差异。
5、selac1过表达拟南芥解剖结构的观察
利用徒手切片进行wiesner染色，发现相比野生型，oa和ob转基因植株茎和根的木质素着色均更深(图6中(a)和图7中(a))，与木质素含量测定的结果一致。进一步利用半薄切片对过表达纯合株系茎和根的解剖结构进行观察，发现与wt相比，oa和ob茎中木质部导管的数目明显增多(图6中(b)和(c))，经统计分别增加了28.59％和22.84％(图6中(d))，这表明过表达selac1对拟南芥茎木质部导管的发育具有促进作用。而在根中，三者在结构上没有明显可见的不同，统计数据显示木质部导管数目略有差异(图7中(b)和(c))。而空载对照株系的茎和根的木质素着色深浅、茎和根中木质部导管的数目均与野生型基本一致，无统计学差异。这种结构上的变化提示我们，转基因拟南芥可能通过茎中更加发达的导管系统将吸收的nacl分配到地上部分的其他器官中，从而提高植株对nacl的耐受性。
利用超薄切片对过表达纯合株系木质部导管细胞的亚显微结构进行观察。镜检发现，在茎中野生型和过表达纯合株系导管细胞的形态结构无明显差别(图8中(a))，但在根中oa和ob株系的导管细胞壁相比wt明显增厚(图8中(b))。利用imagej软件对分别对导管细胞初生壁和次生壁的厚度进行统计，数据显示无论初生壁还是次生壁，其厚度在oa和ob茎中与wt中持平，而在根中oa的导管细胞初生壁和次生壁相比wt分别增厚25.90％和13.07％，ob则分别增加了37.68％和35.87％(图8中(c)和(d))。而空载对照株系的茎和根导管细胞的形态结构均与野生型基本一致，无统计学差异。这种结构上的变化提示我们，转基因拟南芥可能通过提高根中导管细胞壁的厚度减少植株对nacl的吸收，从而降低nacl对根的离子胁迫。
6、selac1过表达拟南芥在nacl处理下的表型
对wt和selac1过表达拟南芥株系进行150mmnacl处理，以不加nacl为对照，发现正常情况下，oa和ob地上部分的生长和根的伸长与wt差别不大；在150mmnacl处理下，oa和ob地上部分的生长明显好于wt，统计发现oa和ob的鲜重在150mmnacl下普遍高于wt，其中oa1-12，oa10-11以及ob1-6与wt之间存在显著差异(图9)。而空载对照株系的地上部分的生长和根的伸长情况均与野生型基本一致，无统计学差异。
三、结论
本发明首次从盐角草中克隆了编码木质素合成途径关键酶-漆酶的基因selac1，序列分析发现selac1与拟南芥atlac17同源性较高。通过烟草瞬时表达体系对selac1蛋白亚细胞定位的观察发现selac1与gfp的融合蛋白定位于细胞膜和细胞壁中，推测selac1蛋白可以跨膜运输到细胞壁。过表达selac1导致转基因拟南芥漆酶活性和木质素含量均显著提高，与野生型拟南芥相比，selac1过表达植株对盐的敏感性降低，而在lac4lac17突变体中selac1的互补表达也可以使木质素含量得到不同程度的恢复，表明selac1可以催化木质素合成。此外，在selac1过表达植株的茎中导管数目增加，根中导管细胞的初生壁和次生壁增厚，表明selac1可能通过不同机制调节转基因拟南芥地上部分和根的发育，从而提高植株对nacl的耐受性。
综上，盐角草selac1可能通过催化木质素合成，促进木质部导管分化及细胞壁形成参与植物的抗盐响应过程。盐角草selac1基因可在提高植物耐盐性的基因工程改造和育种实践中发挥作用。
<110>中国科学院植物研究所
<120>一种盐角草漆酶及其编码基因和应用
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