本发明涉及油菜育种及分子生物学
技术领域：
，尤其是涉及一种与油菜蕾苔期抗旱性相关的功能标记及其应用。
背景技术：
：作物在生长过程中经常遭受到各种生物胁迫和非生物胁迫，其中干旱是对作物生长和产量影响最严重的非生物胁迫中之一。油菜是世界重要的油料作物，我国每年油菜种植面积和总产出约占世界的1/3。干旱直接影响油菜的生长，导致油菜总荚数、每荚粒数、单株种子数及单株产量的显著下降，严重影响油菜产量。长江流域是我国油菜主产区，虽然降雨充沛，但全年降水分布不均匀，季节性干旱频发(胡承伟,等.peg模拟干旱胁迫下甘蓝型油菜的根系特性与抗旱性.中国油料作物学报,2013,35:048-053)，比如2010年发生的西南五省冬、春季特大干旱，2011年长江中游五省的春、夏季特大干旱。研究表明，春旱使中国长江中下游地区的油菜平均减产20％以上(白鹏,等.干旱胁迫对油菜蕾薹期生理特性及农艺性状的影响.中国农业科学,2014,47:3566-3576.)。而春旱正值油菜蕾薹期，是生长需水量较大时期，此时发生干旱严重影响油菜的形态建成，造成地上部营养体偏小，进而影响油菜产量因子的发育和最后产量的形成。因此，对油菜蕾薹期的抗旱性研究更有意义。提高油菜的抗旱减灾能力，对于保障我国油料供给安全具有重要意义。在长期的进化过程中，作物逐渐形成了避旱、御旱和耐旱等多种干旱胁迫响应机制，其中御旱和耐旱统称为抗旱性。御旱性是植物加强根部水分吸收、减少地上部分的水分蒸发来抵御干旱的能力。耐旱性主要是通过生理和生化调节来实现的，如合成小分子糖类、醇类、醛类来提高提高渗透调节能力，防止细胞水分的散失，以及产生胁迫感应信号、启动体内的防御系统和活性氧清除系统来维持细胞结构的稳定性，从而在一定程度上减轻和缓解干旱造成的影响(景蕊莲.作物抗旱研究的现状与思考.干旱地区农业研究,1999,17:79-85)。实践证明，培育和应用抗旱性作物品种是应对农业干旱的最经济有效的手段。然而，植物抗旱性属多基因控制的数量性状，而且抗旱性鉴定周期长，易受环境因素影响，因而通过常规育种方法改良作物抗旱性的效果往往不理想。随着分子生物学的发展，利用特定的分离群体对抗旱性开展qtl分析，获得抗旱性相关的分子标记并进行标记辅助选择，则可显著提高抗旱育种的效率。比如，李真等人利用一个dh群体，利用ssr和aflp标记对油菜苗期的抗旱性和耐渍性进行了qtl分析，共检测到28个有关的qtl(mappingofqtlassociatedwithwaterloggingtoleranceanddroughtresistanceduringtheseedlingstageinoilseedrape.euphytica,2014,197:341-353)。王丹丹等以f2:4群体为材料，采用复合区间作图方法，对苗期叶绿素质量分数、叶片相对含水量、叶片保水力、可溶性糖质量分数、丙二醛质量分数5个耐旱相关性状及其耐旱系数进行了qtl分析，共检测到8个qtl(王丹丹,等.甘蓝型油菜遗传图谱构建及苗期耐旱相关性状的qtl定位.西南大学学报,2014,36:8-16.)。荐红举等通过构建重组自交系高密度snp遗传图谱，找到8个发芽期抗旱相关的qtl位点(荐红举,等.利用snp遗传图谱定位盐、旱胁迫下甘蓝型油菜种子发芽率的qtl.作物学报,2014,40:629-635.)。然而，上述研究的局限性在于，所检测到的抗旱qtl的效应均较小，无法应用到育种实践中。而且，即使在标记辅助选择过程中进行了使用，也有可能因为遗传重组或遗传漂移而丢失目标基因(collardbc,mackilldj.marker-assistedselection:anapproachforprecisionplantbreedinginthetwenty-firstcentury.philosophicaltransactionsoftheroyalsocietyoflondonseriesb,biologicalsciences,2008,363:557-572)。因此，选用合适的方法，制备与油菜蕾苔期抗旱性高度关联的功能标记具有重要的意义。因此，特提出本发明。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是如何高效、准确的鉴定油菜蕾苔期的抗旱性，从而辅助油菜的育种，进而解决育种过程中抗旱鉴定工作量大、周期长、易受环境影响的问题。为解决上述技术问题，本发明提供了一种与油菜蕾苔期抗旱性相关的功能标记，所述功能标记的获得方法为：以油菜总dna为模板，采用引物bndm-413-f和引物bndm-413-r进行pcr扩增；所述引物bndm-413-f为：5′-gccaccggtatctttccgtta-3′；所述引物bndm-413-r为：5′-gtgccactggcttgttttctt-3′。进一步的，所述获得方法具体包括以下步骤：(1)以强抗旱性油菜品种和干旱敏感性油菜品种为亲本，杂交得到f1代群体，所述f1代群体自交得到f2代群体，所述f2代群体自交得到f2:3代家系群体；(2)用ctab法提取所述亲本和所述f2代群体单株叶片的dna，采用srap引物对进行pcr扩增，扩增产物用6g/l变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，硝酸银染色后获得分子标记数据；(3)采用叶片萎蔫指数法测定所述f2:3代家系群体中每个家系的蕾苔期的叶片萎蔫指数，获得抗旱性表型数据；(4)运用统计软件spss软件中的多元线性回归模块对所述分子标记数据和所述抗旱性表型数据进行关联分析，以回归显著性p<0.05和贡献率>10％为标准，筛选得到与油菜蕾苔期抗旱性的相关性最显著的分子标记；(5)对所述分子标记进行测序，根据所述分子标记的核苷酸序列重新设计pcr引物，并以所述分子标记为模板进行pcr扩增，得到与油菜蕾苔期抗旱性相关的功能标记，所述pcr引物为引物bndm-413-f和引物bndm-413-r；所述引物bndm-413-f为：5′-gccaccggtatctttccgtta-3′；所述引物bndm-413-r为：5′-gtgccactggcttgttttctt-3′。进一步的，步骤(1)中，所述强抗旱性油菜品种为秦油8号，所述干旱敏感性油菜品种为沪油6号。进一步的，步骤(2)中，所述srap引物对为20个上游引物和40个下游引物的随机组合，具体序列如下：另外，本发明还提供了一种鉴定油菜蕾苔期抗旱性的引物对，所述引物对为引物bndm-413-f和引物bndm-413-r：所述引物bndm-413-f为：5′-gccaccggtatctttccgtta-3′；所述引物bndm-413-r为：5′-gtgccactggcttgttttctt-3′。另外，本发明还提供了一种鉴定油菜蕾苔期抗旱性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)以待鉴定油菜的总dna为模板，采用引物bndm-413-f和引物bndm-413-r进行pcr扩增；所述引物bndm-413-f为：5′-gccaccggtatctttccgtta-3′；所述引物bndm-413-r为：5′-gtgccactggcttgttttctt-3′；(2)检测所述pcr扩增的产物的核苷酸序列，如果所述pcr扩增的产物的核苷酸序列和与油菜蕾苔期抗旱性相关的功能标记的核苷酸序列(seqidno：3)相同，则所述待鉴定油菜为抗旱性；如果所述pcr扩增的产物的核苷酸序列和与油菜蕾苔期抗旱性相关的功能标记的核苷酸序列(seqidno：3)不同，则所述待鉴定油菜为抗旱敏感性。进一步的，所述pcr扩增的反应体系为：待鉴定油菜的总dna25ng/μl2μl，引物bndm-413-f50ng/μl1μl，引物bndm-413-r50ng/μl1μl，10×pcrbuffer2μl，dntps10mmol/l0.4μl，mgcl225mmol/l1.6μl，taq酶5u/μl0.5μl，ddh2o11.5μl；所述pcr扩增的条件为：94.0℃变性30s，58.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，40个循环；72.0℃延伸10min；4℃反应终止。另外，本发明还提供了所述功能标记、所述鉴定油菜蕾苔期抗旱性的引物对在鉴定油菜蕾苔期抗旱性中的应用。另外，本发明还提供了所述功能标记、所述鉴定油菜蕾苔期抗旱性的引物对、所述鉴定油菜蕾苔期抗旱性的方法在油菜育种中的应用。另外，本发明还提供了一种油菜育种方法，按照所述鉴定油菜蕾苔期抗旱性的方法，选择抗旱性的油菜单株作为亲本进行育种。本发明通过筛选获得了与油菜蕾苔期抗旱性相关的功能标记，根据该功能标记进行鉴定，可以高效、快速、准确的鉴定油菜的抗旱性，显著提高抗旱性的选择效率，加快油菜品种的抗旱性遗传改良步伐。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为srap引物对em02/me20在f2群体中的多态性检测情况；图2为功能标记bndm-413的检测情况。具体实施方式下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明通过筛选和优化，获得了与油菜蕾苔期抗旱性相关的功能标记，并将其命名为bndm-413。为了有助于更清楚的理解本发明，现结合具体的实施例详细介绍如下。在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。实施例1与油菜蕾苔期抗旱性相关的功能标记bndm-413的获得一、群体构建：以强抗旱性油菜品种秦油8号(叶片萎蔫指数为0.06，公知公用的品种)为母本，干旱敏感性油菜品种沪油16(叶片萎蔫指数为0.94，公知公用的品种)为父本，经1次杂交和2次自交构建了一个抗旱性分离的f2:3代家系群体，共183个株系。二、dna提取(一)采集亲本及f2群体的183个单株的幼嫩叶片，采用ctab法提取叶片的总dna，具体提取步骤如下：(1)将新鲜或-20℃冰冻保存的叶片0.5g放入1.5ml离心管中，用玻璃棒磨为匀浆，加入800μlctab提取液(50mmol/ltris-hcl,ph8.0；20mmol/ledta,ph8.0；50mmol/lnacl,1g/lctab)并摇匀，65℃水浴30min；(2)取出离心管，加入400μl的纯氯仿，在振荡仪上2000rpm震荡30s，然后室温(20～25℃以下相同)下12000rpm离心6min，取上清液(约400μl)；(3)在上清液中加入两倍体积的无水乙醇(约800μl)，冰上静置30min后，再12000rpm离心8min收集dna沉淀；(4)dna沉淀自然风干后，加入双蒸水200μl溶解即可使用。三、srap标记分析以提取的总dna为模板，进行srap标记分析，具体步骤如下：(1)pcr反应体系表1srap标记分析的pcr反应体系dna模板(25ng/μl)1.0μlsrap正向引物(50ng/μl)0.5μlsrap反向引物(50ng/μl)0.5μl10×pcrbuffer1.0μldntps(10mmol/l)0.2μlmgcl2(25mmol/l)0.8μltaq(5u/μl)0.5μlddh2o5.5μl如表1所示，本pcr体系中，所使用的taq酶购自fermentas公司，所使用的pcrbuffer的主要成分为：750mmol/ltris-hcl,200mmol/l(nh4)2so4和0.1％(v/v)tween20，ph8.8。其中，srap引物对为20个上游引物(em01～em20)和40个下游引物(me01～me40)的随机组合，可组配800对引物组合，(引物来源请参见文献：lig,quiroscf.sequence-relatedamplifiedpolymorphism(srap),anewmarkersystembasedonasimplepcrreaction:itsapplicationtomappingandgenetagginginbrassica.theoreticalandappliedgenetics,2001,103:455461)，具体的上游引物和下游引物如表2所示：表2本发明所使用到的srap标记引物序列(2)pcr扩增程序：95.0℃预变性3min；94.0℃变性30s，35.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，共10个循环；94.0℃变性30s，50.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，共30个循环；72.0℃延伸10min，4℃保存。pcr反应在美国bio-rad公司生产的ptc-200型pcr仪上进行。反应完成后，在扩增产物中加入等体积的变性凝胶电泳上样缓冲液(配制方法：在100ml去离子甲酰胺中，加入ph8.0的0.5mol/ledta溶液2ml，二甲苯青ff干粉5mg，溴酚蓝干粉5mg，充分溶解后摇匀)，95℃变性5min后立即冰浴冷却，4℃放置备用。(3)电泳检测：pcr产物在6g/l变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，电极缓冲液为1×tbe，上样量为2.5μl，恒压1500v电泳分离。凝胶染色采用硝酸银快速染色法，胶板无需固定，直接在1g/l硝酸银溶液中浸泡10min，超纯水漂洗30s，然后转入预冷的显色液(5g氢氧化钠干粉，1l超纯水溶解，然后加入3ml37％(v/v)的甲醛)快速摇动至条带出现为止，最后用10％(v/v)冰醋酸溶液固定。胶板自然晾干，人工读带并拍照保存，获得分子标记数据。分子标记数据的记录方法是，在胶板上迁移率相同(分子量相同)的条带记录为一个标记，有带记录为“1”，无带记录为“0”，该标记以扩增所用的srap引物名称和分子量命名，中间用短划线分开。四、抗旱性表型数据获取在干旱棚中对亲本及f2:3代家系群体的183个家系的蕾苔期抗旱性进行鉴定，获取亲本及f2:3代家系群体的抗旱性表型数据，具体的步骤是：(1)田间试验采用随机区组设计，设置3个重复，每重复种植1行。整地前按1500kg/hm2均匀施俄罗斯复合肥(中化化肥有限公司生产)，n、p、k的比例为16:16:16，播种后不再施加追肥。在正季播种两个亲本及183个f2:3代家系群体，每份材料播种1行。播种后立即均匀浇水，保证其正常发芽和生长。25d后进行间苗和定苗，株、行距分别为0.1m和0.3m，行长2.4m。(2)利用喷灌设施进行精量分行供水，土壤含水量利用sm-5m土壤湿度传感器进行实时监测，从现蕾期(即小区75％植株剥开主茎顶端1～2片小叶能见到明显花蕾的时期)开始处理，当0～40cm的土壤层平均含水量降低到15％时认为干旱胁迫开始(约需要3d)，到抽薹期(即小区75％以上植株主茎伸长且主茎顶端离子叶节达10cm为止)结束，约持续30d，抗旱性调查结束后立即恢复供水。田间管理按常规方法进行。(3)叶片萎蔫指数在干旱胁迫后30d进行。首先以小区为单位，中午时分连续观察记载最大平展叶的萎蔫指数。油菜叶片萎蔫指数分为5级：1级为无萎蔫(赋值为0.00)；2级为轻微萎蔫(<10％植株萎蔫，赋值为0.25)；3级为萎蔫(40～70％植株萎蔫，赋值为0.50)；4级为明显萎蔫(>90％植株萎蔫，赋值为0.75)；5级为严重萎蔫(叶片黄化、褐化或大部分叶片死亡或脱落，赋值为1.00)。(4)抗旱性鉴定标准：萎蔫指数越大，其抗旱性就越差；反之萎蔫指数越小，则其抗旱性越强。根据萎蔫指数的大小，对油菜蕾苔期抗旱性水平进行划分，见表3。根据以上标准，记录得到亲本及f2:3代家系群体的抗旱性表型数据。表3油菜蕾苔期抗旱性等级划分标准叶片萎蔫指数区间抗旱性等级0.70～1.00敏感0.30～0.70中等0.00～0.30高抗五、关联分析参照文献(roy，等.associationanalysisofagronomicallyimportanttraitsusingssr,samplandaflpmarkersinbreadwheat.currentscience,2006,90:683-689.)的方法，将按照上述方法得到的抗旱性表型数据与分子标记数据进行关联分析，具体是以抗旱性表型为因变量，各个分子标记为自变量，采用统计分析软件spps9.0中的多元回归模块(逐步回归法)进行回归分析，建立最优回归方程，并获得各个回归变量的统计数据(回归系数大小、显著水平和贡献率等)。确定分子标记与抗旱性存在显著关联的标准是：回归系数显著水平p<0.05，且单个标记的贡献率>10％。利用群体中获得的3254个分子标记数据进行回归分析，建立了一个包含16个标记的多元回归方程。方程的回归系数是0.867(显著水平p<0.001)，可通过回归解释的表型方差占69.4％，其中贡献率最大的分子标记是em02/me20-752，贡献率为37.2％，其余标记的贡献率均较小(<16.5％)。图1箭头所示条带即为分子标记em02/me20-752。六、与油菜蕾苔期抗旱性相关的功能标记的获得将分子标记em02/me20-752进行回收，测序，发现分子标记em02/me20-752的序列与拟南芥基因at5g16400高度同源，该基因编码电子传递蛋白，但与抗旱性的关系未见报道。根据分子标记em02/me20-752的核苷酸序列，重新设计了1对特异性pcr引物，成功将分子标记em02/me20-752转化为功能标记bndm-413，pcr扩增产物的大小是413bp(序列如seqidno：3所示)，如图2所示，所用的pcr引物为引物bndm-413-f和引物bndm-413-r：引物bndm-413-f：5′-gccaccggtatctttccgtta-3′；引物bndm-413-r：5′-gtgccactggcttgttttctt-3′。实施例2功能标记bndm-413在鉴定油菜蕾苔期抗旱性中的应用一、群体构建：以强抗旱性油菜品种秦油8号(叶片萎蔫指数为0.06，公知公用的品种)为母本，干旱敏感性油菜品种沪油16(叶片萎蔫指数为0.94，公知公用的品种)为父本，杂交后得到f1代群体，f1代群体套袋自交得到f2代群体。二、dna提取从f2代群体中随机选择100个单株，提取其dna，具体操作步骤与实施例1中dna提取方法相同。三、pcr扩增以上述提取的dna为模板，采用功能标记bndm-413的引物bndm-413-f和引物bndm-413-r进行pcr扩增，引物bndm-413-f为：5′-gccaccggtatctttccgtta-3′；引物bndm-413-r为：5′-gtgccactggcttgttttctt-3′。pcr扩增体系：dna模板25ng/μl2μl，引物bndm-413-f50ng/μl1μl，引物bndm-413-r50ng/μl1μl，10×pcrbuffer2μl，dntps10mmol/l0.4μl，mgcl225mmol/l1.6μl，taq酶5u/μl0.5μl，ddh2o11.5μl；pcr扩增条件：94.0℃变性30s，58.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，40个循环；72.0℃延伸10min；4℃反应终止。pcr产物扩增产物经15g/l琼脂糖凝胶电泳分离，记录实验数据。四、抗旱性表型数据获取测定上述100个单株的抗旱性表型数据，具体操作步骤与实施例1中抗旱性表型数据的获取方法相同。五、利用功能标记bndm-413对油菜抗旱性的鉴定效果分析该f2群体的100个单株的平均叶片萎蔫指数为0.567，功能标记bndm-413的鉴定结果如表4所示，利用功能标记bndm-413进行鉴定后可将该群体分为两类，第一类群体为出现特异性413bp带型的单株，共44株，其平均萎蔫指数为0.216，显著低于群体平均值0.567(p<0.001)；第二类群体为缺失413bp带型的单株，共56株，其平均萎蔫指数为0.874，显著高于群体平均值0.567(p<0.01)。表4耐湿鉴定分子标记bndm-413在f2群体中的鉴定效果上述实验表明含有功能标记bndm-413的群体，其抗旱性较强；而不含功能标记bndm-413的群体，其抗旱性较差，这表明，功能标记bndm-413能够起到鉴定油菜是否具有抗旱性的功能。实施例3功能标记bndm-413在鉴定油菜蕾苔期抗旱性中的应用参照实施例2的方法，扩大鉴定范围。总共分析检测了f2群体的183个单株，结果表明，f2群体中有带的单株为76株，由其繁殖得到的76个f2:3代家系群体的平均萎蔫指数为0.305，显著低于群体的平均值0.567(p<0.001)，即抗旱性显著提高。以上结果充分说明，该标记确实可以用于抗旱性的预测、鉴定和筛选。实施例4功能标记bndm-413在油菜育种中的应用结合实施例2和实施例3中功能标记bndm-413在鉴定油菜蕾苔期抗旱性中的应用可知，在育种中通过功能标记bndm-413鉴定筛选，保留出现413bp特异带型的单株，淘汰缺失413bp特异带型的单株，即可显著提高群体的抗旱性水平(提高61.9％)，提高选择效率，减少筛选鉴定的工作量(减少56％)，加速育种进程。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>湖北工程学院<120>与油菜蕾苔期抗旱性相关的功能标记及其应用<130>1<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1gccaccggtatctttccgtta21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2gtgccactggcttgttttctt21<210>3<211>413<212>dna<213>油菜<400>3gccaccggtatctttccgttactctccggctccgtccaccccctccggcggaggattacg60tccggcgaagcagcgctgccggatcccgaactcgggcgtcgcggcgaaaacaggatcctg120ttctggcgttggtggtgttttatatttaaggaagaggatcggcggttcctgtgtggcgag180gtgtagcttagaaacggtgaatgtcagtgtcggcgaggtgactgaggttgacaaggacac240gttttggccagttgtcaaagccgctggtgataagcttgttgtcctcgacatgtacactca300gtggtgtggtccatgcaaagttatggctcctaaatacaaagagctatcagagaagtacca360ggacatggtgtttcttaagcttgactgcaacgaagaaaacaagccagtggcac413当前第1页12