本发明涉及泡沫分离，尤其是涉及以天然表面活性剂椰子油皂苷(capb)作为起泡剂的一种采收水溶液中脂肪酶的泡沫分离方法。
背景技术：
脂肪酶(lipase)是一种可逆酶，即除了能催化油脂分解的反应，还能催化酯的合成。此外，脂肪酶催化的化学反应也有特异性好、催化效率强、反应条件不刺激、立体选择性好、副产物少和对仪器设备要求不是很高等特点。因此，在众多的工业领域中，比如食品、皮革、化妆品、洗涤剂、生物医学、生物材料、生物传感器等都有较大的发展[1-6]。脂肪酶在工业上另一大应用是生产生物柴油[7]。脂肪酶的传统收集方法主要有膜过滤和液液萃取，但膜容易受污染，膜的更换较为频繁，且膜本身的制造成本也很高；而萃取的方法提取蛋白质往往会出现乳化的现象，从而导致分离效果变差。目前脂肪酶生产过程中分离纯化成本太高制约了其应用，如何降低其生产成本成为脂肪酶工业研究的重点[8-10]。
泡沫分离技术依据表面吸附原理，当泡沫从分离柱底部生成时，表面活性强的物质会吸附在泡沫上，跟着泡沫一起上升，而表面活性较弱的物质则会留在液体中，泡沫最终在液体上方形成泡沫层，最后通过收集泡沫层，就能够富集到表面活性强的物质，达到选择的效果[11-15]。泡沫分离技术因其具有低成本、高效率且对环境友好的优势，在废水处理、食品、生物、医药、化工等领域受到了很大关注[16-18]。鉴于此，本文考察泡沫分离法收集脂肪酶的工艺。
参考文献：
[1]刘虹蕾,缪铭,江波,etal.微生物脂肪酶的研究与应用[j].食品工业科技,2012,12):376-381.
[2]刘颖,木泰华,孙红男,etal.泡沫分离技术在食品及化工业中的应用现状[j].食品工业科技,2013,13):354-358.
[3]曹茜,冯凤琴.微生物脂肪酶的研究进展及其在食品中的应用[j].中国食品学报,2013,10):136-143.
[4]薛勇.微生物脂肪酶及其催化合成生物柴油的研究[d]:华中科技大学,2004:pages.
[5]杨婧.脂肪酶的固定化及其在油酸丁酯合成中的应用[d]:北京化工大学,2008:pages.
[6]虞英.脂肪酶固定化及其应用研究[d]:江南大学,2007:pages.
[7]朱俊任,郑旭煦,李强,etal.不同来源脂肪酶催化制备生物柴油的研究进展[j].中国农学通报,2010,04):318-322.
[8]fukudah,kondoa,nodah.biodieselfuelproductionbytransesterificationofoils[j].journalofbioscienceandbioengineering,2001,92(5):405-416.
[9]vaisalic,belurpd,regupathii.lipasemediatedsynthesisofrutinfattyester:studyofitsprocessparametersandsolventpolarity[j].foodchemistry,2017,232(278-285.
[10]zimmermannr,straussjg,haemmerleg,etal.fatmobilizationinadiposetissueispromotedbyadiposetriglyceridelipase[j].science,2004,306(5700):1383-1386.
[11]马家骅,谭承佳,韩丽,etal.泡沫分离法用于蜣螂蛋白质分离的研究[j].中草药,2009,08):1223-1225.
[12]张冬梅.基于泡沫分离法处理重金属染料复合废水的机理与应用研究[d]:湖南大学,2012:pages.
[13]刘志红,刘铮,丁富新,etal.用泡沫分离法浓缩和分离蛋白质(ⅰ)——设备及分离过程的研究[j].清华大学学报(自然科学版),1997,12):52-56.
[14]魏凤玉,张静,解辉.泡沫分离法纯化无患子皂苷[j].中成药,2009,07):1021-1024.
[15]王创业.泡沫分离法分离蛋白质的研究[d]:天津大学,2004:pages.
[16]ahmadsi.lawsoffoamformationandfoamfraction1.theeffectofdifferentoperationgparametersonthefoamfractionationofalbuminfromasolutioncontainingorganicandinorganicmaterials[j].sepsci,1975,10:673-688.
[17]christopherel,paulmb,michaelj.purificationofproteinsusingfoamfractionation[j].pharmaceuticalresearch,1997,14(11):1511-1515.
[18]stevensonp.hydrodynamictheoryofrisingfoam[j].mineralsengineering,2007,20:282-289.
[19]苏艳桃.泡沫分离法浓缩、分离甘草水提液中皂苷类成分的研究[d]:成都中医药大学,2006:pages.
[20]徐芸.泡沫分离法去除废水中的表面活性剂及金属离子[d]:天津大学,2012:pages.
技术实现要素：
本发明的目的在于提供以天然表面活性剂椰子油皂苷(capb)作为起泡剂的一种采收水溶液中脂肪酶的泡沫分离方法。
本发明包括以下步骤：
1)检查泡沫分离装置，确定无漏水、无漏气现象；
在步骤1)中，所述泡沫分离装置设有空气压缩瓶、减压阀、压力表、调节阀、截止阀、转子流量计、空气分布器、泡沫发生管、收集瓶和残液排出阀；所述空气压缩瓶的出口经减压阀和压力表接调节阀的输入端，调节阀的输出端接截止阀的输入端，截止阀的输出端经转子流量计分别接空气分布器和残液排出阀，空气分布器的输出端接泡沫发生管的输入端，泡沫发生管的输出端接收集瓶，残液排出阀的出口排出残液。
2)测试不同表面活性剂的性能；
在步骤2)中，所述测试不同表面活性剂的性能的具体方法可为：配制不同表面活性剂溶液，测试不同表面活性剂的性能；所述不同表面活性剂溶液可包括天然非离子型表面活性剂椰子油起泡剂(capb)、阳离子型表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、阴离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠(dbs)和十二烷基苯磺酸钠(sdbs)、非离子型表面活性剂正葵基葡萄糖苷(c10apg)，所述不同表面活性剂溶液的摩尔浓度均为0.001mol/l。
3)配制待分离的脂肪酶溶液；
在步骤3)中，所述配制待分离的脂肪酶溶液的具体方法可为：配制不同浓度的脂肪酶水溶液，加入表面活性剂，用6mol/l和1mol/lnaoh溶液、6mol/l和1mol/lhcl溶液调节溶液ph值。
4)在泡沫分离装置的泡沫发生管中加入脂肪酶水溶液，打开空气压缩瓶的阀门、减压阀、调节阀和截止阀，空气由压缩瓶输出，并分为两路，通过压缩瓶上的压力表和转子流量计，调节所需支路的气体流速，气体抵达泡沫发生管的底部，在空气分布器上均匀分布并向上输送，从而带动、分离泡沫发生管内的溶液溶质，气泡最终由泡沫发生管顶端排出，并收集到收集瓶中，残液则由残液排出阀排出；
5)收集结束后的样品封口，静置消泡，测量泡沫液体积和脂肪酶的浓度；
在步骤5)中，所述封口可采用保鲜膜封口。
6)根据所得数据计算回收率r与富集比e的值并作图；
7)清洗泡沫发生管。
在步骤7)中，所述清洗泡沫发生管，可先用自来水洗净，再用蒸馏水冲洗至少1次，最后干燥。
本发明以天然表面活性剂椰子油皂苷(capb)作为起泡剂和捕集剂，确定泡沫分离采收脂肪酶的最佳工艺条件，以天然表面活性剂椰子油皂苷(capb)作为起泡剂和捕集剂，通过重复实验，以脂肪酶回收率与富集比作为依据，确定了泡沫分离采收脂肪酶的最佳工艺条件：常温下，脂肪酶水溶液ph为9、分离气速为600ml/min、装液量为300ml、椰子油起泡剂浓度为0.035g/l、初始酶浓度为5g/l。此时，脂肪酶富集比e＝5.83，回收率r＝98.18％。
附图说明
图1为本发明实施例所述泡沫分离装置的结构组成示意图。
图2为5种表面活性剂不同浓度对用界面张力。
图3为初始酶浓度对富集比和回收率的影响。
图4为空气流速对富集比和回收率的影响。
图5为表面活性剂浓度对富集比和回收率的影响。
图6为装液量对富集比和回收率的影响。
图7为ph值对富集比和回收率的影响。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
参见图1，所述泡沫分离装置实施例设有空气压缩瓶1、减压阀2、压力表3、调节阀4、截止阀5、转子流量计6、空气分布器7、泡沫发生管8、收集瓶9和残液排出阀10；所述空气压缩瓶1的出口经减压阀2和压力表3接调节阀4的输入端，调节阀4的输出端接截止阀5的输入端，截止阀5的输出端经转子流量计6分别接空气分布器7和残液排出阀10，空气分布器7的输出端接泡沫发生管8的输入端，泡沫发生管8的输出端接收集瓶9，残液排出阀10的出口排出残液。
以下给出具体实施例。
实施例1
本实施例是改变表面活性剂的种类，固定其它试验因素，比较不同表面活性剂的起泡能力和泡沫的稳定性，确定最佳表面活性剂。
步骤：
配制5种溶液：表面活性剂capb浓度为0.001g/l、c10apg浓度为0.001g/l、sdbs浓度为0.001g/l、dbs浓度为0.001g/l、ctab浓度为0.001g/l。采用图1的泡沫分离装置，向泡沫发生管中加入液体量为200ml，调节空气流速为100ml/min，实验时间1min，观察并测量气泡上升高度，将此高度记为起泡初始高度，来代表表面活性剂起泡能力；接着分别在0min、0.5min、1min、1.5min、2min、3min、3.5min记录泡沫高度，与泡沫初始高度之比为起泡稳定性的度量。实验在同一温度下进行并重复3次，将结果取平均值。5种表面活性剂的表面张力-浓度图如图2所示，5种表面活性剂起泡能力与起泡稳定性测定结果如表1所示，5种表面活性剂泡沫高度及其所用时间结果如表2所示。
表1
表2
由表1中可看出5种表面活性剂降低表面张力能力大小为：c10apg>capb>sdbs>ctab>dbs，capb降低界面张力能力弱于同类型的非离子表面活性剂c10apg，强于其他化学的离子型表面活性剂，且浓度最低。这表明capb在起泡性和用量上有很大优势。由表2中，可看出5种表面活性剂的起泡能力大小为：c10apg>capb>sdbs>ctab>dbs，与上面降低表面张力能力一致。起泡稳定性不同导致最后泡沫高度不同。在实验管长范围内，c10apg、capb、ctab起泡能力和稳定性都很好。sdbs的起泡能力相较前三者较弱，且在最后测量的1min时，其上升速度开始略低于前面上升的速度。而dbs在测量过程中有自消泡现象，由数据可以看出，起泡能力和稳定性也最差。
综上，capb的起泡能力和泡沫的稳定性非常好，而且capb作为一种天然提取物符合本发明的理念，故选用capb作为最佳表面活性剂。
实施例2
本实施例是改变泡沫分离体系中初始脂肪酶浓度，固定其它实验因素，比较不同初始酶浓度下脂肪酶的回收率和富集比，确定分离采收水溶液中脂肪酶的初始酶浓度。
步骤：
配制脂肪酶溶液浓度分别为5、10、15、20g/l。采用图1装置，向泡沫发生管中加入液体量为200ml、调节气速为600ml/min，进行泡沫分离采收水溶液脂肪酶实验，收集时间为15min，实验结果如图3所示。
由图3数据分析，随着初始酶浓度浓度增加，回收率增加而富集比降低，在初始酶浓度为5g/l条件下，并无浓缩液产出。酶溶液浓度低时，泡沫分离的效果更好，但脂肪酶降低表面张力能力有限，因此泡沫较少且稳定性较差，导致回收率低。因此，选取初始酶浓度为5g/l条件下，加入表面活性剂后，考察泡沫分离采收脂肪酶工艺条件。
实施例3
本实施例是改变泡沫分离体系中的分离气速，固定其它实验因素，比较不同分离气速下脂肪酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收水溶液脂肪酶的分离气速。
步骤：
配制溶液初始脂肪酶浓度为0.5g/l、capb浓度为0.040g/l，采用图1装置，向泡沫发生管中加入液体量为200ml，调节空气气速依次为200、400、600、800、1000ml/min，进行泡沫分离采收水溶液脂肪酶实验、收集时间为15min，实验结果如图4所示。
由图4分析可知，富集比随着空气流速的增大而增大，而回收率随着空气流速的增大而降低。空气流速低，溶液的起泡能力差，富集比低，而高空气流速下产生的气泡虽然增多但很快破裂，使最终收集的浓缩液量太少，导致回收率较低。综合考虑，最佳空气流速定为600ml/min。
实施例4
本实施例是改变泡沫分离体系中表面活性剂的浓度，固定其它实验因素，比较不同表面活性剂浓度下脂肪酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收水溶液脂肪酶的表面活性剂浓度。
步骤：
配制溶液初始脂肪酶浓度为5g/l、capb浓度分别为0.005、0.010、0.0175、0.035g/l，采用图1装置，向泡沫发生管中加入液体量为200ml，调节空气气速为600ml/min，进行泡沫分离采收水溶液脂肪酶实验、收集时间为15min。实验结果如图5所示。
实验结果表明：脂肪酶富集比随着表面活性剂浓度增加而降低，回收率随着表面活性剂浓度增加而增加。表面活性剂浓度太低，生成的泡沫不稳定，待生成足够多的泡沫到塔顶时，泡沫中的水分大多已经流失，因而富集比较高，但由于泡沫量少而回收率较低。本发明选取0.035g/l为最佳表面活性剂浓度，其回收率为39.2％。
实施例5
本实施例是改变泡沫分离体系中的装液量，固定其它实验因素，比较不同装液量下脂肪酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收水溶液脂肪酶的装液量。
步骤：
配制溶液初始实施例酶浓度为5g/l、capb浓度为0.035g/l，采用图1装置，向泡沫发生管中加入液体量为分别为50、100、200、300、400ml，调节空气气速为600ml/min进行泡沫分离采收水溶液脂肪酶实验、收集时间为15min，实验结果如图6所示。
实验结果表明：若泡沫分离塔的高度是固定的，不同的分离原液体积会影响泡沫层高度和液体层高度的比值，进而影响吸附到气液界面的表面活性分子、泡沫排水和泡沫分离。装液量较小时，泡沫上升所需时间较长，使得泡沫能够较充分排水；而装液量增加，泡沫在液相中停留的时间增长，使得脂肪酶更多地吸附在相界面上。图6表明，随着装液量增加，脂肪酶富集比和回收率先增加而后降低。装液量为300ml时，富集比和回收率达到最大值，分别为4.39和66.39％，故选取装液量为300ml为最佳条件。
实施例6
本实施例是改变泡沫分离体系中的初始溶液的ph值，固定其它实验因素，比较不同ph下脂肪酶的回收率和富集比，确定最佳分离采收水溶液脂肪酶的ph值。
步骤：
配制溶液初始脂肪酶浓度为5g/l、capb浓度为0.035g/l，采用图1装置，向泡沫发生管中加入液体量为300ml，溶液ph分别为3、5、7、9、11、调节空气气速为600ml/min、进行泡沫分离采收水溶液脂肪酶实验，实验结果如图7所示。
由图7的数据分析可得，当ph值低于9时，脂肪酶的富集比和回收率随着ph值的增加而增加；当ph值高于9时，脂肪酶的富集比和回收率随着ph值的增加反而降低。当ph值为9时，富集比和回收率分别达到最高，分别达到5.83和98.18％。在等电点处，蛋白质分子所带的静电荷为零，分子间相对作用力最小，液体的表面张力最低，疏水性最强，更容易吸附在气液界面并形成稳定的泡沫，从而提高了富集率和回收率，分离效果趋于最优。ph值为9时，气泡稳定性最好。ph值与9相差越大，气泡的稳定性越差；ph值为3时，泡沫产生后迅速消泡。故ph值为9是脂肪酶泡沫分离的最佳条件。
以下给出分析方法：
1、溶液脂肪酶分离效果评价指标
脂肪酶的提取效果采用富集比、酶蛋白收集率为评价指标，如下所示。
富集比：
酶蛋白回收率：
式中c1为收集的泡沫液蛋白浓度，g/l；c0为初始液中的脂肪酶蛋白浓度，g/l；v1为泡沫液体积，l；v2为初始液体积[19]。
2、溶液中脂肪酶的浓度的测定
蛋白质测定采用考马斯亮兰分光光度比色法。
方法与测标准品的方法一致，在200μl考马斯亮蓝试剂中加入20μl未知样品后充分混匀，并且要大概知道未知样品的浓度，不能超出标准曲线的直线范围。再根据测得的od595nm值，结合标准曲线计算出标准蛋白质的量，从而计算出样品的蛋白质浓度(mg/ml)。