本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶及其在催化合成稀有糖d-阿洛酮糖中的应用。
背景技术：
：d-阿洛酮糖(d-psicose)属于一种稀有单糖，作为一种零能量、不被消化的食用糖替代品.由于d-阿洛酮糖具有零热量，难以被肠道消化吸收等特性，被美国食品导航网评价为最具潜力的蔗糖替代品，现多被引用为新型低卡路里甜味剂。同时，d-阿洛酮糖也可以作为肝脂类酶和肠道α-糖苷酶的抑制剂，减少脂肪堆积。诸多研究结果显示d-阿洛酮糖通过抑制睾丸组织中ros的产生，阻止邻苯二甲酸二(2-乙基)乙酯诱导的睾丸损伤。此外d-阿洛酮糖除了对6-羟基多巴胺诱导的细胞凋亡有神经保护的作用外，还能抑制高浓度葡萄糖诱导下的单核细胞趋化蛋白mcp-1的表达。基于d-阿洛酮糖众多的生理功能，在未来食品、医药和化妆品等领域的应用将会非常广泛。d-阿洛酮糖功能活性与人类健康密切相关，建立完善的d-阿洛酮糖的高产体系迫在眉睫。目前d-阿洛酮糖的研究，瓶颈主要集中在如何扩大产业化生产。早期d-阿洛酮糖的合成方法是化学转化，其合成过程不仅繁琐还存在一定的局限性，更不符合当今绿色可持续发展的社会理念。目前生产d-阿洛酮糖主要是利用酶固定转化法，即对酶的克隆表达以及产物的分离精制。不论是化学合成法还是生物转化法制备d-阿洛酮糖，都存在一个大难题，产品分离与精制十分困难。粗产品中的d-阿洛酮糖往往与其他糖混合在一起，不仅产率降低，而且d-阿洛酮糖与其混杂的糖理化性质几乎完全相同，所以很难精制与提纯。为了对当前的d-阿洛酮糖合成体系进行优化，就必须解决这一难题。前期研究表明属于磷酸二羟基丙酮(dhap)依赖型醛缩酶家族的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(以下简称为rhad)在以d-甘油醛为醛受体时，失去了对该醛受体的立体选择性，野生型生成d-阿洛酮糖和d-山梨糖两种稀有糖，两者比例接近于1：1。技术实现要素：本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。因此，作为本发明的其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶，其中：所述定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶由基因序列为由seqidno.1编码的野生型l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶分别经过其氨基酸第29、188、266或152位饱和定点突变而产生的突变体。作为本发明所述定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的一种优选方案，其中：所述其氨基酸第29、188、266或152位饱和定点突变而产生的突变体，包括l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的突变体y152a、突变体n29k、突变体p188c、突变体p188t、突变体p188f、突变体n29i。作为本发明所述定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的一种优选方案，其中：所述由seqidno.1编码的野生型l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶来源于大肠杆菌mg1655菌株。作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供dna分子。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：dna分子，其中，所述dna分子编码权利要求2所述的定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶。作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供质粒载体。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：质粒载体，其中：所述质粒载体装载了权利要求4所述的dna分子。作为本发明所述质粒载体的一种优选方案，其中：所述质粒载体为在pet-28a载体上装载了权利要求4所述的dna分子。作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖d-阿洛酮糖中的应用。作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的制备方法。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的制备方法，其包括，构建突变株重组质粒：将野生型l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因片段连接到质粒载体上，得到野生型l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因重组质粒，以所述野生型l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因重组质粒为模版，对l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因编码氨基酸分别进行第29、188、266或152位氨基酸饱和定点突变，分别得到突变株重组质粒；突变株表达：将所述突变株重组质粒转化大肠杆菌，挑选单菌落接种，iptg16℃诱导表达定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶。作为本发明所述定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的制备方法的一种优选方案，其还包括，蛋白纯化：将经过所述突变株表达的定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶进行纯化。作为本发明所述定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述质粒载体为pet-28a载体，所述突变株重组质粒包括pet28a-rhadn29i、pet28a-rhadn29k、pet28a-rhadp188c、pet28a-rhadp188f、pet28a-rhadp188t、pet28a-rhadt266a、pet28a-rhady152a，所述将突变株重组质粒转化大肠杆菌，为转化大肠杆菌bl21菌株。本发明的有益效果：本发明通过对rhad的氨基酸位点进行定点突变，克服了野生型rhad产生d-阿洛酮糖:d-山梨糖＝1：1，即没有立体选择性的缺陷，实现了rhad催化d-甘油醛为醛受体合成d-阿洛酮糖时的立体选择性，使得催化反应仅产生d-阿洛酮糖或以d-阿洛酮糖为主，经过突变的rhad的酶活高。本发明方法制备的定点突变的rhad制备d-阿洛酮糖，合成效率高、工艺简单、节约成本、d-阿洛酮糖立体选择性催化效率最高达到100％，利用本发明方法实现了工业化rhad催化d-甘油醛大量合成d-阿洛酮糖。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为本发明定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶突变体n29i、n29k、n188c、p188t、t266a、y152a、p188f以及野生型l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶催化合成d-阿洛酮糖的hplc图谱分析示意图。图2为本发明定点突变的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶突变体f211c、f170a、f263a、n29a-y152a催化合成d-阿洛酮糖的hplc图谱分析示意图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。为了描述本发明的方便，使用各种氨基酸残基的常规和非常规缩写。这些缩写是本领域技术人员熟悉的，但是为了清楚在下面列出：asp＝d＝天冬氨酸；ala＝a＝丙氨酸；arg＝r＝精氨酸；asn＝n＝天冬酰胺；gly＝g＝甘氨酸；glu＝e＝谷氨酸；gln＝q＝谷氨酰胺；his＝h＝组氨酸；ile＝i＝异亮氨酸；leu＝l＝亮氨酸；lys＝k＝赖氨酸；met＝m＝甲硫氨酸；phe＝f＝苯丙氨酸；pro＝p＝脯氨酸；ser＝s＝丝氨酸；thr＝t＝苏氨酸；trp＝w＝色氨酸；tyr＝y＝酪氨酸；val＝v＝缬氨酸；cys＝c＝半胱氨酸。本发明所述的突变体命名，按照本领域技术人员常规命名方式，例如：突变体y152a表示l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(rhad)其氨基酸第152位的酪氨酸(y)经过饱和定点突变为丙氨酸(a)。本发明中，大肠杆菌mg1655来源的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(l-rhamnulose-1-phosphatealdolase，rhad)由825个基因编码，将基因序列优化，将rhad编码基因插入到表达载体pet-28a得到重组表达质粒pet-28a-rhad。以质粒pet-28a-rhad为模板，分别对l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶rhad的活性区域位点进行饱和定点突变，以及进行两个以上rhad活性区域位点的组合位点突变，本研究将野生型rhad重组表达质粒pet-28a-rhad作为空白对照。本发明所述大肠杆菌mg1655为本实验室(江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室)保藏菌株。分别挑取上述野生型、经过rhad活性区域饱和定点突变或组合定点突变的单克隆接种到lb液体培养基(50μg/ml卡那霉素)，过夜培养。吸取2ml培养液转接到tb液体培养基(50μg/ml卡那霉素)培养。当od600为0.6～0.8时，加入iptg(终浓度0.2mm),16℃诱导22h后，停止培养，离心收集菌体，弃上清。菌体超声破碎，破碎液高速离心，得到的上清液用avant25蛋白纯化仪纯化目的蛋白。首先用平衡缓冲液对ni2+亲和层析柱进行平衡(10cv)后上样，上样完毕后,再用平衡缓冲液对ni2+亲和层析柱进行平衡(5cv)；用洗涤缓冲液洗脱目的蛋白并收集，洗脱液体用超滤管进行浓缩和脱盐。实施例1：利用bamhi，saci双酶切将rhad编码基因插入到表达载体pet-28a得到重组表达质粒pet-28a-rhad。以质粒pet-28a-rhad为模板，分别对l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶rhad的活性区域位点进行饱和定点突变。野生型l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的基因序列见seqidno.1。引物序列分别为：野生型rhad扩增引物：上游引物rhad-fgcgcggatccatgcaaaacattactcag(下划线序列为bamhi酶切位点)；下游引物rhad-rgcgcgagctcttacagcgccagcgcactg(下划线序列为saci酶切位点)。以及进行两个以上rhad活性区域位点的组合位点突变，本研究将野生型rhad重组表达质粒pet-28a-rhad作为空白对照。所述饱和定点突变的位点分别选取：rhad第29、188、266、152、170、211或263位氨基酸位点，以及进行组合位点突变，即上述单一突变位点分别两两组合，选取29&188氨基酸组合位点突变，29&266氨基酸组合位点突变，29&152位氨基酸组合位点突变。分别挑取含有重组质粒pet28a-rhadn29i、pet28a-rhadn29k、pet28a-rhadp188c、pet28a-rhadp188f、pet28a-rhadp188t、pet28a-rhadt266a、pet28a-rhady152a、pet28a-rhadt170a、pet28a-rhadf211c、pet28a-rhadf263a或pet28a-rhadn29a-y152a的单克隆接种到5mllb液体培养基(50μg/ml卡那霉素)，37℃、220rpm，过夜培养。吸取2ml培养液转接到200mltb液体培养基(50μg/ml卡那霉素)，37℃，220rpm。当od600为0.6～0.8时，加入iptg(终浓度0.2mm),16℃诱导22h后，停止培养，离心(8000g,3min,4℃)收集菌体，弃上清。菌体超声破碎，破碎液高速离心(12000g，30min，4℃)，得到的上清液用avant25蛋白纯化仪纯化目的蛋白。首先用平衡缓冲液50mmtris-hcl(ph7.5)对ni2+亲和层析柱进行平衡(10cv)后上样，上样完毕后,再用平衡缓冲液50mmtris-hcl(ph7.5)对ni2+亲和层析柱进行平衡(5cv)；用洗涤缓冲液(50mmtris-hcl(ph7.5)，25mmnacl,60mm咪唑洗掉层析柱上吸附力较小的杂蛋白；最后用洗脱缓冲液(50mmtris-hcl(ph7.5),25mmnacl,500mm咪唑)洗脱目的蛋白并收集，洗脱液体用超滤管进行浓缩和脱盐。进行定点突变rhad重组表达质粒所涉及的引物序列如下：突变体p188f上游引物：5'-tttgccgtggatggtgttcggcacggacgaaatc-3'(下划线序列为突变位点)，突变体p188f下游引物：3'-aaacggcacctaccacaagccgtgcctgctttag-5'(下划线序列为突变位点)。突变体p188t上游引物：5'-ccgtggatggtgaccggcacggacg-3'(下划线序列为突变位点)，突变体p188t下游引物：3'-ggcacctaccactggccgtgcctgc-5'(下划线序列为突变位点)。突变体p188c上游引物：5'-gccgtggatggtgtgcggcacggacgaa-3'(下划线序列为突变位点)，突变体p188c下游引物：3'-cggcacctaccacacgccgtgcctgctt-5'(下划线序列为突变位点)。突变体n29k上游引物：5'-ggctgggatgagcgcaagggcggcaac-3'(下划线序列为突变位点)，突变体n29k下游引物：3'-ccgaccctactcgcgttcccgccgttg-5'(下划线序列为突变位点)。突变体y152a上游引物：5'-aacctgatcgccctcaccgctgtacttgaaaacgacacc-3'(下划线序列为突变位点)，突变体y152a下游引物：3'-ttggactagcgggagtggcgacatgaacttttgctgtgg-5'(下划线序列为突变位点)。突变体n29i上游引物：5'-gctgggatgagcgcatcggcggca-3'(下划线序列为突变位点)，突变体n29i下游引物：3'-cgaccctactcgcgtagccgccgt-5'(下划线序列为突变位点)。实施例2：rhad醛缩酶野生型以及突变体酶活检测：为了测定酶活，50μl总体积反应体系如下：dhap(0.2m，5μl，0.02m)；d-甘油醛(0.5m，2μl，0.02m)，醛缩酶rhad野生型或者突变体(10mg/ml，2.5μl，0.5mg/ml)补加50mmtris-hcl(ph8.0)至体积50μl。30℃静置反应过夜，用3mhcl调节ph为5后，加入0.25μl酸性磷酸酶ap，30℃静置反应过夜。反应结束使用3mnaoh调节ph为7用于终止反应，然后15000g离心10min收集上清。hplc检测，如图1及图2所示。本发明色谱条件为：日立示差检测器(hitachiri)，色谱柱bio-radaminexhpx-87h，流动相为5mmol/l的稀硫酸水溶液，流速为0.5ml/min，进样量为20μl。采用相同条件进行d-阿洛酮糖和d-山梨糖的标准曲线的绘制。从图1可知，在相同hplc检测体系下，测定两种糖的标准品(即完整的标准曲线以糖的浓度作为横坐标，以峰面积作为纵坐标)。hplc图谱结果分析表明，野生型rhad-wt催化d-甘油醛，反应终止最终生成的产物稀有糖d-阿洛酮糖(出峰时间12.5左右)与d-山梨糖(出峰时间11.23左右)，产出两种稀有单糖比率保持1：1左右。同时，研究发现hplc图谱结果rhad突变体y152a、n29k、p188c、p188t、p188f均表现出d-阿洛酮糖得率显著高于d-山梨糖的结果，即上述经过上述五个位点突变的rhad均表现出优异的对于催化生成d-阿洛酮糖的立体选择性，d-山梨糖的得率很少，经过突变的rhad的酶活高；而rhad突变体n29i及t266a也表现出rhad催化生成d-阿洛酮糖的立体选择性，但仍有一部分d-山梨糖产生。其中，突变体p188f反应液hplc图谱分析，其只出现了一个产物峰，对比标准样品可知这个产物即为d-阿洛酮糖，即突变体p188f表现出rhad催化完全生成d-阿洛酮糖的立体选择性，而不生成d-山梨糖，且经过突变的rhad的酶活较高。然而，从图2可以看出，rhad突变体t170a及f211c的rhad均没有酶活，即t170a或f211c的突变会造成rhad酶活丧失；而rhad突变体f263a、f263a可以产生少量的d-山梨糖，其酶活很低，且蛋白不稳定。说明t170a、f211c或f263a位点的突变对于rhad催化生成d-阿洛酮糖的立体选择性均不可实现。发明人也研究了两个位点的组合突变对于rhad催化生成d-阿洛酮糖的立体选择性的影响，从图2可以看出，n29a-y152a的组合位点突变在产生d-阿洛酮糖的同时仍有相对应的d-山梨糖产生，因此n29a-y152a的组合位点突变对于rhad催化生成d-阿洛酮糖的立体选择性差于单一位点突变。实施例3：rhad醛缩酶的立体选择性分析：本研究发现，大肠杆菌mg1655来源的磷酸二羟基丙酮(dhap)依赖型醛缩酶家族的l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(rhad)催化的反应底物为两个：第一个为磷酸二羟基丙酮(dhap)，第二个为醛类。在以d-甘油醛为醛受体时，失去了对该醛受体的立体选择性，生成d-阿洛酮糖和d-山梨糖两种稀有糖，两者比例接近与1：1。而当mg1655rhad的定点突变株n29i，n29k，p188c，p188t，t266a，y152a以dhap和d-甘油醛为底物时，主要生成d-阿洛酮糖，而大肠杆菌mg1655菌株的rhad定点突变株p188f能完全合成d-阿洛酮糖，具体实验结果见表1。本研究对rhad可能的多个氨基酸残基位点包括第29、188、266、152、170、211、263位氨基酸位点作定点饱和突变，筛选得到突变体n29i、n29k、p188c、p188t、p188f、y152a的hplc酶活分析均表现为倾向合成d-阿洛酮糖。从研究总结的表1分析，突变体p188f只出现一个产物，即d-阿洛酮糖，而不产生d-山梨糖。从表1可知，对l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(rhad)基因编码氨基酸作第29，188，266，152位氨基酸进行饱和定点突变，突变株重组质粒pet28a-rhadn29i、pet28a-rhadn29k、pet28a-rhadp188c、pet28a-rhadp188f、pet28a-rhadp188t、pet28a-rhadt266a、pet28a-rhady152a编码翻译的蛋白反应催化底物醛，合成d-阿洛酮糖：d-山梨糖的比率相较野生型(1：1)分别为6：1、14：1、55：1、1：0、60：1、3.5：1、8：1。针对同一突变位点，将该位点突变为不同氨基酸，催化效率有很大区别，例如突变体p188f的催化效率为100％(d-阿洛酮糖:d-山梨糖＝1:0)，而突变体p188c催化产生的d-阿洛酮糖:d-山梨糖＝55:1；而发明人的另一项研究表明，突变体y152w则以催化合成d-山梨糖为主，突变体y152w催化合成的d-阿洛酮糖:d-山梨糖＝1：11。表1rhad不同突变位点催化合成d-阿洛酮糖与d-山梨糖产量比类型d-阿洛酮糖:d-山梨糖wt1：1rhady152a8：1rhadn29i6：1rhadn29k14：1rhadp188c55：1rhadp188t60：1rhadp188f1:0rhadt266a3.5:1本发明通过对rhad的氨基酸位点进行定点突变，克服了野生型rhad产生d-阿洛酮糖:d-山梨糖＝1：1，即没有立体选择性的缺陷，实现了rhad催化d-甘油醛为醛受体合成d-阿洛酮糖时的立体选择性，使得催化反应仅产生d-阿洛酮糖或以d-阿洛酮糖为主，经过突变的rhad的酶活高。本发明方法制备的定点突变的rhad制备d-阿洛酮糖，合成效率高、工艺简单、节约成本、d-阿洛酮糖立体选择性催化效率最高达到100％(即产物d-阿洛酮糖:d-山梨糖＝1：0)，利用本发明方法实现了工业化rhad催化d-甘油醛大量合成d-阿洛酮糖。应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12