本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测重组表达酶cyp3a5底物代谢活性的方法。
背景技术：
在新药研究与开发过程中，药物的吸收、分布、代谢、排泄及其毒性(adme/tox)特征对于一个药物候选物最终成功起着至关重要的作用。细胞色素酶(cyp450)是非常重要的药物代谢i相酶，目前市面上大于85％的药物在人体内是由cyp450来代谢。传统的药物代谢研究以实验动物体内实验为主。近几年来，药物早期代谢研究进入到体外代谢的研究阶段：即利用重组cyp450酶在异源表达系统中进行表达，建立起体外筛选体系，进行体外代谢数据和性质到体内代谢数据和性质的预测，使现代新药研发具有了高通量、高效率、高准确性的特点。利用构建好的cyp药物体外筛选系统通过测定药物代谢的动力学参数及其产物性质，预测cyp450体内代谢水平，这是目前欧美各国在进行新药申报时必须进行的一项研究。
同时，美国fda已对新药研发提出门槛更高的建议：对于大于药物总量的10％的代谢物要单独做毒性实验，当一种药物被cyp450酶代谢成数种活性代谢物时而且又是毒性活性代谢物，明显影响组织或靶组织反应时，应主要测定代谢物的浓度。因此，对代谢物进行定性和定量，是药物毒性评价和代谢动力学研究中最重要的步骤。但这些代谢物往往是毫克级的，运用标准的化学合成途径，需要鉴定其结构，分离其在化学合成中产生的异构体，通常非常复杂，合成过程需要数周，需消耗大量的人力物力。因此，利用酵母生物反应器进行生物合成代谢物，是传统的化学合成方法一个很好的替代手段，并且更具优势。
设想将人cyp450基因主要亚型(cyp3a4、cyp3a5、cyp2a6、cyp2c8以及cyp2c19)整合进生物体内，实现人cyp450基因主要亚型的稳定表达，以期能够在生物代谢过程中实现对特定药物的选择性代谢，生产专一的药物代谢物。可以对用生物方法生产专一的药物代谢物进行初步研究，同时为药理学、毒理学研究提供可靠的体外模型。在近年的研究中，用异源表达人cyp450s对药物代谢物的研究正逐渐成为热点，因为利用生物生产药物代谢物可能会是对传统的化学合成方法良好的替代手段并且更具环保优势。
cyp3a5的活性有很大的个体和种族差异性。cyp3a5代谢差异会造成药物利用度和清除率的差异，从而使药物疗效和毒性产生差异。在肝脏cyp3a5含量占cyp3a总量的一半以上。同时cyp3a5在肠、食管、胃、胆囊等多种器官和组织中表达，这也可能是其重要性的体现。cyp3a5在肿瘤组织中也有表达，增加了肿瘤组织中cyp3a的表达，提示可能与cyp3a5和肿瘤的发生和治疗有关，另外器官移植手术病人的免疫抑制剂的代谢也与cyp3a5多态性有重要关系。
然而，人cyp450酶系是一种膜蛋白，只能在胞内表达，药物需要进入细胞内才能被利用。酵母细胞壁却成为一道屏障，它能阻止大分子化学物质进入细胞。为了成功构建基于酵母的人cyp450体外表达模型，在酵母发酵过程中研究药物代谢情况，增加酵母细胞壁的通透性是使大分子药物能顺利通过细胞壁的有效途径。
cyp450代谢产物的生产目前基本采用化学合成方法，对合成的化合物需要一一鉴定其结构，分离其在化学合成中产生的异构体，通常非常复杂，合成过程需要数周，需消耗大量的人力物力。
技术实现要素：
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种提高重组人源cyp3a5酵母his+mut+生物反应器的cyp3a5表达酶代谢活性的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种提高重组人源cyp3a5酵母his+mut+生物反应器的cyp3a5表达酶代谢活性的方法，所述方法是在活体重组人源cyp3a5酵母his+mut+生物反应器中进行的，包括以下步骤：
(1)、将冻存的重组人源cyp3a5酵母his+mut+生物反应器进行活化，经传代扩培后，酵母大量增殖；
(2)、甲醇诱导培养60～72h后，往bmmy培养基中加入3～6％的乙醚，同时加入100ul1mmol/l的睾酮24h-48h后，离心，分别收集上清和细胞；
(3)、用乙腈重悬细胞，超声破碎后，离心收集上清，即可进行检测。
在其中一些实施例中，所述重组人源cyp3a5酵母his+mut+生物反应器是通过以下步骤构建得到的：
(1)、用xbai酶切质粒pbs-2a，分别回收3.0kbpbs骨架片段和130bp的2a连接肽片段，将3.0kb骨架片段去磷酸化处理，重新连接选择反向克隆即得到载体pbs-2a(-)；将nadph-细胞色素p450氧化还原酶基因por定向插入所述载体pbs-2a(-)的bglii及noti酶切位点之间，获得载体pbs-2a-por；序列优化后的人源cyp3a5经pcr加a回收，两端带bamhi+xbai，将其连接到pmd-19tsimple，得到cyp3a5–pmd19tsimple，将.cyp3a5–pmd19tsimple和pbs-2a-por分别用bamhi+xbai双切处理，cyp3a5连接到pbs-2a-por，得到载体pbs-cyp3a5-2a-por；将载体pbs-cyp3a5-2a-por进行bamhi和noti双酶切，获得片段cyp3a5-2a-por，将该片段插入酵母表达载体ppic3.5k的bamhi/noti位点，获得双表达载体ppic-cyp3a5-2a-por；
(2)、将双表达载体ppic-cyp3a5-2a-por线性化后，乙醇进行回收；
(3)、将感受态毕赤酵母gs115和线性化双表达载体ppic-cyp3a5-2a-por的混合物转移至预冷的bio-rad电转杯中，冰浴5～15min；进行电击；结束后立即加入冷的1m山梨醇溶液等待涂板；
(4)、md初步筛选重组转化子后，再经pcr筛选重组转化子，经sds-page和westernblot法检测目的蛋白，即得重组人源cyp3a5酵母his+mut+生物反应器。
在其中一些实施例中，所述步骤(3)中双表达载体线性化是采用sali酶进行的。
在其中一些实施例中，所述步骤(3)中线性化的反应体系为：双表达载体30μl、10×bufferh5μl、sali酶5μl、ddh2o10μl。
在其中一些实施例中，所述步骤(3)中乙醇回收的步骤为：向50μl已反应结束的体系中加入125μl体积的预冷的无水乙醇，然后加入冷的5μl的3m，ph＝5.2的醋酸钠溶液，在-20℃放置1h；12000rpm离心10min，然后用1ml75％的酒精洗涤两次，12000rpm离心5min，烘干，用10～20μl超纯水溶解沉淀。
在其中一些实施例中，步骤(4)中所述感受态毕赤酵母gs115和线性化双表达载体ppic-cyp3a5-2a-por的体积比为1：1。
在其中一些实施例中，步骤(4)中所述电转化参数为：电压1.5kv，电容25μf，电阻200ω，正常放电时间tc：4.2～4.9ms。
在其中一些实施例中，步骤(5)中所述pcr的扩增引物为seqidno:3和seqidno:4。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的提高重组人源cyp3a5酵母his+mut+生物反应器的cyp3a5表达酶代谢活性的方法不破碎重组酵母，在活体里进行代谢反应，相比起现有技术的破碎后提取蛋白，进行体外代谢反应，本发明的方法在重组his+mut+酵母菌株中代谢6β-羟基睾酮的转化率达到80.1％～95.2％，已完全可满足进行代谢产物大规模合成的前提要求；
2、通过将人源cyp3a5基因根据酵母密码子的编码偏好进行序列优化，而后利用基因工程技术将序列优化后的人cyp3a5及其氧化还原酶nadph共转染到酵母工程菌株的基因组中，实现人cyp3a5及nadph在毕赤酵母中的大量表达，药物通过通透性增加的酵母细胞壁进入胞浆，能够在酵母发酵培育过程中实现对特定药物进行选择性的代谢过程，构建基于基因工程酵母的药物代谢生物反应器，以生物合成的方法高效生产专一的药物代谢物；为药理学、毒理学研究提供了可靠的体外模型，为我国新药开发提供了一个新的研究平台；
3、本发明的cyp3a5生物反应器在酵母中稳定表达了cyp450，酵母发酵培育过程中，底物经胞浆代谢后可生产特定的代谢底物，可实现对特定药物进行选择性的代谢过程以高效生产专一的药物代谢物，整个代谢过程只需要1周左右的时间即可完成，同时可采用大规模罐发酵扩大代谢物产量，酵母罐体发酵技术比较成熟，且成本低廉，反应过程中无毒、害物质产生，不需要耗费大量人力物力，将成为今后生产代谢物的主要主要趋势；
4、本发明的cyp3a5生物反应器用于制备代谢物的优点首先在于解决了酵母细胞p450氧化还原酶表达水平较低的缺陷，其次在于能够保证被转染的细胞同时表达两种蛋白。而现有技术中，当使用两个不同的表达载体分别携带两个基因时，某些被转染的细胞可能只表达其中一种蛋白，因而代谢活性很低甚至没有活性，最终导致代谢物的产量较低。
附图说明
图1a为本发明实施例1中pbs-2a的质粒图谱；
图1b为本发明实施例1中pbs-2a(+)质粒的xbai单酶切结果；其中，lane1:1kbmarker，lane2:用xbai单酶切的pbs-2a，lane3:markerii
图1c为本发明实施例1中2a反转得到的pbs-2a(-)用xhoi单酶切的结果；其中lane1:markerii，lane2-5分别为pbs-2a用xbai单酶切得到的4个克隆，其中2泳道克隆正确；
图2a为本发明实施例1中载体pbs-2a-cypor的酶切图谱，插入位点为bglii/noti；
图2b为本发明实施例1中cyporpcr加a回收(两端带bglii+noti)的结果，其中，lane1：cyporpcr加a回收；lane2：1kbmarker；
图2c为本发明实施例1中por连接pmd-19tsimplebglii和noti双酶切鉴定结果；其中，lane1-6：or-pmd19tsimple6个克隆7：1kbmarker；
图2d为本发明实施例1中cypor-19tsimple和pbs-2a(-)用bglii和noti双酶切结果；其中，lane1：cypor-19tsimple用bglii和noti双酶切处理lane2：pbs-2a(-)用bglii和noti双酶切处理lane3：1kbmarker；
图2e为本发明实施例1中cypor连接pbs-2a(-)，用bglii和noti双酶切鉴结果，其中，lane1：1kbmarker2-8：cypor连接pbs-2a(-)用bglii和noti双酶切处理；
图3a为本发明实施例1中cyp3a5pcr加a回收(两端带bamhi+xbai)，其中，lane1：cyp3a5pcr加a回收2：1kbmarker；
图3b为本发明实施例1中3a5连接pmd-19tsimple(bamhi+xbai双酶切鉴定)，其中，lane1：1kbmarker2-6：cyp3a5-19tsimple用bamhi和xbai处理；
图3c为本发明实施例1中cyp3a5–pmd19tsimple和or-pbs-2a(-)分别用bamhi+xbai双切处理；其中，lane1：cyp3a5-19tsimple双切处理；2：or-pbs-2a(-)双切处理；3：1kbmarker；
图3d为本发明实施例1中3a5连接or-pbs-2a(-)用bamhi+xbai双酶切鉴定，连接成功；其中，lane1-8：8个克隆bamhi和xbai双酶切处理9：1kbmarker；
图3e为本发明实施例1中pbs-cyp3a5-2a-por图谱；
图4a为本发明实施例1中质粒pbs-cyp3a5-2a-por和质粒ppic3.5k图谱及酶切位点；
图4b为本发明实施例1中cyp3a5–or-pbs2a(-)和ppic3.5k用bamhi+xbai双切；其中，lane1：1kbmarker2：cyp3a5-or-pbsbamhi和xbai双切3：ppic3.5k载体bamhi和xbai双切；
图4c为本发明实施例1中3a5连接3.5k成功用bamhi+xbai双酶切鉴定；其中，lane1：1kbmarker2-3：双酶切鉴定，出现3600bp左右的条带；
图4d为本发明实施例1中成功构建ppic-cyp3a5-2a-por质粒；
图5为本发明实施例1中醇沉回收线性化基因电泳图；其中，m：1kbdnamarker；lane1：线性化的空载体ppic3.5k；lane2：线性化的重组基因cyp3a5-ppic3.5k；
图6a为本发明实施例1中转化重组质粒菌落的平板图；
图6b为本发明实施例1中转化空载体的平板图；
图7为本发明实施例1中转化重组质粒菌落的电泳图；其中，m：1kbdnamarker；lane1：空白对照(未加模板)；lane2：野生型gs115；lane3～5：转化重组质粒基因组；
图8为本发明试验例1中sds-page电泳图，其中m：marker2：野生型gs1153-5：3号克隆0h，48h，72h6-8：9号克隆0h，48h，72h；
图9为本发明试验例1中cyp3a5超声破碎上清westernblot结果，其中m：proteinmarker；lane1：野生型gs115菌株；lane2～6：阳性菌株分别诱导0h，24h，48h，72h，96h。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。
实施例1提高重组人源cyp3a5酵母his+mut+生物反应器的cyp3a5表达酶代谢活性的方法
包括以下步骤：
一、双表达载体ppic-cyp3a5-2a-por的构建
1、pbs-2a(-)载体的构建
用xbai酶切质粒pbs-2a(购自广州复能基因有限公司)，分别回收3.0kbpbs骨架片段和130bp的2a连接肽片段，将3.0kb骨架片段去磷酸化处理，重新连接选择反向克隆即得到载体pbs-2a(-)；结果如图1所示；
2、载体pbs-2a-cypor的构建
将nadph-细胞色素p450氧化还原酶基因por(购自广州复能基因有限公司)定向插入所述载体pbs-2a(-)的bglii及noti酶切位点之间，获得载体pbs-2a-por；结果如图2所示；
3、载体pbs-cyp3a5-2a-por的构建
序列号为seqidno:1、氨基酸序列为seqidno：2的cyp3a5基因(按照酵母表达的偏好，对cyp3a5基因序列进行了优化)经pcr加a回收，两端带bamhi+xbai，将其连接到pmd-19tsimple，经bamhi+xbai双酶切鉴定连接成功，将.cyp3a5–pmd19tsimple和pbs-2a-por分别用bamhi+xbai双切处理，cyp3a5连接pbs-2a-por用bamhi+xbai双酶切鉴定，连接成功，得到载体pbs-cyp3a5-2a-por；
4、双表达载体ppic-cyp3a5-2a-por的构建
将载体pbs-cyp3a5-2a-por进行bamhi和noti双酶切，获得片段cyp3a5-2a-por，将片段cyp3a5-2a-por插入酵母表达载体ppic3.5k，获得酵母双表达载体ppic-cyp3a5-2a-por，插入位点bamhi/noti。结果如图4所示。
二、双表达载体电转染入毕赤酵母gs115得到重组转化子
1、双表达载体ppic-cyp3a5-2a-por线性化及回收
重组质粒提取之后要进行线性化处理，因为环状质粒与酵母基因组发生同源重组的几率是很低的，在ppic-cyp3a5-2a-por整合进毕赤酵母gsll5的时需要较高的转化率以便于酵母能进行本身的同源重组。重组质粒构建过程中的难点是同源重组这一过程。为了让同源重组在特定位点的发生，就必须用特定的限制性内切酶对重组质粒进行线性化的处理。这样就会防止随机插入的重组质粒在功能区断开从而造成目的基因失效。在重组的过程中取代事件不如插入事件多，如果希望能发生插入事件，所以就只能用sali酶或者saci酶；经过序列分析发现目的基因cyp3a5含有一个saci位点，所以选用sali酶进行线性化。
ppic-cyp3a5-2a-por的sali单酶切体系
线性化质粒的回收采用乙醇沉淀法：向50μl已反应结束的体系中加入125μl体积的预冷的无水乙醇，然后加入冷的5μl的3m，ph＝5.2的醋酸钠溶液，在-20℃放置1h；12000rpm离心10min，然后用1ml75％的酒精洗涤两次，12000rpm离心5min，烘干，用10～20μl超纯水溶解沉淀。每次电转需要约1～5μg线性化质粒，越纯越好。回收体积尽量在5～10μl。乙醇沉淀回收率大约是75％。结果如图5所示。
2、感受态毕赤酵母gs115的制备
第一天：50ml离心管中分装5mlypd液体培养基，接单克隆，21:00左右在28℃摇床中以200rpm过夜培养；
第二天：下午17:00左右在装有100mlypd液体培养基的500ml锥形瓶中接种100μl第一天的单克隆菌液；
第三天：中午12:00左右测定菌体的od值，应使od值在1.0～1.3之间，因为这个时期是菌体生长对数期的前期，活力旺盛代谢产物很少；1500g4℃离心5min，用两个50ml离心管收菌；用10mlbuffera(包括20mlypd和2mlph＝8的2mhepes以及0.5ml1mdtt)重悬菌体，30℃静置15min；用冰冷的无菌水充满50ml离心管1500g4℃离心5min；重悬并1500g4℃离心5min；用4ml冷的1m山梨醇重悬，1500g4℃离心5min；用至多500μl1m山梨醇重悬，保持细胞一直在冰上。每管100μl进行分装冻存于-80℃冰箱。
做好感受态后，将100μl新鲜的感受态细胞和10μl体积的线性化质粒混匀，等待电击转化。(超纯水和山梨醇可提前放在-80℃冰箱保存，因为整个操作过程需要冰水，在需要的时候可以一边实验一边融化，始终保持低温状态)。
3、电转化感受态毕赤氏酵母
电转化参数：电压1.5kv，电容25μf，电阻200ω，电转杯规格：2mm，正常放电时间tc：4.2～4.9ms，电击后仪器有曲线生成。
将感受态和线性化质粒的混合物转移至预冷的2mmbio-rad电转杯中，冰浴10min；在上述参数状态下进行电击；结束后立即加入1ml冷的1m山梨醇溶液等待涂板。
4、md初步筛选重组转化子
将电转后点转杯中的液体转移至无菌的1.5mlep管中，30℃静置1～2h，3000g离心5min去除大部分上清，菌体涂布md平板。每块板涂200μl左右，做好空载体对照。2～3天后即可观察白色菌落的生长情况，结果如图6a和6b所示，转化重组质粒的平板有菌落生长而转化空载体的平板未有菌落生长。
5、pcr筛选重组转化子
经过检索genebank信息库，得到了毕赤酵母gs115基因组中aox1的基因信息。通过酵母载体ppic3.5k的图谱信息和同源重组原理，设计了一对验证引物：5'aox1引物和3'aox1引物。
5'aox15'-gactggtccaattgacaagc-3＇(seqidno:3)
3'aox15'-gcaaatggcattctgacatcc-3'(seqidno:4)
扩增体系为：
pcr扩增参数为：
预变性94℃5min；1循环；变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃120s，20循环；最终延伸72℃10min；保温4℃1h。
如果是mut+，应该有两条带，一条为大约2.1kb的aox1基因，另一条为略大于目的基因条带，即1509bp+220bp＝1731bp，其中220bp为载体mcs两侧的aox1同源区。如果是muts就不会出现2.1kb的条带。野生型菌株gs115基因组只能扩增出一条2.1kb左右的aox1基因条带。
pcr结果见图7，由电泳图可以看出，野生型和重组子均可以得到2.1kb大小的aox1基因，重组子在1.7kb的预期位置也出现了亮带，证明重组子是his+mut+。
其中，酵母基因组dna是采用酵母基因组提取试剂盒进行提取的，步骤如下：
a.挑单菌落(步骤4的白色菌落)到ypd液体培养基中过夜培养，取1～3ml酵母菌液(不要超过5×107个细胞，根据经验毕赤酵母od600≈1.0时)12000rpm离心1min，收集沉淀，吸去上清。
b.向菌体中加入600μllyticaseworkingbuffer即溶壁酶工作缓冲液(提前加入β-巯基乙醇终浓度为0.1％)，再加入5μl溶壁酶lyticase(10u/μl)，充分混匀后以去除酵母细胞壁。在30℃水浴条件下处理1h。然后4000rpm离心10min，弃去上清，收集到沉淀。
c.向上一步沉淀中加入200μlbuffer1，用移液器重悬沉淀使之充分混匀。
d.继续加入20μl蛋白酶k，充分混匀。
e.继续加4μl浓度为100mg/ml的rnasea溶液，震荡使之混匀，在室温条件下放置10分，去除rna。
f.继续加200μlbuffer2后充分摇匀。在70℃水浴孵育10min，颠倒混匀数次。孵育后溶液应该变清亮，才说明细胞裂解彻底。
g.继续加200μl无水乙醇后充分混匀，这时有可能会出现一些絮状的沉淀。快速短暂离心，使管壁液体集中在管底。
h.将步骤7所得溶液和沉淀一起加到已装入收集管的吸附柱中，可分多次全部转入。10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
i.向吸附柱中加入500μlbuffer3(加入无水乙醇)，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
j.向吸附柱中加入500μlbuffer4(加入无水乙醇)，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中。
k.为了进一步提高dna纯度，重复步骤10。
l.12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数min，以彻底晾干。因为乙醇的残留会影响后续的pcr反应。
m.将吸附柱放于一个新的ep管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液在室温放置5min后12000rpm离心1min，收集dna然后-20℃保存。
本实施例说明，对重组质粒测序和线性化处理后，成功地通过电转将目的基因转入酵母细胞并且发生同源重组。md平板的初步筛选得到了转化子，将这些转化子提取基因组后作为pcr的模板。结果显示扩增出了相关的基因，得到了his+mut+表型菌株。这为下一步的蛋白的表达奠定了基础。
三、常规sds-page电泳和westernblot法检测目的蛋白的表达
通过md平板和pcr筛选得到了重组菌株his+mut+，为了表达外源蛋白，选用1％甲醇终浓度诱导毕赤酵母进行表达。首先bmgy培养基培养至od600＝4.0左右，用bmmy培养基悬浮，每隔24h添加甲醇至1％终浓度并取样用于检测。诱导96h结束。收菌超声破碎之后，用常规sds-page电泳和免疫印迹westernblot分析蛋白表达情况。
其中，超声破碎方法为：1g湿菌体加10ml的裂解缓冲液，额定功率900w用20％的功率，开3s关6s，让温度不至于过高，超声30min后2000g离心取上清。其余的冻存。在操作过程中会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中有可能会降解表达的外源蛋白，加入苯甲磺酰氟化物(pmsf)能有效的清除蛋白水解酶的活力。
1、常规sds-page电泳
配制12％分离胶和5％的浓缩胶，样品和loadingbuffer混匀后，95℃煮5min，离心后小心去上清进行电泳，浓缩胶部分用80v电压，分离胶部分用120v电压，电泳进行到溴酚兰指示带到下沿停止。电泳结束后用板子顺着水流剥下凝胶，将胶浸没于考马斯亮蓝染色液中，稍稍加热后室温振摇染色1小时左右。用脱色液反复脱色，至背景无色。观察蛋白质表达情况扫描胶片。结果如图8所示。
2、westernblot(蛋白印记法)
结果如图9所示，可以看出从24h出现特异性目标条带，初步证明cyp3a5在毕赤酵母中得到了表达。
常规sds-page电泳和westernblot法结果证明，本实施例成功构建得到了基于酵母的cyp3a5的生物反应器。
四、重组表达酶cyp3a5底物代谢活性检测
该试验例的方法为：不破碎，在活体里进行代谢反应，具体步骤为：
做酶代谢活性检测时，先将冻存的gs115和构建的重组his+mut+菌株进行活化，经传代扩培后，酵母大量增殖，甲醇诱导培养72h后，培养基中加入5％乙醚，同时加入睾酮24h-48h后，离心，分别收集上清和细胞，用乙腈重悬细胞，超声破碎后，离心收集上清。将两次离心收集到的上清加到96孔板中，进行lc-ms/ms分析。lc-ms/ms检测结果经计算统计，睾酮在gs115菌株中几乎没有代谢，而在重组his+mut+酵母菌株中代谢为6β-羟基睾酮的转化率达到80.1％～95.2％，已完全可满足进行代谢产物大规模合成的前提要求。
对比例重组表达酶cyp3a5底物代谢活性检测
该对比例的方法为：破碎后提取蛋白，进行体外代谢反应，具体步骤为：
做酶代谢活性检测时，先将冻存的gs115和构建的重组his+mut+菌株进行活化，经传代扩培后，酵母大量增殖，甲醇诱导培养72h后分为给药组和溶剂对照组，72h诱导结束，大量收集菌体，加入一定量的酸洗玻璃珠进行涡旋震荡，然后在微粒体缓冲液(菌体重量：缓冲液体积ml数＝1:4)的作用下低温超声破碎细胞，先4℃，9000g，离心20min，将上清液转移至35ml超速离心管中(提前预冷)，然后4℃，100000g离心1h，弃去上清。适量微粒体缓冲液重悬沉淀，分装至ep管中-80℃冻存。
将制备的酵母微粒体用pbs溶液调整到工作浓度0.15mg/ml，向反应玻璃管中添加75μm浓度的底物睾酮混合，37℃水浴反应计时20min。时间结束取100μl加入含有内标的反应终止液。14000rpm离心30min，取上清加96孔板进行lc-ms/ms分析。lc-ms/ms检测结果表明未检测到代谢产物。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>中山珐玛斯医药科技有限公司
<120>一种提高cyp3a5表达酶代谢活性的方法
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