本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种提高鳞翅目昆虫rnai效率的基因及其应用。
背景技术：
1998年fire等人证实双链rna(dsrna)能够引起特异基因的沉默，并将这种现象命名为rna干扰(rnainterference，简称rnai)。2002年bucher等人首次将该技术应用于昆虫基因功能研究，结果发现昆虫特定靶标基因的沉默会导致下一代胚胎畸形、死亡或发育异常。
十多年来的研究结果表明，rna干扰(rnai)技术能够应用于害虫防治，而且针对于鞘翅目害虫的转基因抗虫作物或杀虫剂产品即将上市。但是对于主要的农业害虫鳞翅目昆虫来说，rnai效果不太理想。2011年terenius等人针对150多例在鳞翅目昆虫中进行的rnai实验进行了总结，其中不仅有已经发表的结果，还有一些是因rnai效果不理想而未发表的结果。统计分析发现：相比于注射的方法，通过饲喂dsrna来抑制基因表达需要更高的剂量；而且，就整个鳞翅目昆虫来说，除了个别情形，绝大多数种类昆虫的rnai效率均比较低。而造成鳞翅目昆虫rnai效率较低的可能原因有多方面。
不同物种间rnai机理的差异可能是导致其效率差异的主要原因之一。分析鳞翅目昆虫rnai效率较低的原因发现，在鳞翅目昆虫中没有线虫或植物中普遍存在的依赖于dna的rna聚合酶(rdrp)，说明鳞翅目昆虫不能通过产生次级sirna，进而产生系统rnai效应，也就不能产生持续的rnai效应。
鳞翅目昆虫中肠对dsrna的降解程度，很可能是导致其rnai效率较低的另一个主要原因。进入体内的dsrna除了被dicer剪切成sirna，随后组装成risc复合物行rnai功能外，大部分的dsrna会被血淋巴或者中肠中存在的核酸酶降解成没有功能dsrna，使其不能进入rnai途径并沉默靶标基因。这类核酸酶的存在被认为是影响rnai效率的关键。对鞘翅目昆虫马铃薯甲虫、玉米根萤叶甲以及鳞翅目昆虫棉铃虫、草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)的食物中添加不同长度的dsrna，饲喂24小时后，northernblot检测全虫以及中肠dsrna的含量，结果表明，鞘翅目昆虫中dsrna富集比较明显，而鳞翅目昆虫中检测到的dsrna含量较少。对以往的rnai研究结果的统计表明，鞘翅目昆虫对dsrna比较敏感，比较容易产生rnai效应，而鳞翅目昆虫中的多数基因很难被抑制。因此，与鞘翅目昆虫相比，被鳞翅目昆虫取食的dsrna极有可能迅速被体内存在的核酸酶降解，dsrna不能有效富集，也就不能行使随后的rnai功能。这很可能是两类昆虫rnai效率差异巨大的另一主要原因。
因此，本领域还需要找到适当的方法，来改善和避免鳞翅目昆虫中存在的rnai效率不高的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提高鳞翅目昆虫rnai效率的基因及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：
(a)具有seqidno:2氨基酸序列的多肽；
(b)将seqidno:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-15个，更佳地1-10个，更佳地1-5个或1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制鳞翅目昆虫rna干扰效率的功能的由(a)衍生的多肽；
(c)与(a)限定的序列在具有70％以上(较佳地80％以上，更佳地90％以上，更佳地95％以上，更佳地98％以上，如99％或更高)的序列相同性的，且具有抑制鳞翅目昆虫rna干扰效率的功能的由(a)衍生的多肽。
在一个优选例中，所述的(b)和(c)的多肽来源于鳞翅目昆虫。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸的核苷酸序列选自下组：(a)编码所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
在一个优选例中，该多核苷酸编码具有seqidno:2所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
在一个优选例中，所述的宿主细胞是非繁殖性的细胞，其不能生长为植物或动物。
在本发明的另一方面，提供一种制备所述的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种提高鳞翅目昆虫的rna干扰(rnai)效率的方法，所述方法包括：在对鳞翅目昆虫进行rna干扰处理时，在鳞翅目昆虫中下调所述的多肽或其同源多肽的表达。
在本发明的另一方面，提供一种制备rna干扰(rnai)效率高的鳞翅目昆虫的方法，所述方法包括：鳞翅目昆虫中下调所述的多肽或其同源多肽的表达。
在一个优选例中，所述的对鳞翅目昆虫进行rna干扰处理包括：dsrna处理；较佳地，所述的对鳞翅目昆虫进行rna干扰处理包括：针对鳞翅目昆虫中所需下调表达的靶基因的序列，确定dsrna，将该dsrna给予鳞翅目昆虫。
在另一优选例中，下调所述的多肽的表达包括：利用rna干扰方法下调所述的多肽或其同源多肽的表达。
在另一优选例中，所述的rna干扰方法包括：针对所述的多肽或其同源多肽的基因序列，确定dsrna，将该dsrna给予鳞翅目昆虫。
在另一优选例中，所述的dsrna是靶向seqidno:1的1311-1810位相应区段核酸序列的核酸。
在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于作为提高鳞翅目昆虫的rna干扰效率的作用靶点。
在本发明的另一方面，提供一种下调所述的多肽的表达的下调剂的用途，用于提高鳞翅目昆虫的rna干扰效率。
在一个优选例中，提供所述的下调剂是rna干扰分子。
在另一优选例中，所述的rna干扰分子是dsrna，所述的dsrna是靶向seqidno:1的1311-1810位相应区段核酸序列的核酸。
在另一优选例中，所述的鳞翅目昆虫选自：包括：小翅蛾亚目、蝙蝠蛾亚目、毛顶蛾亚目、单孔亚目、双孔亚目的昆虫；更佳地，选自：螟蛾科秆野螟属的亚洲玉米螟，夜蛾科棉铃虫，麦蛾科棉红铃虫，螟蛾科脐橙螟，菜蛾科小菜蛾或凤蝶科玉带凤蝶。
在本发明的另一方面，提供一种用于提高鳞翅目昆虫的rna干扰效率的干扰分子，所述的rna干扰分子是dsrna，所述的dsrna是靶向seqidno:1的1311-1810位相应区段核酸序列的核酸。
在本发明的另一方面，提供一种用于提高鳞翅目昆虫的rna干扰效率的组合物(如农药)，所述的组合物含有所述的干扰分子，以及农药学上可接受的载体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、rease蛋白结构预测。
a：i-tasser预测蛋白模型与3qe9y进行比对分析，其中紫色骨架代表预测蛋白模型，彩色卡通代表3qe9y三维结构；
b：i-tasser预测得到的蛋白质配体结合位点，其中绿色环状代表核酸结构。
图2、rease只在鳞翅目昆虫中特异表达。
a：rease基因系统进化树分析；
b，c：rease同源基因能够被dsrna诱导表达，而proteinasteroid不能被dsrna诱导表达。
图3、rease基因受dsrna特异诱导表达。
a：dsrna与lps处理后2h，4h检测rease基因被诱导表达的情况；
b：不同类型核酸片段处理后2h，4h检测rease基因被诱导表达的情况。
图4、rease能够影响rnai效率。
a：抑制rease基因的表达，能够提高dskti抑制效率；
b：抑制rease的表达，能够增加由ctp8基因被抑制造成的幼虫死亡率。
图5、rease影响dsrna剪切成smallrna的种类和个数。
a：不同dsrna处理组对rease基因表达的影响；
b：四组数据统计能够与egfp序列互补的小rna的个数；
c：四组数据统计能够与egfp序列互补的小rna的种类。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，发现了一种与鳞翅目昆虫的rnai效率密切相关的基因。该基因在鳞翅目昆虫中对dsrna响应非常剧烈，能够通过影响dsrna被剪切成小rna的种类和个数，进而影响rna效率。本发明人将该基因命名为rnaiefficiencyassociatedenzyme，简称rease。
如本文所用，“分离的rease”是指rease多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化rease。
如本文所用，所述的“鳞翅目昆虫”是指任何基因组中包括有rease或其同源序列的鳞翅目昆虫。所述的“鳞翅目昆虫”包括：小翅蛾亚目、蝙蝠蛾亚目、毛顶蛾亚目、单孔亚目、双孔亚目的昆虫。更具体地，但不限于：来自螟蛾科秆野螟属的亚洲玉米螟，棉铃虫，棉红铃虫，脐橙螟，小菜蛾，玉带凤蝶；见图2a。
如本文所用，术语“rna干扰(rnainterference，rnai)”是指一些rna可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mrna降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为rna干预或者干涉。rna干扰是高度特异的在mrna水平上的基因沉默机制。
如本文所用，术语“干扰rna”或“dsrna”是指一种rna分子，能够以同源互补序列的mrna为靶目标降解特定的mrna，这个过程就是rna干扰途径(rnainterferencepathway)。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
本发明还包括人rease的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持seqidno:2所示氨基酸序列的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“rease”指具有rease活性的seqidno:2序列的多肽。该术语还包括具有与rease相同功能的、seqidno:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括rease的活性片段和活性衍生物。
本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与seqidno:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有seqidno:2的蛋白质，但与seqidno:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码seqidno:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
应理解，虽然本发明的rease优选获自鳞翅目的亚洲玉米螟，但是获自其它昆虫的与rease高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因、特别是来自鳞翅目昆虫的其它基因，也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如blast。
对rease基因结构预测，发现该基因属于pin_sf家族，本发明人对该基因进行功能研究，对rease进行系统进化树分析，发现在已有基因信息的基础上，只在鳞翅目昆虫中找到rease基因的同源基因，这很有可能是导致鳞翅目昆虫rnai效率有别于其它种类昆虫的一个重要原因。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc,0.1％sds,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与seqidno:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
本发明中，rease多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
包含适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。
基于本发明人的新发现，本发明提供了rease的用途，用于作为提高鳞翅目昆虫的rnai效率的作用靶点。通过下调rease的表达，来提高鳞翅目昆虫的rnai效率，或制备rnai效率提高的鳞翅目昆虫。
本发明还涉及rease或其编码基因的下调剂及其用途。由于下调剂可下调rease的表达和/或活性，因此，所述的下调剂可通过对rease的影响来调节昆虫的rnai效率。
任何可降低rease的活性、降低rease的稳定性、抑制rease的表达、减少rease有效作用时间、或降低rease基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于下调rease、进而提高鳞翅目昆虫的rnai效率的有用的物质。
本发明还提供一种制备rna干扰(rnai)效率高的鳞翅目昆虫的方法，所述方法包括：在鳞翅目昆虫中下调rease的表达。
在得知了所述的rease的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低rease在鳞翅目昆虫中的表达或使之缺失表达。较佳地，采用核酸抑制物来处理。较佳地，采用在对鳞翅目昆虫进行rna干扰处理，从而降低rease的表达。
多种rna干扰处理的方法可以应用到本发明中。例如，采用dsrna干扰的方法下调rease：双链rna(double-strandedrna，dsrna)是一种有互补链的rna，与细胞中发现的dna相似，能够促发细胞中的rna干扰，引起干扰反应。dsrna一般指一定长度的双链rna(如大于30碱基对的双链rna分子)。
又例如，采用shrna干扰的方法下调rease：shrna是一段具有紧密发卡环(tighthairpinturn)的rna序列；利用载体把shrna导入细胞；shrna的发卡结构可被细胞机制切割成sirna，然后sirna结合到rna诱导沉默复合物上(rna-inducedsilencingcomplex，risc)，该复合物能够结合到目的mrnas并将其降解。
又例如，采用sirna干扰的方法下调rease：sirna是一类20-25个核苷酸长度的双链rna分子，其主要在rnai通路中起作用，干扰特异基因的表达。其结构是一段完全互补的rna双链，两端各有两个未互补的的碱基。
作为本发明的优选方式，采用dsrna干扰的方法下调rease。所述的rna干扰方法包括：针对rease的基因序列，确定合适的dsrna序列，将该dsrna给予鳞翅目昆虫。
作为本发明的更优选的方式，所述的dsrna是靶向seqidno:1的1311-1810位相应区段核酸序列的核酸。该dsrna可以非常有效地在鳞翅目昆虫体内发挥下调/沉默rease的表达的作用，这在本发明的实施例中有详细的体现。
本发明还提供了一种提高鳞翅目昆虫的rna干扰(rnai)效率的方法，所述方法包括：在对鳞翅目昆虫进行rna干扰处理时，在鳞翅目昆虫中下调rease的表达。其中，所述的“对鳞翅目昆虫进行rna干扰处理”，是指应用针对目的昆虫基因的核酸抑制物或针对目的昆虫基因的rna干扰试剂(较佳地dsrna)处理昆虫，抑制该目的昆虫基因的表达。所述的目的昆虫基因可以是感兴趣的来自昆虫的基因。
尽管在本发明的实施例中，列举的感兴趣的基因为egfp、kti、ctp8，验证了这些基因在下调rease后的rnai效率变化，但是本领域技术人员可以理解，在该列举的基础上，可以预期到其它的感兴趣的目的昆虫基因的rnai效率也将发生类似的变化。
本发明还提供了一种制剂(如农药组合物)，其含有本发明的用于下调rease的干扰分子如dsrna；以及农药学上可接受的载体。“农药学上可接受的载体”是用于将本发明的携带所述构建物或表达载体并能够表达出核酸抑制物的宿主或本发明的核酸抑制物传送给鳞翅目昆虫的可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。农药学上可接受的载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持宿主或核酸抑制物活性的载体。
所述制剂(或农药组合物)的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：水溶液，悬浮剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物，乳液，可喷洒溶液，水性分散系，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。应理解，只要能够将本发明的携带所述构建物或表达载体并能够表达出核酸抑制物的宿主或本发明的核酸抑制物在保持全部或部分活性的前提下递送到鳞翅目昆虫的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，例如，所述农药组合物是注射剂、液体喷洒剂、或喷雾剂。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
昆虫饲喂
亚洲玉米螟(ostriniafurnacalis)饲养：人工气候箱光周期14h:10h，温度25±1℃，相对湿度为75％。玉米螟幼虫饲料为新七号饲料，配方如下：大豆粉(120.0g)、玉米糁(120.0g)、玉米粉(32.0g)、啤酒酵母(72.0g)、葡萄糖(60.0g)、vc(4.0g)、琼脂(12.0g)、山梨酸(4.0g)、甲醛(1.6ml)、水(1000ml)。每个培养瓶中放入60-70g饲料，接入100头初孵幼虫，直至生长到5龄末期，老熟亚洲玉米螟幼虫移入塑料盒中，放置多层草纸，供其化蛹及羽化，保持盒内环境干燥而空气相对湿度较大(80％-90％)。成虫羽化后应及时移入产卵笼中，用10％的蜂蜜水喂养，待其交尾产卵。进行生物测定时，根据头壳宽度划分幼虫的龄期，挑选生长一致的玉米螟进行处理及取样保存。
rna提取及质量检测
总rna的提取使用
1)在1mltrizol中加入研磨充分的玉米螟样品50-100mg，混匀，室温静置5min。
2)加入200μl氯仿，震荡混匀，室温静置3min。
3)12000rpm(4℃)离心15min，转移上层水相到另一新的离心管中，加入500μl预冷的异丙醇，震荡混匀，室温静置10min。
4)12000rpm(4℃)离心15min，小心吸取上清。
5)用500μl预冷的75％乙醇洗涤，涡旋仪轻混10sec。
6)12000rpm(4℃)离心2min，小心吸取上清后室温干燥5min，加入适量depc灭菌水溶解，即得到总rna样品。分光光度计下检测吸光度，1％琼脂凝胶电泳检测总rna质量，-80℃保存待用。
dsrna合成
使用试剂盒
合成dsrnas的引物见表1。在合成过程中，templatedna以及single-strandedrna分别用dnase和rnase来进行去除。
表1、合成dsrna以及rt-pcr检测所用引物
合成的dsrna包括：
dsrease：靶向rease序列(seqidno:1)中第1311-1810位；
dsegfp：靶向egfp序列(seqidno:3)中第307-671位；
dskti：靶向kti序列(seqidno:4)中第163-639位；
dsctp8：靶向ctp8序列(seqidno:5)中第343-887位。
基因表达量(q-pcr)实验验证
使用
对每个基因样品进行3次重复检测，其表达水平分析选用18srrna的表达量进行均一化处理。
数据分析参照2-δδctmethod(livak&schmittgen，2001)。通过计算均值与标准误得到相应数值。
为了消除个体差异，每个实验组的样品为2头处理后存活幼虫形成的样品池，每个实验组进行三次生物学重复。
系统进化树分析
ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找并下载基因序列，本发明所选基因的序列信息见表2。利用mafft软件进行多重序列比对，mega5进行系统发育树的构建，算法采用邻近结合法(neighbor-joining，nj)，步长值为1000。
表2、系统进化树分析基因序列
蛋白结构预测
通过swiss-model，i-tasser进行蛋白结构预测，对结果以及预测得到的蛋白三维结构模型进行分析。
生物测定
挑选生长一致的五龄幼虫，对每头幼虫进行注射处理，处理后一定时间取样，液氮速冻，-80℃保存。其中每组处理进行3次生物学重复，每个重复包含2头幼虫。
小rna文库构建、测序及数据分析
1)亚洲玉米螟totalrna样品准备
总rna需经dna酶处理，酚氯仿纯化，并且od260/280为1.8～2.2，同时达到agilent2100bioanalyzer检测要求。
2)分离smallrna
使用page胶分离不同片段大小的rna，切取18-30nt之间的条带，回收smallrna。
3)接头连接
配制连接反应体系，混匀离心，适温连接一段时间。
4)第一链合成及扩增
配制反转录体系，在pcr仪上适温反应一定时间，使连接产物反转录成双链，再配制pcr反应体系，在pcr仪上按照一定程序进行扩增。
5)pcr产物回收纯化
使用page胶对pcr产物进行切胶回收纯化，回收产物溶于ebsolution。
6)文库质量检测
构建好的文库使用agilent2100bioanalyze和abisteponeplusreal-timepcrsystem进行质量和产量的检测。
7)对测序结果进行分析
统计一定长度与目标序列配对的小rna的种类和个数。
实施例1、rease基因序列扩增及蛋白三维结构预测
通过转录组数据信息以及race技术，扩增得到rease基因全长序列。rease来自于亚洲玉米螟，由1866个核苷酸组成，起始密码子为atg，终止密码子为taa，能够编码621个氨基酸。rease基因的核苷酸序列见seqidno:1；其氨基酸序列信息见seqidno:2。
分析该蛋白的结构，结果发现，5’端具有pin_fen1_exo1-likedomain，属于pin_sfsuperfamily蛋白家族。将蛋白进行三维结构预测，结果显示，rease蛋白前340个氨基酸具有humanexonuclease1exo1相似的二级结构，如图1a。随后，本发明人将前340个氨基酸在i-tasserservice数据库进行三维结构预测，得分最高的threadingtemplates为3qe9y，humanexonuclease1exo1。
将预测得到的蛋白模型与3qe9y进行比对，发现结构具有高度的吻合(图1a)，对配体结合位点进行预测。结果显示，第2，30，34，76，83，90，111，138，156以及169位氨基酸位点能够结合核酸序列，如图1b。
通过对氨基酸序列以及蛋白质三维结构预测均显示，该蛋白属于pin_sf家族，并且与exo1具有较高的结构相似度。
实施例2、rease同源基因特异存在于鳞翅目昆虫中
根据ncbiblast进行序列比对分析，得到与rease基因相近的6个目昆虫中的38条序列，同时，在亚洲玉米螟以及棉铃虫转录组数据库中找到两条相近的基因序列。通过mega5对包括rease在内的41条基因序列进行系统进化树分析发现：棉铃虫，棉红铃虫，脐橙螟，小菜蛾以及玉带凤蝶中注释为uncharacterizedprotein的基因与玉米螟rease基因聚为一支，其余注释为proteinasteroid的35条基因聚为另一支。同时，本发明人也发现，与rease聚为一支的基因只存在于鳞翅目昆虫中，在其它目的昆虫中均未找到类似的基因序列，如图2a。对棉铃虫，玉米螟，赤拟谷盗幼虫分别进行dsegfp处理后发现，棉铃虫中与rease同源的基因能够被dsrna诱导上调，如图2b；而棉铃虫，玉米螟，赤拟谷盗中注释为proteinasteroid的基因则不能被dsrna诱导表达，如图2c。
上述结果说明，与rease聚为一支的注释为uncharacterizedprotein的基因以及与rease序列比较相近的注释为proteinasteroid的基因是两种不同类型基因，行使不同功能。
实施例3、rease基因被dsrna特异诱导表达
对亚洲玉米螟五龄幼虫注射2μldsegfp(浓度为2μg/μl)以及2μllps(浓度为1μg/μl)，处理后2h，4h后分别取样检测rease被诱导表达情况。
结果表明，rease只能够被dsegfp诱导表达，而lps刺激不能引起rease基因的改变，如图3a。这说明rease不参与lps引起的机体免疫应激通路。
随后，对玉米螟五龄幼虫分别注射2μl，浓度为2μg/μl的双链rna(dsrna)(dsegfp)，双链dna(dsdna)(egfp，seqidno:3)，21bp长度的双链rna(sirna)(ggacgacggcaacuacaagac；seqidno:20)，21bp长度的双链dna(sidna)(ggacgacggcaactacaagac；seqidno:21)，并在处理后2h，4h取样检测rease基因的变化情况。
结果表明，只有dsrna能够诱导rease的高表达，其它不同类型、不同长度的核酸均不能引起rease基因的变化，如图3b。rease基因仅受dsrna的特异诱导表达，可能与rnai通路密切相关。
实施例4、rease基因能影响rnai效率
本发明人选取玉米螟内源基因kti(kunitztrypsininhibitor)为研究对象，合成dskti(通过表1中dskti正向引物以及反向引物合成dna并体外转录成的dsrna序列)，注射玉米螟五龄幼虫，发现kti基因能够被抑制。
随后本发明人将dskti与dsrease(通过表1中dsrease正向引物以及反向引物合成dna并体外转录成的dsrna序列)混合注射玉米螟五龄幼虫。结果表明，dskti与dsrease混合后，对kti基因的抑制效率显著高于同等剂量dskti，如图4a。
ctp8(chymotrypsin-likeprotease8)属于糜蛋白酶基因家族成员，注射dsctp8能够导致玉米螟幼虫的死亡。当dsctp8(通过表1中dsctp8正向引物以及反向引物合成dna并体外转录成的dsrna序列)与dsrease共同注射时，在抑制ctp8基因的同时，抑制rease基因的表达，对玉米螟造成的死亡率显著提高，如图4b。
上述结果说明，抑制rease基因的表达能够提高其它基因的rnai效率，同时提高rnai对昆虫的致死效率。
实施例5、rease通过影响机体剪切dsrna产生的smallrna的种类和个数来影响rnai效率
对玉米螟幼虫进行dsegfp(注射体积为3μl，剂量为5μg/头)、dsegfp+dsrease(注射体积为3μl，注射剂量为(5μgdsegfp+10μgdsrease)/头)、dsrease(注射体积为3μl，注射剂量为10μg/头)处理，未受任何处理的玉米螟幼虫为ck。处理后4h取样，提取总rna，进行小rna测序。对测序得到的18-30nt长度的smallrna进行分析，统计每个样本中包含的与注入进去的dsegfp序列互补的smallrna的个数以及丰度(允许1个碱基的差异)。
结果表明，未做任何处理的ck组与dsrease处理组，只检测到很少的能够与dsegfp序列互补的片段，其中ck组检测到236种不同的smallrna，这些smallrna测得的丰度总和为452次，dsrease组检测得到806种，共3724次的smallrna，如图5b，c。虽然dsegfp对于玉米螟来说是外源的dsrna，但是在小rna测序时，作为对照组的ck与dsrease还是能够检测到少量能够与dsegfp配对的smallrna，这些检测到的片段可能是本底或者是误差导致的。
对dsegfp处理组与在注入同等剂量dsegfp的同时，注入dsrease抑制rease基因表达的dsegfp+dsrease处理组(图5a)的测序结果分析表明，抑制rease基因后，检测得到的与dsegfp序列互补的smallrna，不论在种类上还是个数上都明显高于未抑制rease的处理组(图5b，c)，其中dsegfp处理组统计得到的能够与dsegfp序列互补的smallrna的种类和个数分别为：5019、90244，dsegfp+dsrease处理组统计得到的数据分别为：12710、747058。
上述结果说明，被dsrna诱导大量表达的rease能够抑制dsrna剪切成smallrna，也就抑制了能够与靶标mrna配对并使之沉默的有效sirna的产生，进而对rnai效率产生影响。
结论
综上，本发明人发现了一种特异存在于鳞翅目昆虫的rease基因，该基因只能被dsrna诱导表达，并且能够通过影响dsrna剪切成的smallrna的种类和个数，进而影响rnai效率。通过对该基因序列进行分析，发现该基因属于pin_sf核酸酶家族，蛋白质三维结构预测显示该基因编码的蛋白与humanexonuclease1具有相似的蛋白质三维结构以及核酸结合位点，可能行使类似剪切核酸的功能。
本发明的结果解释了鳞翅目昆虫rnai效率有别于其它种类昆虫的原因。同时，该基因的发现，可以改善鳞翅目昆虫rnai效率偏低的现状，从而促进该项技术的应用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>一种提高鳞翅目昆虫rnai效率的基因及其应用
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