一种用来评估艾滋病合并结核感染的生物标记物的制作方法

本发明涉及生物工程
技术领域：
，具体为一种用来评估艾滋病合并结核感染的生物标记物。
背景技术：
：艾滋病被称为世界头号传染病杀手，自1981年美国报道第一例艾滋病病例至今，全世界已经累计感染艾滋病病毒6000多万人，已造成2700多万人死亡。每年大约有200万人死于艾滋病及相关疾病(who2013)。根据2013年统计我国hiv感染人数大约在78万左右。截止2014年底，深圳市存活hiv/aids患者为8092例，其中aids病人2651例，而且逐年以15～20％左右的速度在增长，艾滋病不仅已成为严重威胁我市人民健康的公共卫生问题，且已影响到经济发展和社会稳定。结核分支杆菌(mycobacteriumtuberculosis,mtb)感染是艾滋病(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)最常见的机会性感染和主要死因。我国调查显示，hiv/aids合并结核(hiv/tb)的双重感染者约为2万例，感染率14.44％。hiv/tb感染严重影响我国艾滋病患者预后和生存质量。然而，hiv/tb合并感染的临床表现缺乏特异性，诊断困难，效果不佳，病死率较高。因此，了解hiv/tb感染的特异性免疫应答谱，进一步研究出新的早期诊断指标及特异性治疗靶点成为我国当前艾滋病防治工作的当务之急。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种评估艾滋病合并结核感染的生物标记物，以及将该生物标记物应用在评估艾滋病合并结核感染的产品中。本发明还提供了一种引物组合物及用途，和一种筛选艾滋病合并结核感染的生物样品的系统。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:本发明第一方面提供了一种生物标记物，所述的生物标记物包含cdkn1c基因。在一优选例中，所述的生物标记物还包含socs3基因。在一优选例中，所述的生物标记物还包含sfxn1基因。本发明第二方面提供了一种生物标记物，所述的生物标记物为cdkn1c基因和/或socs3基因和/或sfxn1基因所表达的mrna或者其编码的蛋白。本发明第三方面提供了上述的生物标记物在制备检测艾滋病合并结核感染的产品中的应用。本发明第四方面提供了一种产品，所述的产品包括用于检测上述的生物标记物的表达量的实时定量pcr的试剂。本发明第五方面提供了一种检测上述的生物标记物的表达量的实时定量pcr的试剂在制备用来评估艾滋病合并结核感染的产品上的用途。本发明第六方面提供了一种引物组合物，该引物组合物包含扩增sfxn1基因的至少一对引物、扩增socs3基因的至少一对引物和扩增cdkn1c基因的至少一对引物中的一种或多种与扩增β-actin内参基因的引物的组合。在一优选例中，所述的扩增sfxn1基因的引物包含seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列。在一优选例中，所述的扩增socs3基因的引物包含seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列。在一优选例中，所述的扩增cdkn1c基因的引物包含seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列。在一优选例中，所述的扩增β-actin内参基因的引物包含seqidno.7和seqidno.8所示的核苷酸序列。本发明第七方面提供了上述引物组合物在制备用于评估艾滋病合并结核感染的试剂盒上的用途。本发明第八方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包含上述所述的引物组合物。在一优选例中，所述的试剂盒还包含荧光定量pcr试剂。在一优选例中，所述的荧光定量pcr试剂来自takara公司sybrpremixextaqiirr820试剂盒中的试剂。在一优选例中，所述的试剂盒还包含反转录试剂。在一优选例中，所述的反转录试剂来自takara公司primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit6210a试剂盒中的试剂。在一优选例中，所述的试剂盒还包含rna提取试剂。在一优选例中，所述的rna提取试剂为trizol法提取试剂。在一优选例中，所述的试剂盒还包含pbmc分离试剂。在一优选例中，所述的pbmc分离试剂来自ge公司货号为#17-1440-03的ficoll淋巴细胞分离液。本发明第九方面提供了一种筛选艾滋病合并结核感染的生物样品的系统，所述的系统包含：实时定量pcr扩增装置，所述实时定量pcr扩增装置中设置有sfxn1基因、socs3基因、cdkn1c基因和β-actin内参基因的特异性引物，以便利用所述特异性引物，对生物样品中提取的核酸样本进行实时定量pcr扩增，分别得到sfxn1基因、socs3基因、cdkn1c基因和β-actin内参基因的ct值以及基于ct值计算得到的2-δδct值；判断装置，所述判断装置与所述实时定量pcr扩增模块相连，通过对sfxn1基因、socs3基因和cdkn1c基因的表达水平进行判断，用于筛选艾滋病合并结核感染的生物样品；在一优选例中，所述判断装置中用于筛选艾滋病合并结核感染的生物样品的判断基准为：生物样品中的sfxn1基因的mrna表达量倍比值＞2.5和/或生物样品中的socs3基因的mrna表达量倍比值＞3和/或cdkn1c基因的mrna表达量倍比值＜0.2，其中生物样品中的sfxn1基因/socs3基因/cdkn1c基因的mrna表达量倍比值＝(生物样品中的sfxn1基因/socs3基因/cdkn1c基因的mrna相对表达量)/(对照样品中的sfxn1基因/socs3基因/cdkn1c基因的mrna相对表达量)，生物样品中的sfxn1基因/socs3基因/cdkn1c基因的mrna相对表达量＝(生物样品的sfxn1基因/socs3基因/cdkn1c基因的2-δδct)/生物样品的β-actin内参基因的2-δδct。在一优选例中，所述的sfxn1基因特异性引物包含seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列。在一优选例中，所述的socs3基因特异性引物包含seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列。在一优选例中，所述的cdkn1c基因特异性引物包含seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列。在一优选例中，所述的β-actin内参基因特异性引物包含seqidno.7和seqidno.8所示的核苷酸序列。在一优选例中，所述的系统还包含反转录扩增装置，用于将生物样品的rna转化为cdna，所述的反转录扩增模块与实时定量pcr扩增装置相连。在一优选例中，所述的系统还包含核酸提取装置，所述的核酸提取装置与所述的反转录扩增装置相连，用于提取所述生物样品中的核酸样本。本发明中“生物标记物的表达量”指的是生物标记物基因表达的mrna量，或者蛋白的量。本发明中“sfxn1”也称为三羧基携带蛋白tcc，是sideroflexin家族成员之一，定位于线粒体膜上，是真核生物的一种进化保守蛋白。本发明中“socs3”为细胞因子信号转导抑制(suppressorofcytokinesignaling,socs)分子家族的重要组份，被多种炎症因子和抗炎因子诱导表达(如il-6、il-10、ifn-γ、lps等),并抑制多种免疫分子的信号传导。本发明中“cdkn1c”属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependentkinasesinhibitors，cdki)家族重要成员。本发明具有以下有益效果：本发明提供一种用来评估艾滋病合并结核感染的标志物，经实验证明，本发明所列的标志物中的特定基因在艾滋病合并结核感染的人血液中的pbmc(外周血单个核细胞)里相对表达量可用于判断引起艾滋病合并结核感染的风险大小，因此这些基因的组合可作为评价艾滋病合并结核感染的预警因子，使临床治疗更加个性化，这对疾病的诊断和治疗都具有指导意义。本发明还提供了引物组合物和包含引物组合物的试剂盒，该引物组合物和与试剂盒可用于检测cdkn1c基因、socs3基因和sfxn1基因的相对表达量，实验证明该引物组合物中的各对引物对和与试剂盒分别进行多重荧光定量pcr时具有灵敏度高和特异性强的特点，能准确的测定cdkn1c基因、socs3基因和sfxn1基因的相对表达量。附图说明图1：三种生物标记物倍数变化分析图。control：组4，50名健康体检者样本；hiv/td:组1，100名hiv/td患者样本；hiv:组2，100名单纯hiv感染患者样本；td:组3,100名结核病患者样本。图a:四组样本的sfxn1基因的mrna表达量倍数变化分析图；图b:四组样本的socs3基因的mrna表达量倍数变化分析图；图c:四组样本的cdkn1c基因的mrna表达量倍数变化分析图。具体实施方式下面将结合具体实施例，对本发明进行详细说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂、产品和仪器也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。本发明中实施例中所用的生物样本均取自深圳市第三人民医院。rna-seq的规程以及其后续试验得到了该医院伦理委员会的批准。所有病人都填写了书面知情同意书，授权使用他们的样本。实施例1本实施例提供了评估艾滋病合并结核感染的标志物、引物组及其应用。评估艾滋病合并结核感染的标志物：为了更好的对艾滋病合并结核感染进行评估，利用健康人、hiv/td患者、单纯hiv感染患者和结核病患者(td)的样品，针对多个标志物进行了大量的实验筛选，通过比对多个标志物在不同种类的生物样品的表达量的差异，最终筛选出了sfxn1基因、socs3基因和cdkn1c基因三个基因作为评价艾滋病合并结核感染的生物标志物(同时针对sfxn1基因、socs3基因和cdkn1c基因进行检测，结果互相参照，更能有效且高效率的区分发生和不发生艾滋病合并结核感染的人群)。评估艾滋病合并结核感染的引物组：分别针对sfxn1基因、socs3基因、cdkn1c基因和β-actin内参基因各设计了一对荧光定量pcr引物，其中β-actin内参基因为荧光定量pcr的内参基因。具体序列见表1：表1：引物组序列上述引物均由深圳华大基因科技服务有限公司合成并经过普通pcr特异性验证。上述引物是在确定将sfxn1基因、socs3基因和cdkn1c基因作为标志物联合应用后经过多次筛选而获得，实验证明，这些引物具有特异性强、灵敏度高且重复性好的特点，且sfxn1基因、socs3基因、cdkn1c基因的引物分别与β-actin内参基因的引物混合进行多重荧光定量pcr扩增时，引物之间无相互干扰，采用这些引物进行荧光定量pcr时，可以更准确的进行目标基因的相对定量。上述生物标志物和引物组合物可分别用于制备检测艾滋病合并结核感染的产品，如可用于制备检测艾滋病合并结核感染的试剂盒，该试剂盒包括用于检测上述的生物标记物的表达量的实时定量pcr的试剂。实施例2本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：(1)实施例1中的引物组：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8；(2)荧光定量pcr试剂：takara公司sybrpremixextaqiirr820试剂盒中的试剂；(3)反转录试剂：takara公司primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit6210a试剂盒中的试剂；(4)rna提取试剂：trizol法提取试剂；(5)pbmc分离试剂：ge公司的ficoll淋巴细胞分离液#17-1440-03。实验证明，上述(1)、(2)、(3)、(4)和(5)的试剂联合使用，效果更加优越，具体体现在省时、经济、可重复性高、灵敏度高和特异性强的特点。而采用引物设计软件随机选取的sfxn1基因、socs3基因、cdkn1c基因与β-actin内参基因的引物组合在一起则或多或少的存在特异性不强、灵敏度不高和重复性不好等各种缺陷。上述试剂盒可以用于用来评估艾滋病合并结核感染的生物样品。实施例3本实施例对艾滋病合并结核感染的患者样本和其它样本的基因表达产物mrna的表达量进行了测定，确定了艾滋病合并结核感染的三种生物标记物，鉴定过程如下：一.样本选择共选取了四组对象作为检测样本来源，如下：组1：100名hiv/td患者(hiv/td:艾滋病合并结核感染)；组2：100名单纯hiv感染患者；组3：100名结核病患者(td)；组4：对照组，50名健康体检者。二.mrna提取1.pbmc分离对一中的组1-组4各采外周血约5ml，采用ficoll密度梯度离心法，利用ge公司货号为#17-1440-03的ficoll淋巴细胞分离液分离pbmc外周血淋巴细胞，分离pbmc的具体步骤如下(以下步骤中涉及的比例如无特殊说明均指体积比)：(1)5ml采血管采集标本后，登记编号、日期。(2)将5ml血标本与等量pbs混匀(血液：pbs＝1:1)。(3)取无菌15ml离心管标记，加入ficoll淋巴细胞分离液(ge公司，货号为#17-1440-03)5ml，侧倾，沿管壁缓慢加入(2)中混匀的10ml的pbs+血液的混合液，保持液面分层(pbs：血液：淋巴细胞分离液＝1：1：1)。(4)2℃离心2000rpm，20min(上升g为max，下降g为slow)即p3程序。(5)离心后液体分为四层：由上至下依次为血浆+pbs，pbmc，淋巴细胞分离液和血细胞，吸取第二层pbmc(即外周血单个核细胞包含淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其它少量细胞)置于新标记好已加入10mlpbs的无菌15ml离心管中。(6)清洗细胞，混匀后p6程序(2000rpm，5min，25℃)离心(若离心后有红色沉淀可用红细胞裂解液(ack)5ml裂解红细胞5min，再加入10mlpbs清洗)。(7)离心后，去上层清液，管底即为沉积的pbmc；(8)在沉积的pbmc中用毛细管或加样枪加入2ml冻存液，吹打混匀；(9)混匀的细胞悬液分别加入细胞冻存管中，每管各1ml，标编号、日期，将冻存管转至已降至常温的程序降温盒，放入-80℃冰箱中，至少2小时后再将冻存管转至9*9冻存盒中液氮保存备用。2.总rna提取利用trizol法对pbmc进行裂解，提取总rna并溶于20ulh2o中,获得浓度为100～300ng/ul的rna溶液，分别取1.5ulrna溶液用于反转录扩增。总rna提取具体操作步骤如下：(1)取上述1管冻存pbmc，37℃水浴锅溶解，加入1mltrizol，振荡器上震荡1分钟。室温放置5min，使核蛋白体完全分解。(2)12000rpm离心5min，弃沉淀。(3)取上清液加入200ul氯仿，剧烈震荡15s后室温放置10min。(4)在4℃条件下12000g离心15min，管内液体分为三层，将水样层转移至新的离心管中，加入500ul异丙醇，颠倒混匀后，常温静置10min。(5)在4℃条件下，12000g离心10min，弃上清，留rna沉淀于管底。加入1ml75％(v/v)的乙醇水溶液，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。(6)在4℃条件下，8000g离心5min，弃上清，室温干燥5min，加入depc水20ul溶解rna沉淀。三.qrt-pcrmrna及分析1.反转录为cdna使用takara公司primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit6210a的试剂盒，将步骤二提取的rna1.5ml进行反转录扩增，具体操作步骤及反应体系如下：(1)在无rna酶ep管中配制表2所示的反应混合液。表2：反应混合液试剂使用量random6mers1μldntpmixture1μl模板rna1.5μlrnasefreedh2o6.5μl(2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却，时间>1min。(3)在上述ep管中配制表3所示的反转录反应液，总量为20ul。表3：反转录反应液试剂使用量步骤(2)处理后反应混合液10μl5×primescriptiibuffer4.0μlrnaseinhibitor(40u/μl)0.5μlprimescriptiirtase1.0μlrnasefreedh2o4.5μl(4)缓慢混匀反转录反应液，按下列条件进行反转录反应：30℃，10min；42℃，60min；75℃，15min；随后加入rnaseh1μl(5u/μl),37℃20min。取1ul反应产物作为下一步实时荧光定量pcr反应的dna模板。2.实时荧光定量pcr(qpcr)qpcr反应严格按照takara公司sybrpremixextaqiirr820a操作说明书进行，其反应体系如表4所示。表4：qpcr反应体系说明：正向引物和反向引物分别为表1中sfxn1基因、socs3基因、cdkn1c基因的正向引物和反向引物分别与内参基因β-actin的正向引物和反向引物混合并按照表4配比配置反应体系。qpcr反应条件如下：预变性95℃，30s；(95℃变性5s；60℃退火30s)×40循环；75℃延伸15s；60℃，1min；95℃，15s；4℃forever。每个样本每个基因均做3个重复，并采用2-δδct法进行相对定量分析。根据测得qrt-pcr结果进行倍数变化分析，以对照组定量结果的均数作为分母，每个生物样品的定量结果作为分子得到每个生物样品的倍比值，即生物样品的基因mrna表达量倍比值＝生物样品的基因mrna相对表达量/对照样品的基因mrna相对表达量，生物样品的基因mrna相对表达量＝生物样品的基因的2-δδct/内参基因β-actin的2-δδct。四.结果倍数变化分析结果采用四分位数的统计方法对sfxn1基因、socs3基因、cdkn1c基因在四组人群中的相对表达水平进行统计，统计结果见下表5：表5：sfxn1基因、socs3基因、cdkn1c基因在四组人群中的相对表达水平注：中位数(四分位数)倍数变化分析结果见图1，具体结果如下：从图中1-a可看出:sfxn1基因在单纯hiv感染者中较健康人明显增高，而结核感染者与健康人之间无明显差异。当采用2-δδct法进行sfxn1基因的相对表达量计算时，sfxn1基因的mrna的倍比值大于2.5时hiv感染或hiv/tb二重感染可能性较高。统计分析采用kruskal–wallistest分析方法，对组群进行整体分析比较，统计结果为：hiv/tb二重感染者的sfxn1基因表达水平分别相对于健康人(p＜0.01)、单纯hiv感染者(p＜0.05)以及单纯结核感染者(p＜0.01)的sfxn1基因表达水平均有显著提高。从图中1-b可看出:socs3基因的表达水平在健康人、单纯hiv感染者、单纯结核感染者、hiv/tb二重感染者依次上升。当采用2-δδct法进行socs3基因的相对表达量计算时，socs3基因的mrna的倍比值大于3可判断tb感染或hiv/tb二重感染可能性较高。统计分析采用kruskal–wallistest分析方法，对组群进行整体分析比较，统计结果为：hiv/tb二重感染者的socs3基因表达水平分别相对于健康人(p＜0.01)、单纯hiv感染者(p＜0.01)以及单纯结核感染者(p＜0.01)的socs3基因表达水平上升幅度均具有统计学差别。从图中1-c可看出:cdkn1c基因在单纯结核患者中表达无明显改变，在单纯hiv感染者中表达下降，而在hiv/tb二重感染者中表达水平显著下降，下降幅度大大超过单纯hiv感染者。当采用2-δδct法进行cdkn1c基因的相对表达量计算时，cdkn1c基因的mrna的倍比值小于0.2可判断为hiv/tb二重感染可能性较高。统计分析采用kruskal–wallistest分析方法，对组群进行整体分析比较，统计结果为：hiv/tb二重感染者的cdkn1c基因表达水平分别相对于健康人(p＜0.01)、单纯hiv感染者(p＜0.01)以及单纯结核感染者(p＜0.01)的cdkn1c基因表达水平均有显著下降，具有统计学差别。从kruskal–wallistest统计分析结果可看出：sfxn1基因、socs3基因和cdkn1c基因在艾滋病合并结核感染者中的表达水平相比于健康人、单纯hiv感染者以及单纯结核感染者中的表达水平差异显著，可以作为艾滋病合并结核感染新的生物标记物。综合3个基因mrna表达量倍比值结果可以得知：当sfxn1基因的mrna表达量倍比值＞2.5和/或socs3基因的mrna表达量倍比值＞3和/或cdkn1c基因的mrna表达量倍比值＜0.2时，患者为hiv/tb二重感染的可能性较大。上述结论后续也得到了大量的实践证明其可靠性。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。sequencelisting<110>深圳市第三人民医院<120>一种用来评估艾滋病合并结核感染的生物标记物<130>20171121<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1aagttggcattcccgtcac19<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2gagaatcctggacacgacaac21<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3gagttcctggaccagtacgatg22<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4tctggttggcttcttgtgct20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5ccaaaggcactctccatctc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gctagatgggcatgtatggc20<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列<400>7tccttcctgggcatggagt19<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8agcactgtgttggcgtacag20当前第1页12