本发明涉及一种沼气发酵促进菌剂的制备方法，属于有机废弃物利用和可再生能源生产技术领域。
背景技术：
作为地面生物质可再生资源，沼气的有着悠久的使用历史。不过，随着对沼气产气技术的经济化、科学化的要求日益提高，许多相关技术得到了发展。其中，对于沼气促进剂的研究是一个热点。
目前主要的促进剂可简单的分为化学物质促进剂和菌剂促进剂。
化学物质促进剂的主要研发思路在于促进产甲烷菌的生长，提高其产气效率，如授权号为cn103642846b的中国专利和公开号为cn102925493a的中国专利。
菌剂促进剂的研发是近些年来的重要方向，其具有成本低、可重复利用、后处理较为方便和较为环保等优点，诸如授权号为cn102876618b的中国专利在这方面进行了有益的探索。
除此之外，将化学物质促进剂和菌剂促进剂联用也是研究方向之一，如公开号为cn107022576a的中国专利。
然而，在菌剂促进剂方面，本领域的研究尚未成熟，在产气效率、产气周期及原料适应性方面的技术效果提高还有较大空间。
另外，一些促进剂虽然具有较好的效果，但其所用的菌株较难获得或需要进行严苛的分离培育工作，影响了其推广应用。
因此，本领域亟待一种简单易得、可在产气效率的提高和产气周期的控制有所突破的沼气促进菌剂。
在获得所述菌剂配方时，针对性的设计相应科学的菌剂制备方法也是必要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种应用于沼气发酵的促进菌剂的制作方法，将该促进菌剂投入到发酵罐中，能显著的改善发酵状况，提高原料产气率和容积产气率。
为实现上述目的，本发明提供了一种沼气发酵促进菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将接种物与发酵底物混合，于32～37℃条件下，进行厌氧发酵50天，即得；
所述接种物的制备方法为：
按微生物培养液体积份数计，将如下微生物培养液混合：
厚壁菌15～20份、拟杆菌15～20份、螺旋体菌3～5份、热袍菌4～6份、变形菌3～5份、互养菌3～5份、纤维杆菌3～5份、广古菌35～40份；
所述发酵底物为农业有机废弃物。
所述农业有机废弃物包括禽畜粪便、稻草、小麦秸秆、玉米秸秆中的至少一种。
所述秸秆需进行粉碎至粒径不超过1cm。
所述接种物与发酵底物的重量比为1:10。
所述厚壁菌为居瘤胃解蛋白质菌proteiniclasticumruminisdsm24773、棕榈酸互营单胞菌syntrophomonaspalmitaticadsm18709t和大岛粪热杆菌caldicoprobacteroshimaidsm21659t；
和/或，所述拟杆菌为巨济嗜纤维素菌cellulophagageojensisccug60801t和糖酵解蛋白杆菌proteiniphilumsaccharofermentansdsm28694t；
和/或，所述螺旋体为栖温泉螺旋体treponemaprimitiadsm13862；
和/或，所述热袍菌为突尼斯废水袍菌defluviitogatunisiensisdsm23805t；
和/或，所述变形菌为产气肠杆菌enterobacteraerogenesdsm-30053；
和/或，所述互养菌为哥伦比亚氨基酸杆菌aminobacteriumcolombiensedsm-12261；
和/或，所述纤维杆菌为产琥珀酸丝状杆菌fibrobactersuccinogenesatcc19169；
和/或，所述广古菌包括马氏甲烷球菌methanosarcinamazeidsm2053t、氢营养型甲烷袋状菌methanoculleushydrogenitrophicusjcm16311t和古生甲烷微球菌methanomicrobiumantiquumdsm21220t。
所述居瘤胃解蛋白质菌的培养液体积份数为5～10份，棕榈酸互营单胞菌的培养液体积份数为3～5份，大岛粪热杆菌的培养液体积份数为5～10份，上述三种微生物培养液体积份数之和为15～20份；
所述巨济嗜纤维素菌的培养液体积份数为7～12份，所述糖酵解蛋白杆菌的培养液体积份数为7～12份，上述两种微生物培养液体积份数之和为15～20份；
所述马氏甲烷球菌的培养液体积份数为28份，所述氢营养型甲烷袋状菌的培养液体积份数为5份，所述古生甲烷微球菌的培养液体积份数为2份。
所述微生物培养液中细胞含量不低于1.0×108个/ml。
(1)proteiniclasticumruminis居瘤胃解蛋白质菌，发酵温度24–46℃(最佳温度38–39℃，ph生长范围5.6～8.7(最佳ph范围7.0–7.3)。利用大豆蛋白胨、胰蛋白胨、各种氨基酸作为碳源和氮源，不利用糖类化合物，菌种保藏编号为dsm24773。
(2)syntrophomonaspalmitatica棕榈酸互营单胞菌，与氢营养型产甲烷菌共培养，能氧化长链脂肪酸为短链脂肪酸，菌种保藏编号为dsm18709t。
(3)caldicoprobacteroshimai大岛粪热杆菌，生长温度为44-77℃，ph生长范围为5.9-8.6.利用木糖、葡萄糖、半乳糖、纤维二糖、棉子糖和木聚糖作为底物，并将其转化为乳酸、乙酸、乙醇、co2和h2，菌种保藏编号为dsm21659t。
(4)cellulophagageojensis巨济嗜纤维素菌，水解琼脂、酪蛋白、羧甲基纤维素、明胶、淀粉等。利用纤维素、d-果糖、d-半乳糖、d-葡萄糖、麦芽糖、d-甘露糖、盐碱、蔗糖、海藻糖、d-木糖和l-谷氨酸等作唯一的碳和能源来源，产生挥发性脂肪酸。菌种保藏编号为ccug60801t。
(5)proteiniphilumsaccharofermentans糖酵解蛋白杆菌，生长温度为15-45℃(最佳温度范围为35-40℃)，ph范围6.3-9.1(最佳ph范围7.5-7.8)，革兰氏阴性，兼性厌氧。利用蛋白胨、葡萄糖、阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、鼠李糖、蔗糖、海藻糖和淀粉生产乙酸、丙酸、戊酸、co2和h2。菌种保藏编号为dsm28694t。
(6)treponemaprimitia栖温泉螺旋体，生长最佳温度是30℃。利用葡萄糖、果糖、核糖、木糖、麦芽糖和纤维二糖。生成乙酸、乙醇、co2和h2，菌种保藏编号为dsm13862。
(7)defluviitogatunisiensis突尼斯废水袍菌，生长温度范围为37-65℃，ph值范围为6.5-7.9(最佳ph值6.9)；利用阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、棉子糖、核糖、蔗糖、木糖、微晶纤维素、木聚糖、酵母提取物等生产乙酸、h2和co2。菌种保藏编号为dsm23805t。
(8)enterobacteraerogenes产气肠杆菌，利用d-葡萄糖等作底物，发酵葡萄糖产生乙酸、h2和co2。菌种保藏编号为dsm-30053。
(9)aminobacteriumcolombiense哥伦比亚氨基酸杆菌，最适生长温度为37℃，最适生长ph值为7.3.主要以氨基酸为底物，不能代谢和利用糖类。菌种保藏编号为dsm12261。
(10)fibrobactersuccinogenes产琥珀酸丝状杆菌，利用葡萄糖、纤维二糖和纤维素生产琥珀酸、乙酸和少量甲酸。菌种保藏编号为atcc19169。
(11)methanosarcinamazei马氏甲烷球菌，最适生长温度30-40℃，利用乙酸、甲醇、甲胺生产甲烷。菌种保藏编号为dsm2053。
(12)methanoculleushydrogenitrophicus氢营养型甲烷袋状菌，生长温度范围为18-45℃(最适温度37℃)，ph生长范围为5.0-8.5(最适生长ph范围为6.6)；只能利用h2和co2生产甲烷。菌种保藏编号为jcm16311t。
(13)methanomicrobiumantiquum古生甲烷微球菌，生长温度范围为15-40℃(最适温度35℃)，ph值范围为5.9-7.9(最适ph值为7.0-7.5)，利用甲酸、h2和co2生产甲烷。菌种保藏编号为dsm21220t。
本发明的有益效果：
本发明的发酵促进剂可以满足不同类型原料的要求，菌剂的发酵底物选自农业有机废弃物，成本低廉；本发明以沼气发酵促进菌剂生产线作为接种和预处理的手段，优化了生产工艺，大幅度减少了人力成本和时间成本；本发明的菌剂制备过程采用干式厌氧发酵，制得的成品水分含量低，便于贮存和运输。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明的实施例中“细胞总数(个/克)”指每克本发明所述菌剂中含功能微生物的细胞数量总和；“产甲烷菌数(个/克)”指每克本发明所述菌剂中含产甲烷古菌的细胞数量。
以下实施例中，所述居瘤胃解蛋白质菌为proteiniclasticumruminisdsm24773；所述棕榈酸互营单胞菌为syntrophomonaspalmitaticadsm18709t；所述大岛粪热杆菌为caldicoprobacteroshimaidsm21659t；所述巨济嗜纤维素菌为cellulophagageojensisccug60801t；所述糖酵解蛋白杆菌为proteiniphilumsaccharofermentansdsm28694t；所述栖温泉螺旋体为treponemaprimitiadsm13862；所述突尼斯废水袍菌为defluviitogatunisiensisdsm23805t；所述产气肠杆菌为enterobacteraerogenesdsm30053；所述哥伦比亚氨基酸杆菌为aminobacteriumcolombiensedsm12261；所述产琥珀酸丝状杆菌为fibrobactersuccinogenesatcc19169；所述马氏甲烷球菌为methanosarcinamazeidsm2053t；所述氢营养型甲烷袋状菌为methanoculleushydrogenitrophicusjcm16311t；所述古生甲烷微球菌为methanomicrobiumantiquumdsm21220t。
实施例1
以重量比1:1的新鲜猪粪和稻草粉作发酵底物。作为接种物的复合菌中各功能微生物的培养液按体积份数计，分别为：居瘤胃解蛋白质菌的培养液体积份数为8份，棕榈酸互营单胞菌的培养液体积份数为4份，大岛粪热杆菌的培养液体积份数为8份，巨济嗜纤维素菌的培养液体积份数为10份，糖酵解蛋白杆菌的培养液体积份数为10份，栖温泉螺旋体的培养液体积份数为5份，突尼斯废水袍菌的培养液体积份数为5份，产气肠杆菌的培养液体积份数为5份，哥伦比亚氨基酸杆菌的培养液体积份数为5份，产琥珀酸丝状杆菌的培养液体积份数为5份，马氏甲烷球菌的培养液体积份数为28份，氢营养型甲烷袋状菌的培养液体积份数为5份，古生甲烷微球菌的培养液体积份数为2份。按1吨发酵底物加入0.1立方米的比例将组配好的复合菌作为接种物加入，利用沼气发酵促进菌剂生产线进行接种和预处理，然后在序批式干发酵罐中于32～37℃条件下培养，50天后取样计数。结果如表1所示：
表1
实施例2
以质量比2:1的新鲜牛粪和稻草粉作发酵底物。作为接种物的复合菌中各功能微生物的体积搭配比例分别为：居瘤胃解蛋白质菌的培养液体积份数为5份，棕榈酸互营单胞菌的培养液体积份数为5份，大岛粪热杆菌的培养液体积份数为10份，巨济嗜纤维素菌的培养液体积份数为12份，糖酵解蛋白杆菌的培养液体积份数为8份，栖温泉螺旋体的培养液体积份数为5份，突尼斯废水袍菌的培养液体积份数为6份，产气肠杆菌的培养液体积份数为5份，哥伦比亚氨基酸杆菌的培养液体积份数为5份，产琥珀酸丝状杆菌的培养液体积份数为5份，马氏甲烷球菌的培养液体积份数为25份，氢营养型甲烷袋状菌的培养液体积份数为6份，古生甲烷微球菌的培养液体积份数为3份。按1吨发酵底物加入0.1立方米的比例将组配好的复合菌作为接种物加入，利用沼气发酵促进菌剂生产线进行接种和预处理，然后在序批式干发酵罐中于32～37℃条件下培养，50天后取样计数。结果如表2所示：
表2
实施例3
以质量比1:1的新鲜猪粪和玉米秸秆粉作发酵底物。作为接种物的复合菌中各功能微生物的体积搭配比例分别为：居瘤胃解蛋白质菌的培养液体积份数为8份，棕榈酸互营单胞菌的培养液体积份数为4份，大岛粪热杆菌的培养液体积份数为7份，巨济嗜纤维素菌的培养液体积份数为9份，糖酵解蛋白杆菌的培养液体积份数为10份，栖温泉螺旋体的培养液体积份数为5份，突尼斯废水袍菌的培养液体积份数为5份，产气肠杆菌的培养液体积份数为5份，哥伦比亚氨基酸杆菌的培养液体积份数为4份，产琥珀酸丝状杆菌的培养液体积份数为3份，马氏甲烷球菌的培养液体积份数为30份，氢营养型甲烷袋状菌的培养液体积份数为6份，古生甲烷微球菌的培养液体积份数为4份。按1吨发酵底物加入0.1立方米的比例将组配好的复合菌作为接种物加入，利用沼气发酵促进菌剂生产线进行接种和预处理，然后在序批式干发酵罐中于32～37℃条件下培养，50天后取样计数。结果如表3所示：
表3