一种三疣梭子蟹血细胞分离方法与流程

本发明涉及一种细胞分离技术，尤其是涉及一种三疣梭子蟹血细胞分离方法。

背景技术：

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)俗称白蟹、枪蟹，隶属于甲壳动物亚门(Crustacea)，软甲纲(Malacostraca)，十足目(Decapoda)，梭子蟹科(Portunidae)，梭子蟹属(Portunus)，其广泛分布于中国、日本、朝鲜及马来西亚群岛等海域，是我国重要的海产经济蟹类。近年来三疣梭子蟹病害频发，据统计在各类病害中尤以细菌、病毒及寄生虫等病原性病害为主，给我国水产养殖业和沿海经济造成了重大损失。目前，有关海洋甲壳类先天性免疫相关的基础研究逐渐增多，以加快无脊椎动物疾病免疫防治进程。细胞分离和培养技术在研究动物免疫、疾病的致病机理以及防控中极其重要，然而该技术在海洋无脊椎动物的研究中受到了极大地限制，严重阻碍了海洋无脊椎动物免疫功能及相关机制的研究。

甲壳动物的主要免疫组织或者器官为其血淋巴和血细胞，而甲壳动物细胞免疫则主要由血细胞来承担。目前广泛认可的一个观点是：虾蟹类甲壳动物血细胞具有透明细胞、小颗粒(半颗粒)细胞和大颗粒细胞3大类。其中，透明细胞个体最小，细胞质中几乎不含有颗粒，主要参与吞噬作用；小颗粒细胞含有小的嗜酸性颗粒，并且参与早期的识别、凝固以及部分的吞噬；大颗粒细胞具有酚氧化酶原系统活性，在受到免疫刺激可以激活酚氧化酶原，同时具有细胞毒性作用。目前，有关虾类血细胞分离技术已经有了相应的研究。如：段虎等利用Percoll分离液采用两步密度梯度离心法可将红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)血细胞分离开来。又如：Dantas-Lima等人利用碘克沙醇作为细胞分离液对凡纳滨对虾的血细胞进行分离，发现要将其3种血细胞完全分离开来也同样需要两步梯度离心法。目前，国内外尚没有采用一步密度梯度离心法将3种血细胞完全分离开来的相关技术报道，国内外也尚没有开展有关蟹类血细胞分离技术的研究。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种三疣梭子蟹血细胞分离方法，其只需一步密度梯度离心就可将三疣梭子蟹的三种血细胞完全分离出来，且分离出来的血细胞的活性好。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种三疣梭子蟹血细胞分离方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，细胞分离液的制备：

1_1、配置体积摩尔浓度为0.1M的PBS缓冲溶液；

1_2、利用体积摩尔浓度为3M的氯化钠溶液调节PBS缓冲溶液的渗透压为900mOs·mol/kg，得到等渗液；

1_3、将等渗液作为稀释液，稀释体积百分浓度为60％的碘克沙醇，梯度配置体积百分浓度分别为10％、15％和20％的三种碘克沙醇液；

1_4、采用垫层技术，将体积百分浓度分别为10％、15％和20％的三种碘克沙醇液依次等量加样到离心管中，使两两之间形成分离面，形成不连续密度梯度液；

1_5、将不连续密度梯度液置于4～6℃温度环境下静置12～18小时后，形成连续密度梯度液，将该连续密度梯度液作为细胞分离液；

步骤二，三疣梭子蟹血细胞的采集：

2_1、使用抗凝剂润洗无菌注射器；

2_2、使用润洗后的无菌注射器，从暂养的三疣梭子蟹的步足关节处抽取血淋巴液，与润洗后的无菌注射器中预留的抗凝剂1:1混匀，再将混合液置于离心管中；

2_3、在室温下对混合液进行1000～1200g离心处理2～3min后，去上清，得到细胞沉淀物；

2_4、将步骤1_2得到的等渗液作为细胞悬液，将步骤2_3得到的细胞沉淀物与细胞悬液充分混匀后得到三疣梭子蟹全血细胞悬液；

步骤三，三疣梭子蟹血细胞的分离：

3_1、取三疣梭子蟹全血细胞悬液缓慢加到细胞分离液上，其中，三疣梭子蟹全血细胞悬液与细胞分离液的体积比为1:5～4；

3_2、在4～6℃温度环境下进行2200～2400g离心处理14～16min后，三疣梭子蟹血细胞被分成三层，最上层为透明细胞层，中间层为小颗粒细胞层，最下层为大颗粒细胞层。

所述的步骤2_1中的抗凝剂为ACD抗凝剂。

在所述的步骤3_2后，对分离出的透明细胞层中的透明细胞溶液、小颗粒细胞层中的小颗粒细胞溶液、大颗粒细胞层中的大颗粒细胞溶液进行细胞分离液洗涤，以保持更好的活性，具体过程为：从透明细胞层中吸取出透明细胞溶液，加入体积为吸取出的透明细胞溶液体积的3倍的等渗液，在4～6℃温度环境下进行1100～1300g离心处理2～3min后，去上清，得到沉淀物；然后在沉淀物中加入体积为沉淀物的体积的3倍的等渗液，在4～6℃温度环境下进行1100～1300g离心处理2～3min后，去上清，得到洗脱细胞分离液后的透明细胞溶液；以相同的方式，获取洗脱细胞分离液后的小颗粒细胞溶液和洗脱细胞分离液后的大颗粒细胞溶液。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1)本发明方法由三种不同体积百分浓度的碘克沙醇液通过垫层技术并经静置形成连续密度梯度液作为细胞分离液，利用细胞分离液将采集的三疣梭子蟹血细胞的三种血细胞分离开来，只采用了一步密度梯度离心，不仅操作简单，而且通过实验发现分离出来的血细胞的活性好，可用于细胞培养。

2)通过实验发现本发明方法的分离效率高，能够几乎完全将三种血细胞分离开，三种血细胞的分离率达到了95％以上。

3)本发明方法为蟹类细胞免疫、病原致病机制及病害防控等多项研究的开展提供了较好的工具。

附图说明

图1为三疣梭子蟹血细胞经分离得到的透明细胞、小颗粒细胞、大颗粒细胞在细胞分离液中的分布；

图2a为三疣梭子蟹血细胞经分离得到的透明细胞经Giemsa染色后的形态；

图2b为三疣梭子蟹血细胞经分离得到的小颗粒细胞经Giemsa染色后的形态；

图2c为三疣梭子蟹血细胞经分离得到的得到大颗粒细胞经Giemsa染色后的形态；

图3a为三疣梭子蟹血细胞经分离得到的透明细胞的细胞贴壁及体外培养形态；

图3b为三疣梭子蟹血细胞经分离得到的小颗粒细胞的细胞贴壁及体外培养形态；

图3c为三疣梭子蟹血细胞经分离得到的得到大颗粒细胞的细胞贴壁及体外培养形态。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例一：

本实施例提出的一种三疣梭子蟹血细胞分离方法，其包括以下步骤：

步骤一，细胞分离液的制备：

1_1、配置体积摩尔浓度为0.1M的PBS缓冲溶液。

1_2、利用体积摩尔浓度为3M的氯化钠溶液调节PBS缓冲溶液的渗透压为900mOs·mol/kg，得到等渗液。其中，可取PBS缓冲溶液10ml，取氯化钠溶液1.2ml。

1_3、将等渗液作为稀释液，稀释体积百分浓度为60％的碘克沙醇(OptiPrep^TM)，梯度配置体积百分浓度分别为10％、15％和20％的三种碘克沙醇液。

1_4、采用现有的垫层技术，将体积百分浓度分别为10％、15％和20％的三种碘克沙醇液依次等量加样到离心管中，使两两之间形成分离面，形成不连续密度梯度液。

在此，不连续密度梯度液的具体获取过程为：采用针头为10cm的注射器作为加样器，若三种碘克沙醇液各需要加样2.5ml，则先用注射器吸入3.5ml的体积百分浓度为10％的碘克沙醇液，加样前排出部分，至3ml，确保针头充满液体，防止气泡进入；然后擦干针管，沿着离心管(15ml)壁，缓缓移动针头至离心管底部，推压活塞，将体积百分浓度为10％的碘克沙醇液加入离心管底部，至0.5ml刻度线后，慢慢沿着离心管收回针管；擦干针管，以相同的方法加样体积百分浓度为15％的碘克沙醇液2.5ml，注意加样过程要缓慢，使体积百分浓度为10％的碘克沙醇液与体积百分浓度为15％的碘克沙醇液之间形成分离面；擦干针管，以相同的方法加样体积百分浓度为20％的碘克沙醇液2.5ml，注意加样过程要缓慢，使体积百分浓度为15％的碘克沙醇液与体积百分浓度为20％的碘克沙醇液之间形成分离面。

1_5、将不连续密度梯度液置于4℃温度环境下静置12～18小时(或者过夜)后，形成连续密度梯度液，将该连续密度梯度液作为细胞分离液。

步骤二，三疣梭子蟹血细胞的采集：

2_1、使用ACD抗凝剂润洗无菌注射器。

2_2、使用润洗后的无菌注射器，从暂养的三疣梭子蟹的步足关节处抽取血淋巴液，与润洗后的无菌注射器中预留的抗凝剂1:1混匀，再将混合液置于1.5ml的离心管中。

2_3、在室温下对混合液进行1100g离心处理2.5min后，去上清，得到细胞沉淀物；

2_4、将步骤1_2得到的等渗液作为细胞悬液，将步骤2_3得到的细胞沉淀物与细胞悬液充分混匀后得到三疣梭子蟹全血细胞悬液。

步骤三，三疣梭子蟹血细胞的分离：

3_1、取三疣梭子蟹全血细胞悬液缓慢加到细胞分离液上，其中，三疣梭子蟹全血细胞悬液与细胞分离液的体积比为1:5。实验中取混合细胞悬液2ml。

3_2、在4℃温度环境下进行2300g离心处理15min后，三疣梭子蟹血细胞被分成三层，最上层为透明细胞层，中间层为小颗粒细胞层，最下层为大颗粒细胞层。图1给出了三疣梭子蟹血细胞经分离得到的透明细胞层、小颗粒细胞层、大颗粒细胞层在细胞分离液中的分布。

对最上层的透明细胞层中的透明细胞、中间层的小颗粒细胞层中的小颗粒细胞、最下层的大颗粒细胞层中的大颗粒细胞进行Giemsa染色，观察各层细胞类型。取出最上层的透明细胞，滴一滴于载玻片上，均匀涂布，室温下风干后，用浓度为4％的多聚甲醛固定液固定10min，然后滴加Giemsa工作液覆盖涂片，室温染色30min，再用蒸馏水缓慢冲洗，水性封片剂封片，最后在显微镜下观察透明细胞的染色结果，并拍照。以相同的方式，得到小颗粒细胞的染色结果并拍照及得到大颗粒细胞的染色结果并拍照。图2a给出了三疣梭子蟹血细胞经分离得到的透明细胞经Giemsa染色后的形态，图2b给出了三疣梭子蟹血细胞经分离得到的小颗粒细胞经Giemsa染色后的形态，图2c给出了三疣梭子蟹血细胞经分离得到的得到大颗粒细胞经Giemsa染色后的形态，从染色结果可见经过分离的透明细胞较颗粒细胞小，细胞质少，核质比大；而小颗粒细胞体积中等，细胞质多且其中有肉眼可见的染色颗粒，但颗粒较小；大颗粒细胞体积最大，细胞质多且中有肉眼可见的染色颗粒，颗粒较大染色较深。

在具体操作时，步骤1_5中的温度和时间，步骤2_3中的转速和时间，步骤3_2中的温度、转速和时间均可在小范围内适当调整，对分离结果的影响不是很大，步骤1_5中的温度的范围为4～6℃，时间的范围为12～18小时；步骤2_3中的转速的范围为1000～1200g，时间的范围为2～3min；步骤3_2中的温度的范围为4～6℃，转速的范围为2200～2400g，时间的范围为14～16min。步骤3_1中的混合细胞悬液与细胞分离液的体积比的范围为1:5～4，通过实验发现将混合细胞悬液与细胞分离液的体积比设为1:5时分离效果更佳。

实施例二：

本实施例是在实施例一的基础上，进行了进一步的处理。即：在步骤3_2后，对分离出的透明细胞层中的透明细胞溶液、小颗粒细胞层中的小颗粒细胞溶液、大颗粒细胞层中的大颗粒细胞溶液进行细胞分离液洗涤，以保持更好的活性，具体过程为：从透明细胞层中吸取出透明细胞溶液，加入体积为吸取出的透明细胞溶液体积的3倍的等渗液，在4℃温度环境下进行1200g离心处理2.5min后，去上清，得到沉淀物；然后在沉淀物中加入体积为沉淀物的体积的3倍的等渗液，在4℃温度环境下进行1200g离心处理2.5min后，去上清，得到洗脱细胞分离液后的透明细胞溶液；以相同的方式，获取洗脱细胞分离液后的小颗粒细胞溶液和洗脱细胞分离液后的大颗粒细胞溶液。在洗脱细胞分离液后的透明细胞溶液、洗脱细胞分离液后的小颗粒细胞溶液和洗脱细胞分离液后的大颗粒细胞溶液各自中加入等渗液重悬，重悬细胞按照1:10的比例与配置好的L15培养基添加浓度为10％的胎牛血清混匀，然后将细胞铺在12孔板中放置于普通生化培养箱中于25℃进行培养，培养4h及12h后对细胞进行观察并在倒置显微镜中拍照。图3a给出了三疣梭子蟹血细胞经分离得到的透明细胞的细胞贴壁及体外培养形态，图3b给出了三疣梭子蟹血细胞经分离得到的小颗粒细胞的细胞贴壁及体外培养形态，图3c给出了三疣梭子蟹血细胞经分离得到的得到大颗粒细胞的细胞贴壁及体外培养形态，从细胞培养形态可见三种细胞都可以贴壁，但贴壁后的细胞形态不同，透明细胞贴壁后呈现短梭型，而小颗粒细胞呈现长梭型，大颗粒细胞贴壁后大部分仍呈圆形或三角形，细胞内仍有肉眼可见的颗粒。