本发明涉及一种无损伤提取克氏原螯虾dna的方法，属于生物工程领域。
背景技术：
克氏原螯虾型似虾而外壳坚硬。体长约5.6-11.9厘米，暗红色，甲壳上部分为黑色，是淡水经济虾类。因肉味鲜美受到广大人们的喜爱。因其杂食性、生长迅速、适应能力强等原因在外界环境中具有绝对的竞争优势。其摄食范围包括水草、藻类、水生昆虫、动物尸体等。
然而，进行克氏原螯虾的遗传多样性研究和保护需要大量的克氏原螯虾样本进行生物分析，进行生物分析的基础往往是提取dna和rna进行研究。传统的提取克氏原螯虾dna的方法是从肌肉内提取，这些提取dna的方法会对克氏原螯虾造成很严重的损伤，影响克氏原螯虾的生长，甚至会对幼小的克氏原螯虾造成死亡，由此可见，开展一种无损伤提取克氏原螯虾dna的方法势在必行。
无损伤提取dna是指在不伤害动物本身的情况下，通过收集脱落的毛发、皮肤、羽毛、粪便、尿液、脱落的鱼鳞等从中提取dna的过程。目前关于鱼类无损伤提取dna的报道仅有几篇，关于克氏原螯虾无损伤提取dna的方法尚未报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供了一种无损伤提取克氏原螯虾dna的方法。
技术方案
1.一种无损伤提取克氏原螯虾dna的方法包括如下步骤：
（1）获取样本：取克氏原螯虾刚脱掉的外壳100mg，放入4℃下，防止dna降解；
（2）样本的处理：把外壳放入研钵进行研碎成粉末状，研磨时加入少量液氮，保持外壳一直处于低温状态；
（3）裂解细胞：把研磨好的外壳粉末加入0.5ml裂解液和0.03ml蛋白酶k，然后56℃水浴1个小时，裂解细胞，每隔10分钟摇晃一次样品；
（4）沉淀蛋白质：把裂解细胞的结果放在低温离心机4℃离心10分钟，转速为5000转/分，把上清液转移到新的离心管内，加入0.5ml饱和酚和0.3ml氯仿，剧烈摇晃10秒，然后4℃放置10分钟，沉淀蛋白质；
（5）沉淀dna：把沉淀蛋白质的结果放在低温离心机4℃离心10分钟，转速为10000转/分，把上清液转移到新的离心管内，加入零下20℃预冷的1ml异丙醇，剧烈摇晃10秒，4℃放置10分钟，沉淀dna；
（6）洗涤dna：把沉淀dna的结果放在低温离心机4℃离心10分钟，转速为10000转/分，把上清液倒掉，留下白色沉淀，加入1ml70%的乙醇洗涤dna，剧烈摇晃10秒，4℃放置1分钟，洗涤dna；
（7）获取dna：向洗涤后的dna加0.3ml水获取dna。
2.上述的获取样本时，其特征在于：从克氏原螯虾获取外壳时，要刚脱掉的外壳，脱壳时间不能超过半小时，取到外壳后放置在4℃环境中，放置dna降解。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
1．本发明建立了一套完整的提取克氏原螯虾dna的方法。
2．本发明提供的提取克氏原螯虾dna方法不会对克氏原螯虾造成任何损伤。
3.本发明提供的提取克氏原螯虾dna方法比传统的酚-氯仿法更为简单快速。
4.本发明提供的提取克氏原螯虾dna方法费用较低。
附图说明
图1是dna的检测结果示意图。
具体实施方式
实施例1
一、提取dna
1.克氏原螯虾外壳的获取：
从江苏无锡获得刚脱壳不到半小时的外壳24个，取克氏原螯虾刚脱掉的外壳100mg，放入4℃下，防止dna降解。
2.样本的处理：
把外壳放入研钵进行研碎成粉末状，研磨时加入少量液氮，保持外壳一直处于低温状态。
3.裂解细胞：
把研磨好的外壳粉末加入0.5ml裂解液和0.03ml蛋白酶k，然后56℃水浴1个小时，裂解细胞，每隔10分钟摇晃一次样品。
4.沉淀蛋白质：
把裂解细胞的结果放在低温离心机4℃离心10分钟，转速为5000转/分，把上清液转移到新的离心管内，加入0.5ml饱和酚和0.3ml氯仿，剧烈摇晃10秒，然后4℃放置10分钟，沉淀蛋白质。
5.沉淀dna：
把沉淀蛋白质的结果放在低温离心机4℃离心10分钟，转速为10000转/分，把上清液转移到新的离心管内，加入零下20℃预冷的1ml异丙醇，剧烈摇晃10秒，4℃放置10分钟，沉淀dna。
6.洗涤dna：
把沉淀dna的结果放在低温离心机4℃离心10分钟，转速为10000转/分，把上清液倒掉，留下白色沉淀，加入1ml70%的乙醇洗涤dna，剧烈摇晃10秒，4℃放置1分钟，洗涤dna。
7.获取dna：
向洗涤后的dna加0.3ml水获取dna。
二、dna的检测
1.以按照上述步骤提取的24个克氏原螯虾dna为模板用微卫星引物进行检测。微卫星引物序列为：f:ggttcctgagcctactggac；r:agccgcaccttaacaatctt。pcr扩增体系为：pcr反应液12.5ul、上下游引物各1ul、超纯水9.5ul、dna模板1ul。pcr反应程序为：95℃预变性2min;95℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。把pcr扩增产物放入10%的聚丙烯酰胺胶电泳中检测，120v电压40分钟，经凝胶成像分析系统观察呈现引物所要求的扩增条带，结果如图1所示，说明dna提取较好，可用于分子实验研究。