本发明涉及植物来源的诱导表达启动子，具体涉及一种受植物激素诱导的杨树启动子ppstmm及其应用。
背景技术：
植物完成光合和蒸腾等重要生理功能有赖于植物表皮上的特殊结构——气孔的调控作用，气孔通常由一对保卫细胞围绕形成的孔隙构成，保卫细胞构成的气孔器与气孔周围存在形态异于表皮细胞的副卫细胞一起称为气孔复合体。气孔是植物吸收co2和散发水分的重要通道，对空气中的碳氧平衡、自然界的水分平衡以及植物生命活动起着重要作用。尽管对气孔的形成发育过程在拟南芥等其他物种中已经研究较为深入，在杨树中也见报道关于气孔形态和物种品系不同抗旱性之间的相关性，但对杨树气孔发育的分子机理研究目前并不十分常见，因此，深入开展杨树气孔起始发育调控的分子机理研究，对于从分子水平上了解耐旱植物气孔的发生和适应性进化机制的异同有重要的理论意义。
一直以来，国内外研究者对林木分子生物学研究的模式物种——杨树的生长发育的研究基本包含了根、叶、花等主要的器官和组织，对气孔这样的微小组织的研究兴趣和重视程度并不够，且仅有的也基本着重在表面的形态学研究，杨树气孔调控发育的分子研究相对滞后。然而，气孔对于植物生理、自然界水气循环的重要性，使得系统研究杨树气孔发育调控的分子机理有其必要性和迫切性，所挖掘的特异资源在林木基因工程领域具有广阔的应用前景。
tmm基因编码富含亮氨酸重复序列的受体类蛋白(lrr-rlp)，蛋白的保守区域是亮氨酸重复序列区域(lrr)，其在维持气孔的增值和正确分布等过程中起着非常重要的作用。在叶片的气孔发育途径中，tmm作为一个正调控因子增加了拟分生组织增殖分裂的次数，能够纠正气孔发育过程中的错误分布模式，而作为负调控因子可以控制邻近细胞间隔分裂的速度，降低产生卫星拟分生组织细胞形成过多气孔的可能性。在气孔发育过程中tmm基因特异性始终在衍生保卫细胞系列中表达。在杨树中克隆和鉴定气孔发育特异表达启动子，不仅可丰富植物气孔分子生物学的理论基础，而且在植物基因工程改造方面具有重要的应用价值。植物基因工程中常用的启动子有3类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。
技术实现要素：
发明目的：本发明提供了一种受植物激素诱导的杨树启动子ppstmm；本发明进一步地提供了含受植物激素诱导的杨树启动子ppstmm的载体、重组农杆菌或重组植物，本发明更进一步地提供了受植物激素诱导的杨树启动子ppstmm在植物激素胁迫下诱导gus基因上调表达中的应用。
技术方案：本发明所述一种受植物激素诱导的杨树启动子ppstmm，其核苷酸序列如seqidno:1所示。
其中，所述植物激素为赤霉素(ga)、萘乙酸(naa)、脱落酸(aba)、水杨酸(sa)中的任意一种或几种。
其中，所述杨树启动子ppstmm的构建方法，步骤如下：以小叶杨dna为模板，设计简并引物进行pcr扩增；所述简并引物包括：
第一对引物：
f1-5’attggagagtgtggccctcttttac3’、
r1-5’cgatcaatccacccacccagcttta3’；以及
第二对引物：
f2-5’tgttgagcctgagtagctgttggtt3’、
r2-5’gttggtgcgtggagtgaaaaggcta3’。
本发明进一步地提供含受植物激素诱导的杨树启动子ppstmm的载体，在所述载体的启动子ppstmm3’端组装gus基因；所述载体的构建步骤如下：
(1)将pmd19-ppstmm载体使用hindiii和bamhⅰ双酶酶切，回收带酶切位点的ppstmm启动子；
(2)将35s-pbi121-gus载体使用hindiii和bamhⅰ双酶酶切，得到缺失35s启动子区的pbi121-gus载体；
(3)将步骤(1)得到的带酶切位点的ppstmm启动子和步骤(2)得到的缺失35s启动子区的pbi121-gus载体使用t4dna连接酶连接，得到ppstmm-pbi121-gus载体。ppstmm-pbi121-gus载体组装kanr基因，作为转基因植物的筛选标记，用卡那霉素进行转基因植株的筛选；还组装lb和rb序列，促使组装于其间的ppstmm启动子表达框架和筛选标记基因kanr整合至植物受体细胞染色体中。
其中，所述pmd19-ppstmm载体(ta克隆)的制备步骤如下：
(1)将pcr扩增的ppstmm进行琼脂糖凝胶电泳，使用回收试剂盒(薄型琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、gk2043-50、上海捷瑞生物工程有限公司)纯化回收目的产物；
(2)将步骤(1)回收的目的产物与克隆载体pmd19-tvector(pmdtm19-tvectorcloningkit、6013、takara)按照反应体系进行混合，4℃反应12h，获得pmd19-ppstmm载体。
本发明进一步地提供所述受植物激素诱导的杨树启动子ppstmm的重组菌。
具体地，所述重组菌为重组农杆菌，构建方法包括以下步骤：
(1)将pmd19-ppstmm载体使用hindiii和bamhⅰ双酶酶切，回收带酶切位点的ppstmm启动子；
(2)将35s-pbi121-gus载体使用hindiii和bamhⅰ双酶酶切，得到缺失35s启动子区的pbi121-gus载体；
(3)将步骤(1)得到的带酶切位点的ppstmm启动子和步骤(2)得到的缺失35s启动子区的pbi121-gus载体使用t4dna连接酶连接，得到ppstmm-pbi121-gus载体；
(4)使用电击转化法将步骤(3)构建的ppstmm-pbi121-gus载体转入农杆菌中。
本发明进一步地提供所述受植物激素诱导的杨树启动子ppstmm的转基因植物。具体地，所述转基因植物为转基因烟草。
其中，转基因植物的构建方法，包括以下步骤：
(1)将pmd19-ppstmm载体使用hindiii和bamhⅰ双酶酶切，回收带酶切位点的ppstmm启动子；
(2)将35s-pbi121-gus载体使用hindiii和bamhⅰ双酶酶切，得到缺失35s启动子区的pbi121-gus载体；
(3)将步骤(1)得到的带酶切位点的ppstmm启动子和步骤(2)得到的缺失35s启动子区的pbi121-gus载体使用t4dna连接酶连接，得到ppstmm-pbi121-gus载体；
(4)使用电击转化法将步骤(3)构建的ppstmm-pbi121-gus载体转入农杆菌中；通过农杆菌介导转化技术将启动子ppstmm转移至植物，即得转基因植物。
本发明更进一步地提供所述受植物激素诱导的杨树启动子ppstmm在植物激素胁迫下诱导gus基因上调表达中的应用。诱导型启动子可在一定范围内适应生物或非生物胁迫等环境的变化启动基因的表达。这类启动子中一般同时存在包括光、温度、激素应答的元件，其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共同决定。诱导型启动子与抗逆基因融合，可使转基因植物更好地适应逆境。
有益效果：本发明通过农杆菌介导技术将ppstmm启动子转入烟草中得到转基因烟草，转基因烟草的gus染色结果显示，gus基因可在植物激素(ga、naa、aba和sa)胁迫下表达上调。进一步地，本发明提供的ppstmm启动子可应用在植物基因工程中，诱导相应目的基因在植物激素胁迫下表达上调，提高植物的抗逆性。
附图说明
图1为35s-pbi121-gus表达载体的结构示意图；
图2为ppstmm启动子驱动下gus基因的表达模式；
图3为植物激素诱导下烟草中gus基因表达量。
具体实施方式
实施例1克隆ppstmm启动子
以小叶杨dna为材料，参考杨树基因组序列信息(http://www.phytozome.net/)，查找petmm基因上游约2000bp序列，使用oligo7软件设计简并引物，扩增ppstmm启动子序列，高保真pcr反应体系见表1。其中，简并引物包括：正向引物：f1-5’attggagagtgtggccctcttttac3’、f2-5’tgttgagcctgagtagctgttggtt3’；反向引物：r1-5’cgatcaatccacccacccagcttta3’、r2-5’gttggtgcgtggagtgaaaaggcta3’。
其中，使用天根生化科技(北京)有限公司生产的新型基因组dna提取试剂盒(dp320)提取小叶杨的dna。
表1高保真pcr反应体系
反应条件如下：(1)预变性94℃3min；(2)94℃30s－60℃30s－72℃2min)×38个循环；(3)72℃10min。对扩增产物测序，得ppstmm启动子序列(2336bp)，如seqidno:1所示。
实施例2ppstmm-pbi121-gus载体构建
(1)利用双酶切-t4dna酶连技术构建ppstmm-pbi121-gus表达载体。使用bioxm软件对ppstmm基因启动子序列进行酶切位点预测，结合35s-pbi121-gus表达载体酶切位点，选取hindiii(taraka,1060s)和bamhⅰ(taraka,1010s)分别对pmd19-ppstmm载体和35s-pbi121-gus表达载体进行双酶切，37℃反应12h，65℃灭活10min；pmd19-ppstmm酶切体系见表2，35s-pbi121-gus酶切体系见表3。
其中，pmd19-ppstmm载体(ta克隆)的制备步骤如下：将实施例1pcr扩增得到的ppstmm进行琼脂糖凝胶电泳，使用回收试剂盒(薄型琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、gk2043-50、上海捷瑞生物工程有限公司)纯化回收目的产物；将回收的目的产物与克隆载体pmd19-tvector(pmdtm19-tvectorcloningkit、6013、takara)按照反应体系进行混合，4℃反应12h，获得pmd19-ppstmm载体；ta克隆反应体系如表4。
所述35s-pbi121-gus载体的结构见图1，含有35s启动子和gus报告基因。
表2pmd19-ppstmm酶切体系
表335s-pbi121-gus酶切体系
表4ta克隆反应体系
(2)回收(薄型琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、gk2043-50、上海捷瑞生物工程有限公司)带酶切位点的ppstmm和缺失35s启动子区的pbi121-gus载体进行t4dna连接酶连接，4℃反应12h，酶连体系见表5。
表5酶连体系
(3)通过pcr检测及测序验证，确认启动子载体构建成功，命名为ppstmm-pbi121-gus，该载体在ppstmm启动子的3’端组装gus报告基因，其编码的β-葡萄糖苷酸酶，能催化5-溴-4-氯-3吲哚葡萄糖苷酸(x-gluc)形成不溶解的5,5’-二溴-4,4’-二氯深色的靛蓝色物质，使得具有gus活性的部位呈现蓝色。
实施例3ppstmm启动子表达模式分析
通过电击转化法(bio-radmicropulser伯乐电转仪；电击杯：bio-rad伯乐电击杯1652086；电击条件：输出范围200-3000v、精度10v，使用电压2.5kv，时间常数1.0ms、精度0.1ms，使用温度：室温；抗性：利福平rif)将所构建的ppstmm-pbi121-gus转入农杆菌菌株lba4404(invitrogen)，通过农杆菌介导技术(何光源.植物基因工程实验手册[m].北京:清华大学出版社，2007)
将ppstmm启动子转入烟草。转ppstmm启动子载体的t1代烟草植株分别用1mm的ga、naa、aba和sa处理，所有处理对照均采用去离子水替代喷洒叶面，24h后，gus染色结果如图2：a-未胁迫的茎和根；b-未胁迫的幼茎和叶；c-sa胁迫；d-ga胁迫；e-nna胁迫；f-aba胁迫。通过与图2a和2b的对照植株gus染色图对比，显示在1mm的ga、naa、aba和sa(图2c，2d，2e，2f)胁迫下，在gus基因表达量大幅上调，因此，应用本发明提供的启动子，可以在植物基因工程中，诱导相应目的基因表达上调。
实施例4
通过电击转化法将所构建的ppstmm-pbi121-gus转入农杆菌菌株lba4404(invitrogen)，通过农杆菌介导将ppstmm启动子转入烟草。转ppstmm启动子载体的t1代烟草植株分别用1mm的ga、naa、aba和sa处理，所有处理对照均采用去离子水替代喷洒叶面，24h后利用tiangen(北京)生物公司的rna提取试剂盒提取处理转基因烟草基因组rna，用大连宝生物公司生产的primescriptreversetranscriptase试剂盒进行rna反转得到cdna模板；用oligo7软件设计荧光定量gus基因和烟草actin内参基因引物，均由金斯瑞生物技术公司(南京)合成，其中qrt-gus-f：5‘-gtgaagggcgaacagttcct-3’；qrt-gus-r：5‘-atgcgaggtacggtaggagt-3’；actin-f5‘-ggtagctccacctgagaggaagt-3’；actin-r：5‘-gcctttgcaatccacatctgt-3’。利用faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)定量试剂盒进行pcr检测gus基因的表达量，rt-pcr反应体系见表5，反应程序如下：50℃1min－95℃1min－(95℃15s)×40个循环－(60℃15s)×40个循环。
表5rt-pcr反应体系
结果见图3，与对照植株gus染色图对比，显示在1mm的ga、naa、aba和sa胁迫下，gus基因表达量大幅上调，因此，应用本发明提供的启动子，可以在植物基因工程中，诱导相应目的基因表达上调。
序列表
<110>南京林业大学
<120>一种受植物激素诱导的杨树启动子ppstmm及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2336
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
attggagagtgtggccctcttttactgtcacattcttgaccattttgaagatgctctttt60
tattggtcaaaatcaacacaattaccggatttcagaggagttgtaaatttacagagacca120
gcaggtgggaattttattattattattattctttgttcacagtaaaccttatgctgttgg180
attattgaagtggtttgtcaatgttgagcccgagtagctgttggtcttgcccagataata240
tttgagctcaagccaactttcctctcagggaagttttacatgcataagaagaaaaactta300
agttgttctttatggataaaatgatgagattacattaaaggatggtccattggagctaga360
atcttcttttctgcataaatgcatgcaaatgagattctgaagctacagggccttgccaac420
ttcatccattttattagttttctggaaaattttagaaagcaataattgtgcaagtggatt480
ggtgtagcatacacatagatctatgtctagaacgattctagcttggagtagagaccatta540
tgctagaagacctcaatattaacctgtcatcttttccttcttttctttgcaaagacaatt600
ttctaatttggttctttgactctcagcatatttagtttgtcagcatacaatgttcagaag660
gctacattatacaaaatatgtccacactgaattgtgattttggcatttaaaacaggtgaa720
aacagttgaaggaacaagggagcttcaaaatatgtccacactgtttcttgattttggcat780
atatatatatttgctttagtttatgctgtttgatgtttatatgccccttccagttccaat840
ccaattttaaccattagaatggtgatttaggcctctgcttgtctgaagctcagagtgatc900
tgtttcttgataagataggtcatataatggtcgatatgactggttatccctaattcagtg960
gaatttaagcttgatttatacatttttattttctaagtacattttgagcttcgagttaaa1020
atggtgatttaggttctgacttgtttgacaatgactatttcttgataagatggggctcta1080
tacattcagtataaaactgataatctctgattcattgtagtatattaatgggtaattttg1140
caatgaattgttgctctagcggttaaggcactgttatattcttgtaaaagcgagaatata1200
agttttgatttctagaaaacacatttattgggaggggcagctacaaaccttaaacgagac1260
taattttacctttttaaagggtgtaaggattctcagataagattaaaaaaattaataata1320
ttaatgattaatttctgctgttttattttacctttttatatatacatacatatatataca1380
cacacacactactgagcttgactgatgactgatgcttaaacatagtgcttaattgcagct1440
ctgttgttataaattcatcttctcatttgttttgatactttctcatgatcaaatgttggt1500
gttaataatttgcatccttgccatcaaaacataatttacatctttaatcgagcttaactc1560
aaacgtgatgccaatgtttaccagtgtcaaagagcgtgaattgcttggagagcttgcttc1620
actgagtaatactagtatcagtcgttcacgaactcggcccaaaactcagcctgacagtaa1680
gcaattgttcgctattggtagatgatatcgtgtttgatataattgtgatttgcctaattt1740
gtgtttttttttttttttcctgaaagtaatgaacaaaataacatattccatggtaagatt1800
ttgactatctgaagcatacatcaacataatgacctgtgctgcttcatattccccaggagc1860
cattctctcttaaaatctgggctcaatgtcacctgctctttgtgacccattctttcattt1920
ctcaaggatgctgcttgcaacttttgactagattatgcaagcatccatgcttaagaagct1980
ctgcccttgtctcaatatttgagcgaattcccatcaccgggcttcatatttccttttgta2040
tttatctcggcagttcttcatagaataattgaatttcttttgaaacagcaatcatatatt2100
taaaatgaattttatttttcagagctagaaaactaaaagaaaaaaagaaaagaagaagag2160
ggccaaggtggctaggcttctctggacctagattattgggctgcacacctggcctatata2220
aaaaggccagatgcgctcgcaatcttttttctttttcttttttatagacggtggagatac2280
gtatatctgtgtgaagcccacctcctacagctaaagctgggtgggtggattgatcg2336