一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法与流程

本发明具体涉及一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法，属于微生物发酵工程技术领域。

背景技术：

芽孢杆菌是一类耗氧或者兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，因其产生抗逆性的芽孢而使其成为一类特别的微生物类群。因其稳定性很强，并且能够在人和动物胃肠道存活并萌发代谢，作为活的微生物添加剂现已广泛用于人类医药、动物饲料中，对于保障机体健康，调节肠道微生物平衡，增加免疫力等方面具有积极作用。

与其他非芽孢微生物不同，芽孢杆菌的芽孢是营养细胞生长到后期产生的一个休眠体，因其生长环境中营养缺乏、细胞累积等因素而大量产生。同时也会受到培养基或者发酵条件中的金属离子浓度、碳氮源的组成、氧的供给等因素影响。作为一种微生物活菌制剂，在工业化生产时，既需要控制条件使得其发酵环境中芽孢最大限度的积累，又需要尽可能降低生产成本，从而实现工业生产和应用利润的最大化。

已有研究表明，一些金属离子对于某些芽孢杆菌芽孢的形成具有显著影响，在芽孢发酵培养基中添加合适的金属离子可以有效提高芽孢含量。因此，通过优化选择金属离子类型及其添加浓度为芽孢的发酵产量提高提供了一种可靠途径。

现在很多的生物发酵研究都是采用的统计软件精心构建高效实验设计来进行微生物发酵的优化，这种优化方法在较少的试验次数的基础上采用数学模拟和优化，大大简化了试验步骤，还提高了准确性。但对于芽孢的发酵而言，通常也都是采用平板计数的传统方法来测定芽孢浓度作为试验设计的响应值。以一次4因素的响应面设计为例，如果中心点采用三次重复，往往最少需要27次试验，为了确保实验设计的可靠性，另需要2次重复，这样基本上就需要54次平行试验的芽孢测试结果。平板计数时，又需要最少采用三个稀释度，每个稀释度要3个平行，这样就需要一次性涂琼脂平板486个。因此工作量巨大，又要求同步完成，培养周期长，人为因素误差较大，这些因素对芽孢优化设计造成了巨大障碍，试验结果的准确性难以得到保证。因此，探索一种简单反应芽孢浓度的方式并用于其芽孢生产的优化设计的方法，对于芽孢类的生物制剂生产具有重要意义。

技术实现要素：

在芽孢杆菌的芽孢发酵生产中，为提高芽孢发酵浓度，降低生产成本，需要根据不同菌株的特点进行营养和生产条件优化。在优化设计过程中，针对传统的芽孢平板定量计数方法工作量大、耗时长的特点，为了增强芽孢杆菌发酵代谢转化芽孢的能力，提高在发酵优化时试验设计的效率，本发明提供了一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法，以为芽孢类的生物制剂工业化生产奠定基础。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法，包括以下步骤：

(1)单因子试验设计：在基础培养基的基础上，分别选取不同的可能对芽孢生成起到促进作用的金属离子，分别改变其在发酵液中的最终摩尔浓度，经过36h-60h发酵培养后，用移液器取其芽孢悬液1毫升，洗涤该芽孢悬液，用于芽孢dpa荧光强度的检测；

(2)芽孢悬液的处理及荧光检测：芽孢悬液采用诱导芽孢萌发的方法促进重悬液中芽孢清液经过一定程度稀释后测定其荧光强度；将上清液稀释后与eucl3和环己二胺四乙酸充分混合均匀，采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度，测定过程中激发波长范围260～280nm，发射波长范围610～630nm；

(3)显著性因子的筛选：以芽孢dpa荧光强度为响应值，对单因子试验设计中能影响到芽孢发酵的金属离子进行筛选，选取离子浓度改变时对荧光强度产生显著增强的金属离子类型及其最适的添加浓度；

(4)采用中心组合设计，确定金属离子的组合效应，实现在一定的离子浓度组合情况下芽孢产量的最大化：根据单因子试验设计的实验结果，以显著正效应的金属离子及其最大荧光强度效应时的浓度作为响应面优化实验因素的中心点，采用统计软件box-benhnken设计或者中心组合设计进行实验设计，以芽孢释放产生的dpa荧光强度作为响应值，对响应面模型进行方差分析，确定离子组合效应及对芽孢发酵产生的dpa荧光强度最大值。

进一步地，其中所述芽孢杆菌为淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciensbs-20，所述解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciensbs-20已于2017年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc：m2017587，分类命名为解淀粉芽孢杆菌bs-20(bacillusamyloliquefaciensbs-20)。

进一步地，其中步骤(1)中该芽孢悬液的洗涤包括：将移取的1毫升芽孢悬液于6000rpm下离心10分钟后，用缓冲液重悬到该缓冲液中再于6000rpm下离心10分钟，重复上述的重悬、离心步骤。

进一步地，其中步骤(2)中芽孢悬液芽孢萌发的方法为物理方法，具体为灭菌、微波处理或超声破碎；或者为化学诱导剂混合培养法，所述化学诱导剂具体为肌苷、l-丙氨酸、溶菌酶或吡啶二羧酸钙。

进一步地，其中所述诱导芽孢萌发的方法具体为高温高压灭菌法，包括：将重悬液置于密闭容器中，然后置于高压灭菌锅内在不低于100℃的温度下处理5～10分钟。

进一步地，其中所述化学诱导剂混合培养法包括：用100mm的诱导剂在200rpm下振荡3h以上，悬浮芽孢以制成芽孢悬液。

进一步地，其中步骤(2)中稀释后的上清液、eucl3和cydta三者的体积比为1：4.5：4.5；其中eucl3和环己二胺四乙酸均采用缓冲液配制成浓度为2mm。

进一步地，其中步骤(2)中荧光强度检测条件参数为：扫描速度3000nm/min，ex狭缝10.0nm，em狭缝5.0nm，光电倍增管电压700v，响应0.08s。

进一步地，其中步骤(4)中所采用的统计软件为designexpert、jmp或statistica等现行各版本的软件。

进一步地，其中步骤(1)～(4)中所述的缓冲液为50mmol/l，ph8.0的tris-hcl缓冲液。

进一步地，其中步骤(1)～(4)中所述的金属离子包括铜离子、铁离子、钙离子、锰离子和镁离子。

进一步地，其中dpa荧光强度的测定可以基于现有的所有基于dpa荧光检测技术，也可以是本发明的检测技术。

本发明具有以下有益效果：

在本发明中，由于2，6-吡啶二羧酸(dpa)是芽孢特有的成分，dpa的浓度实际上反应的就是芽孢的浓度。与现有的芽孢平板涂布计数的方式相比，采用dpa的荧光强度来作为试验设计时相应的响应值，一方面能代表不同试验处理时芽孢的真实浓度，另一方面能够实现响应值的快速测定，并亦可采用多孔板实现对活芽孢浓度的高通量定量检测，特异性强，响应值可靠。

附图说明

图1为本发明芽孢cfu/ml浓度值与释放的dpa荧光强度关系曲线；

图2为本发明实施例4锰离子和钙离子交互作用的等高线图和响应面图；

图3为本发明实施例4锰离子和亚铁离子交互作用的等高线图和响应面图；

图4为本发明实施例4钙离子和亚铁离子交互作用的等高线图和响应面图。

具体实施方式

下面结合实施例解释本发明，实施案例仅用于说明本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

实施例1

本实施例中首先确定了在金属离子优化设计中响应值芽孢浓度dpa荧光强度的测定方法。将发酵液用tris-hcl(50mm，ph8.0，下同)洗涤2次后重悬，采用灭菌锅中121℃处理5分钟促进芽孢中dpa在缓冲液中的完全释放，离心后收集上清，对上清液用tris-hcl缓冲液进行一定比例的梯度稀释，取稀释液与eucl3和cydta充分混合均匀(三者比例为1：4.5：4.5)，空白对照为缓冲液与eucl3和cydta的混合液(三者比例为1：4.5：4.5)，采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度。如果以已知初始活菌浓度的芽孢悬液为基础，依次进行2倍梯度稀释，分别测定其对应的dpa荧光强度，可以确定活菌浓度与dpa荧光强度的关系曲线。以解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciensbs-20为例，其线性关系如图1所示，从图1中可以看出其线性良好，相关系数r²为0.9999。检测限为8000cfu/ml。所述解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciensbs-20已于2017年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072)，保藏编号为cctcc：m2017587，分类命名为解淀粉芽孢杆菌bs-20(bacillusamyloliquefaciensbs-20)。

实施例2

在基础培养基的基础上，分别选取可能影响到芽孢产生的不同金属离子，如mn²⁺、ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺、cu²⁺、fe³⁺、fe²⁺等，分别改变其在发酵液中的终浓度，如0.5mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm，经过一定时间发酵培养后，取其芽孢悬液，经2次洗涤后重悬到缓冲液中，按照实施例1中的方式测定dpa荧光强度。本实施例中采用本单位保藏的一株解淀粉芽孢杆菌b.amyloliquefaciensbs-20，以其作为发酵菌株，初始培养基(葡萄糖8g/l,牛肉浸粉7.2g/l,nacl10g/l,ph7.0.)的基础上，选择了6种可能影响到芽孢发酵的金属离子：mn²⁺、ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺、fe³⁺、fe²⁺，配制不同的离子终浓度，装液量为50ml/250ml，37℃，200rpm。以初始培养基作为对照，测定发酵48h后芽孢悬液中dpa的荧光强度。

表1金属离子单因子实验设计及对b.amyloliquefaciensbs-20芽孢荧光强度的影响

表1中同列下角标字母不同表面与对照组有显著差异(p<0.05)。荧光强度值为稀释100倍后的测定值，实验结果均为三次平行试验结果的平均值，以平均值±标准差的方式来表示。结果中fe²⁺、mn²⁺、ca²⁺、mg²⁺分别在2.0mm、1.0mm、2.0mm、3.0mm时荧光强度值显著达到最大，以这些离子和水平做进一步的响应面设计。

实施例3

针对实施例2中筛选出的金属离子及其浓度，采用jmp11软件采用centralcompositedesign实验设计，设置三个中心点，以得到的发酵液产生的dpa荧光强度为响应值(y)，试验方案及其结果见表2。每个因子设置了5个水平，从低到高分别是：-a，-，0，+，a，其轴向值设置为1.483，即分别是低星点，低中心点，中心点，高中心点和高星点。

表2centralcompositedesign实验设计及其响应结果

表2中荧光强度值为稀释1000倍后的测定值，实验值均为二次平行试验结果的平均值，以平均值±标准差的方式来表示。

实施例4

根据所得数据进行多元回归分析，得到金属离子变量与荧光强度响应值之间的多元二次回归方程。

其中x1、x2、x3、x4分别代表mn²⁺、fe²⁺、ca²⁺、mg²⁺。

各因子与响应值之间线性关系显著性，由p>f值检验来判定，p值越小，则说明变量的显著性越高。由方差分析表(表3)可知，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著，模型的显著水平小于0.0001,所以该回归方差模型是极显著的。此外，与mn²⁺、fe²⁺、ca²⁺相关的一次项和二次项均达到了显著水平，故出于减少培养基组分的考虑，可以剔除掉mg²⁺，对最终试验结果无显著性影响。

表3实验设计的方差分析表

根据ccd实验设计结果及回归方程作出三维响应图(见图2，图3，图4)，分别反映了mn²⁺、fe²⁺、ca²⁺这三个显著性因子的两两交互作用对响应值的影响。从响应面分析得知，当mn²⁺、fe²⁺、ca²⁺因素水平分别在1.0mm、3mm、2.0mm时，荧光强度预测响应的最大值为300.2au。

实施例5

在最优化的离子组合条件下，平行完成三次验证试验，并以基础培养基作为对照，分别测定其荧光强度值和平板计数菌落数，将实测的荧光强度值根据图1的标准曲线换算成菌落浓度值，并与实际通过平板计数的菌落浓度值对比(表4)。实验荧光强度值与预测荧光强度值接近(303.3/300.2au)，相对优化前荧光强度值增加了3.1倍；根据标准曲线换算的菌落浓度值与实际测定的菌落浓度值接近，并且按照实际检测的芽孢菌落浓度值，其芽孢水平增加了3.4倍。

表4荧光强度测定与平板菌落计数测定分别对试验设计的验证

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。