一种玉米赤霉烯酮降解酶及其基因和制备方法及应用以及降解玉米赤霉烯酮的方法与流程

文档序号：14890637发布日期：2018-07-07 17:36阅读：169来源：国知局

本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶，编码该玉米赤霉烯酮降解酶的基因，含有该基因的重组载体和菌株，一种添加剂，含有该添加剂的粮油或饲料，表达该玉米赤霉烯酮降解酶的方法，和上述玉米赤霉烯酮降解酶、基因、重组载体、菌株和添加剂在降解玉米赤霉烯酮中的应用，以及降解玉米赤霉烯酮的方法。

背景技术：

玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)是由镰刀菌产生并释放到土壤环境中的真菌毒素，它是世界上污染范围最广泛的一种镰刀菌毒素。1999年，d.mello等人研究发现，zen能够降低怀孕动物的胚胎成活率及新生胎儿的出生率。zen对人体的影响主要是引发肿瘤、诱导dna收缩、导致染色体失常等。此外，zen可与17β-雌二醇受体结合，导致脂肪氧化反应、细胞凋亡并导致蛋白质和dna合成的抑制，还可以抑制其它大分子的生物合成。

玉米赤霉烯酮作为世界上污染粮油或饲料最广泛的真菌毒素之一，在欧洲、非洲、北美洲、南美洲等世界各地的谷物中以及农副产品中都检测到了zen的存在。zen可以通过污染谷类等农作物，进而进入人或动物体内，危害人和动物的健康，造成巨大的经济损失。同时，zen本身具有分布广、繁殖快、耐热、毒性大、残留时间长等问题，已经引起了全世界的关注。目前，大部分国家对粮油或饲料中的zen含量都作了十分严格的规定，例如，澳大利亚规定谷物中zen的含量不能超过50ng/g；意大利规定在谷物和谷类产品当中zen的含量不能超过100ng/g；在法国，植物油和谷类当中zen的含量必须低于200ng/g。

目前，去除zen毒素的方法主要分为物理法、化学法和生物法。物理法包括机械分离处理、高温失活、放射处理或吸附剂等；化学法是通过酸碱溶液或其它化合物对毒素进行处理。然而，通过物理和化学处理以去除zen的方法具有局限性。例如，通过热处理，不能有效地使zen钝化；通过挤出和使用氧化剂进行处理，虽然可以在一定程度上降低zen的含量，但是在饲料和食品的制备过程中采用挤出方法和使用氧化剂(如臭氧或过氧化氢)，由于成本较高、处理样品的品质损失、效率和特异性较低而受到限制。总之，由于物理法存在着成本高、操作难、处理后的产物可能对粮油、饲料或环境造成污染等缺点，化学法可能会改变饲料的性状，产生有害残留物，从而存在食品安全问题等缺陷，从而限制了这两种方法在实际生产中的应用。

生物法主要是利用微生物或其降解产物进行毒素降解的过程，具有对原料的感官性状、适口性、营养物质影响较小等优点，同时，还具有安全、环保、高效的特点，因此，利用现代生物技术去除粮油或/饲料中zen的研究具有良好的应用前景。在现有技术中，cn103937681a公开了一株食品级黑曲霉及其在玉米赤霉烯酮降解中的应用，将该黑曲霉在适宜的条件(28℃，菌液接种量2％)与终浓度为2ppm的zen共培养48h，zen的降解率为89.56％。cn103981134a公开了一株铜绿假单胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用，将该铜绿假单胞菌在适宜的条件(28℃)下与终浓度为2ppm的zen共培养72h，zen的降解率为92.75％。cn103981133a公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用，将该株解淀粉芽孢杆菌在适宜的条件(28℃)下与终浓度为5ppm的zen共培养24h，zen的降解率为95.99％。可见，现有的微生物降解zen的方法降解时间均较长，且降解率尚有待提高。

另外，现有的降解zen的生物法大多是在温和的条件(如28℃，ph为7左右)下进行，然而，在较高的温度负荷下(如在容器中进行运输期间或在饲料粒化期间的情况下)或苛刻的酸碱性条件下尚无较好的解决办法，这就限制了生物法在降解zen中的应用范围。

因此，有必要寻找一种高效的且安全性高的，并且在较高的温度负荷或苛刻的酸碱条件下可以使用的生物降解zen毒素的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述缺陷，提供了一种玉米赤霉烯酮降解酶，编码该玉米赤霉烯酮降解酶的基因，含有该基因的重组载体和菌株，一种添加剂，表达该玉米赤霉烯酮降解酶的方法，和上述玉米赤霉烯酮降解酶、基因、重组载体、菌株和添加剂在降解玉米赤霉烯酮中的应用，以及降解玉米赤霉烯酮的方法。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种玉米赤霉烯酮降解酶，其中，该玉米赤霉烯酮降解酶具有如下(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：

(a)seqidno：2所示的氨基酸序列；

(b)seqidno：2所示的氨基酸序列中第1-262和264位氨基酸残基中的一个或几个经过取代、缺失或添加后仍具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的氨基酸序列。

第二方面，本发明还提供了一种编码玉米赤霉烯酮降解酶的基因，其中，该基因具有编码上述玉米赤霉烯酮降解酶的核苷酸序列。

第三方面，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有上述基因。

第四方面，本发明还提供了一种菌株，其中，该菌株含有上述基因或者上述重组载体。

第五方面，本发明还提供了一种添加剂，其中，该添加剂含有上述玉米赤霉烯酮降解酶，和/或含有上述菌株的发酵产物。

第六方面，本发明还提供了一种粮油或饲料，其中，该粮油或饲料含有上述玉米赤霉烯酮或上述添加剂。

第七方面，本发明还提供了一种表达玉米赤霉烯酮降解酶的方法，其中，该方法包括：将上述重组载体导入宿主，诱导编码玉米赤霉烯酮降解酶的基因在所述宿主中表达；或者，诱导上述菌株表达玉米赤霉烯酮降解酶。

第八方面，本发明还提供了上述玉米赤霉烯酮降解酶、基因、重组载体、菌株或者添加剂在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

第九方面，本发明还提供了一种降解玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括：在酶降解反应的条件下，将酶剂与待处理的样品接触；其中，当所述酶剂含有上述玉米赤霉烯酮降解酶或者上述添加剂时，所述酶降解反应的条件包括：温度为20-55℃；ph值为3-9；或者，当所述酶剂含有具有seqidno：1所示的氨基酸序列的玉米赤霉烯酮降解酶时，所述酶降解反应的条件包括：温度为40-55℃，ph值为3-9。

本发明的发明人在研究过程中发现，本发明提供的玉米赤霉烯酮降解酶可以高效且快速地降解zen，具有良好的工业应用前景。并且，本发明提供的玉米赤霉烯酮降解酶还具有耐酸碱和耐高温的特性，这进一步扩大了其应用的范围。

另外，本发明的优选实施方式使用酿酒酵母、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌作为宿主菌株，将其产生的发酵产物直接添加于粮油和/或饲料中，对粮油和/或饲料的适口性的影响较小；而现有技术中通常使用大肠杆菌作为宿主菌株，将其产生的发酵产物添加至粮油和/或饲料中，会影响粮油和/或饲料的适口性。可见，通过本发明提供的方法制备得到的玉米赤霉烯酮降解酶具有更为广阔的应用前景，特别是应用于粮油和/或饲料中。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种玉米赤霉烯酮降解酶，其中，该玉米赤霉烯酮降解酶具有如下(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：

(a)seqidno：2所示的氨基酸序列；

(b)seqidno：2所示的氨基酸序列中第1-262和264位氨基酸残基中的一个或几个经过取代、缺失或添加后仍具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的氨基酸序列。其中，仍具有玉米赤霉烯酮降解酶活性是指在相同的测定条件下，由(a)衍生的蛋白质对zen的降解率与(a)对zen的降解率之间的百分比(相对活性)不低于90％(或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。

组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、甲硫氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)和脯氨酸(pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、天冬氨酸(asn)、谷氨酰胺(gln)和酪氨酸(tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)和组氨酸(his)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由arg取代lys或由leu取代ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述酶的任意一个氨基酸残基位置上。

如前所述，本发明提供的酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的酶具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然l型氨基酸的残基的类似物(如d型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签(如poly-arg、poly-his、flag、strep-tagⅱ和c-myc中的至少一种)对(a)或(b)进行添加修饰。举例来说，(b)可以通过在(a)的氨基末端和/或羧基末端连接标签(如poly-arg、poly-his、flag、strep-tagⅱ和c-myc中的至少一种)而获得(即，(b)为seqidno：2的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列)。所述标签不会影响本发明提供的酶的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

在优选的情况下，所述玉米赤霉烯酮降解酶具有seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4或seqidno：5所示的氨基酸序列，或者，在seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4或seqidno：5的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列。

本发明的玉米赤霉烯酮降解酶可以通过人工合成得到，也可以先获得其编码基因，再通过生物表达获得。

第二方面，本发明还提供了一种编码玉米赤霉烯酮降解酶的基因，其中，该基因具有编码上述玉米赤霉烯酮降解酶的核苷酸序列。

本领域公知的是，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除met(atg)或trp(tgg)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录d)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如pcr方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的dna序列，也可以通过本领域公知的方法，例如sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述酶的活性一致的氨基酸序列。

在优选的情况下，所述基因具有seqidno：7(编码seqidno：2所示的玉米赤霉烯酮降解酶)、seqidno：8(编码seqidno：3所示的玉米赤霉烯酮降解酶)、seqidno：9(编码seqidno：4所示的玉米赤霉烯酮降解酶)或seqidno：10(编码seqidno：5所示的玉米赤霉烯酮降解酶)所示的核苷酸序列。

如上所述，相应地，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有本领域常见的标签(如poly-arg、poly-his、flag、strep-tagⅱ和c-myc中的至少一种)的编码序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(pcr)扩增法、重组法或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用pcr进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入宿主中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

第三方面，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有上述基因。

在本发明中，所述重组载体可以含有本发明提供的上述基因。重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选使用质粒作为载体。重组载体的构建可以采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于puc18，可以使用sali、bamhi、ecori等；对于ppiczɑa，可以使用ndei、nhei、ecori、bamhi、hindiii等；对于pet30a，可以使用bamhi、hindiii、ndei、xhoi等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用ndei和xhoi双酶切pet30a载体及与其连接的基因片段，经连接酶连接，构建得到重组载体。

第四方面，本发明还提供了一种菌株，其中，该菌株含有上述基因或者上述重组载体。

在本发明中，所述菌株可以为含有本发明所述基因的菌株，也可以通过本领域常规的方法将上述重组载体转化、转导或者转染到宿主中以获得的重组菌株，如氯化钙法、化学转化或电击转化，优选电击转化。

根据本发明，所述菌株可以为细菌和/或真菌；优选地，所述菌株为球菌、杆菌、螺旋菌、酵母和霉菌中的至少一种；更优选地，所述菌株为酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑曲霉、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌中的至少一种；进一步优选地，所述菌株为地衣芽孢杆菌(bacilluslincheniformis)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)中的至少一种。

第五方面，本发明还提供了一种添加剂，其中，该添加剂含有本发明提供的玉米赤霉烯酮降解酶，和/或含有上述菌株的发酵产物。

在优选的情况下，所述添加剂以本发明提供的玉米赤霉烯酮降解酶作为活性成分。以所述添加剂的总重量为基准，所述玉米赤霉烯酮降解酶的含量为10-90重量％。

在本发明中，所述添加剂中还可以含有本领域技术人员公知的溶剂(如甘油、糖类和蛋白酶抑制剂等蛋白保护剂)、激动剂等。

在本发明中，所述添加剂还可以含有如前所述的菌株，在此不再赘述。

在本发明中，所述添加剂优选作为粮油和/或饲料添加剂。

第六方面，本发明还提供了一种粮油或饲料，其中，该粮油或饲料含有上述添加剂。以所述粮油或饲料的总重量为基准，所述玉米赤霉烯酮降解酶的含量为1-10ppm，优选为2-8ppm，更优选为4-6ppm。在本发明中，当所述粮油或饲料为液体时，“ppm”表示的是“μg/ml”；当所述粮油或饲料为固体时，“ppm”表示的是“μg/g”。

在本发明中，术语“粮油”是指对谷类、豆类等粮食和油料及其加工成品和半成品的统称，特别是指人类可以食用的产品。例如，所述粮油可以为本领域常见的人类可以食用的粮油产品，具体地，所述粮油可以包括谷物及其农副产品、油和脂肪制品、酒类、奶及其制品等中的至少一种。

在本发明中，术语“饲料”是指农业或牧业饲养的动物的食物的总称。例如，所述饲料可以为本领域常见的饲养动物所使用的食物，具体地，所述饲料可以包括：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(ddgs)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳，棕榈仁和柑橘渣；c)青贮饲料；d)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；e)从植物和动物来源获得的油和脂肪；f)矿物质和维生素。

在本发明中，所述粮油或饲料还可以含有生理学上可接受的载体，其中，所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、na2so4和滑石粉以及它们的混合物。

根据本发明，所述宿主可以为细菌和/或真菌；优选地，所述宿主为球菌、杆菌、螺旋菌、酵母和霉菌中的至少一种；更优选地，所述宿主为酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑曲霉、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌中的至少一种；进一步优选地，所述宿主为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中的至少一种。

在本发明中，可以采用本领域常规使用的方式将上述重组载体导入宿主，例如，氯化钙法、化学转化或电击转化，优选电击转化。

在本发明中，诱导表达的条件可以包括：温度为30-40℃，ph值为6-8，时间为12-72h。优选地，诱导表达的条件包括：温度为35-40℃，ph值为6.5-7.5，时间为24-72h。

第八方面，本发明还提供了上述玉米赤霉烯酮降解酶、基因、重组载体、菌株或者添加剂在降解玉米赤霉烯酮中的应用，优选为在降解粮油和/或饲料中的玉米赤霉烯酮中的应用。

在优选的情况下，在所述粮油和/或饲料中，所述玉米赤霉烯酮的含量至少为1ppm，优选至少为10ppm，更优选至少为20ppm，进一步优选至少为50ppm，最优选至少为200ppm。

第九方面，本发明还提供了一种降解玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括：在酶降解反应的条件下，将酶剂与待处理的样品接触；其中，当所述酶剂含有上述玉米赤霉烯酮降解酶或者上述添加剂时，所述酶降解反应的条件包括：温度为20-55℃，优选为30-40℃；ph值为3-9；优选为6-8。

在本发明中，所述待处理的样品可以为粮油和/或饲料。

优选地，在所述粮油和/或饲料中，所述玉米赤霉烯酮的含量至少为1ppm，优选至少为10ppm，更优选至少为20ppm，进一步优选至少为50ppm，最优选至少为200ppm。

在本发明中，当所述酶剂含有seqidno：1所示的氨基酸序列的玉米赤霉烯酮降解酶时，所述酶降解反应的条件包括：温度为40-55℃，ph值为3-9。

在本发明中，以所述待处理的样品的总重量为基准，所述玉米赤霉烯酮降解酶的用量为1-10ppm，优选为2-8ppm，更优选为4-6ppm。在本发明中，当所述待处理的样品为液体时，“ppm”表示的是“μg/ml”；当所述待处理的样品为固体时，“ppm”表示的是“μg/g”。

在本发明中，所述酶降解反应的时间可以为0.5-48h，优选为1-24h，更优选为1-12h，进一步优选为1-6h。

在本发明中，对所述酶剂的形式并没有特别的限定，只要保证加入所述酶剂后可以使所述待处理的样品中玉米赤霉烯酮降解即可，例如，所述酶剂的形式可以为液体，也可以为冷冻干燥后的干粉。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例和对比例中，zen标准品购于sigma公司；“室温”指“25℃”；

lb液体培养基的配制：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，补水至1000ml，115℃灭菌20min备用，ph7；

zen含量按照gb/t28716-2012的方法进行测定，其中，

zen的降解率(％)＝(反应前样品中zen的质量-反应后样品中zen的质量)/反应前样品中zen的质量×100％。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的玉米赤霉烯酮降解酶及其制备方法和应用。

(1)基因的获得

通过人工化学合成法合成(委托宝生物工程(大连)有限公司，下同)如下核苷酸序列：在如seqidno：7所示的核苷酸序列的5’端添加保护性碱基cgc和ndei酶切位点，在3’端添加保护性碱基ccg和xhoi酶切位点，以获得相应的基因片段。

(2)重组质粒的构建

使用限制性内切酶ndei和xhoi(购自neb公司)分别对由步骤(1)获得的基因片段和pet30a质粒(具有his标签，购于美国invitrogen公司)进行双酶切，于37℃水浴酶切4h，酶切体系(50μl)如下：

将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳后，纯化回收目的片段(分别为质粒酶切片段和基因酶切片段)。然后，使用t4连接酶(购于takara公司)进行连接反应，于室温下连接4h，获得重组质粒。使用的连接体系(10μl)如下：

然后对获得的重组质粒进行pcr验证，并对pcr产物进行测序验证。pcr使用的上下游引物如seqidno：11和seqidno：12所示，pcr扩增条件为：98℃1min；98℃15s，68℃7min，循环30次；72℃3min；4℃保持。

然后将pcr产物进行凝胶电泳，结果显示得到的片段的大小与预期相符，并且测序结果显示pcr产物中含有seqidno：7所示的核苷酸序列，这表明重组质粒构建成功。

(3)重组菌株的获得

在bio-radgenepulse电转仪上使用由步骤(2)获得的重组质粒电转bl21(de3)plyss大肠杆菌菌株(购自北京华越洋生物科技有限公司，货号为nrr01330，下同)，电转化条件为：电压1500v，电容25μf，电阻200ω，转化时间随dna样品的不同而变化，并由仪器自动给出，通常在3.5-4s范围内。然后，将转化后的细胞涂布于含有氯霉素(cam)的lb固体平板上进行筛选，于37℃倒置培养2天，挑取阳性菌落接种于lb液体培养基中，以获得重组菌株。

(4)酶的制备

将得到的重组菌株接种于lb液体培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，补水至1000ml，115℃灭菌20min备用，ph7)中，于37℃培养3天至od600值在2-6之间，收集菌悬液冰浴30min，在4℃条件下，10000rpm离心20min，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液(pbs，135mmnacl，2.7mmkcl，1.5mmkh2po4，8mmk2hpo4，ph7.2)溶液悬浮后，超声波破碎，然后在4℃条件下，10000rpm离心20min，收集上清液，获得粗酶液。

将粗酶液置于冰上，缓慢加入磨碎的硫酸铵粉末，边加边搅拌，添加到硫酸铵饱和为止。在4℃静置24h左右，12000r/min离心50min，弃上清，用少量pbs(ph7.2)溶解沉淀。将pbs溶解的沉淀透析，除去硫酸铵，重悬于缓冲液(ph7.4，50mmnacl，含10mm咪唑)中。根据表达出的重组酶含有his标签，利用ni柱进行亲和层析纯化，1ml/min平衡ni柱后，以流量0.5ml/min直接将重悬的粗酶液上样；继续使用缓冲液(ph7.4，50mmnacl，含10mm咪唑)1ml/min洗脱未吸附或吸附的非特异性杂蛋白；以缓冲液(ph7.4，50mmnacl，500mm咪唑)洗脱收集目的蛋白，以获得纯化的酶液。

(5)酶的活性检测

取步骤(4)得到的酶液980μl置于1.5ml离心管中，加入20μl的zen标准品溶液，混合均匀，得到混合液，其中，混合液中酶的终浓度为5ppm，zen标准品的终浓度为50ppm。

①反应时间对酶活性的影响

将上述混合液于37℃、ph7的条件下进行反应，分别在反应30min、1h、2h、4h和6h时取反应的样品20μl进行高效液相色谱检测zen的残留。结果如表1所示。

通过表1的结果可知，反应1h，zen的降解率达90％以上。因此，在接下来的实验中以1h作为反应时间。

②温度对酶活性的影响

将6份上述混合液分别于20℃、30℃、40℃、45℃、50℃和55℃，ph值为7的条件下反应1h后，取反应后的样品20μl进行高效液相色谱检测zen的残留。结果如表2所示。

③ph对酶活性的影响

将7份上述混合液分别于37℃下，ph值为2、3、4、5、6、8和9的条件下反应1h，取反应后的样品20μl进行高效液相色谱检测zen的残留。结果如表3所示。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的玉米赤霉烯酮降解酶及其制备方法和应用。

根据实施例1的方法制备玉米赤霉烯酮降解酶，所不同的是，使用人工化学合成法合成的如seqidno：8所示的核苷酸序列代替实施例1步骤(1)中的seqidno：7所示的核苷酸序列，以获得基因片段。