本发明涉及生物医学领域中艾滋病的生物细胞治疗。
背景技术：
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)引起的传染病，在全球广泛流行，根据世界卫生组织(who)和联合国艾滋病规划署的有关报告，自1981年美国发现首例艾滋病病例以来，至今全球有208个国家和地区受到了艾滋病的严重威胁，约有4000万人感染了艾滋病，死亡人数已超过2000万，每天约有6000人成为艾滋病感染者，同时每天约有300多人死于艾滋病。在中国hiv感染者正处于高速增长期，目前已远超过100万。艾滋病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病、结核病、糖尿病后又一个人类面临的重大感染性疾病，已成为全球关注的严重的公共卫生和社会问题。
从目前已用于临床的艾滋病治疗方法看，效果不很理想：(1)hiv逆转录酶抑制剂：仅能防止尚未感染hiv的易感细胞感染，对已感染的细胞没有治疗作用，且毒副作用较多，包括腺粒体毒性、骨髓抑制、红细胞性贫血、粒细胞和血小板减少、胰腺炎，加之交叉耐药性的产生，这类药已不单独使用，主要做联合用药，且易产生耐药变株，导致临床疗效下降或失效。(2)hiv蛋白酶抑制剂：易产生药物性肝损伤、脂质代谢紊乱等毒副作用及耐药性。(3)hiv整合酶抑制剂：通过抑制hiv病毒dna与宿主细胞dna整合而发挥作用，与hiv逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合同时使用对抗病毒有协同作用。(4)抑制hiv病毒进入抑制剂：包括阻断gp120与cd4结合、阻断hiv与辅助受体结合、作用于gp41膜亚单位及作用于t淋巴细胞表面cc趋化因子受体5(ccr5)来阻断hiv进入宿主细胞，但对肝和心脏有副作用。(5)细胞因子治疗：主要用于调节t细胞动态平衡。(6)hiv疫苗治疗：由于hiv的特殊性，如固有免疫不足以抵御hiv及其靶向破坏免疫系统，病毒突变迅速，导致至今尚未开发出真正安全有效的疫苗。(7)基因治疗：hiv基因治疗的研究从未间断，包括反义技术、rna诱饵、rna干扰、细胞内抗体、显性阴性突变体、自杀基因等，但进入ii期临床试验阶段的基因疗法几乎没有。(8)单克隆抗体被动免疫疗法：通过下调cd4+t细胞表面ccr5来降低hiv的易感性、延缓艾滋病的进展和减少hiv的扩散，中和单克隆抗体2g12、2f5和4e10应用于hiv感染者具有良好的耐受性和安全性，能延缓但不能阻止病毒的反弹(9)过继性免疫细胞治疗：体外大量培养hiv自体的cd4+t细胞时会导致病毒大量扩增，增加病毒感染的cd4+t细胞数量，而回输cd4+t细胞可能会增加体内病毒复制的场所，导致病毒载量反弹，总体上看，过继性免疫细胞治疗无明显的毒副作用，也未取得满意的治疗效果。
hiv进入人体后，首先被巨噬细胞吞噬，但hiv很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内繁殖。因为cd4是hiv的受体，所以经巨噬细胞内繁殖的hiv通过其囊膜蛋白gp120并在gp41的辅助下(gp41起着桥的作用，利用自身的疏水作用介导病毒囊膜与细胞膜融合)进入cd4+细胞(细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等)，在细胞内迅速增殖，每天产生109～1010病毒颗粒，并不断进入其他正常的和再生的cd4+细胞内复制，制造更多的病毒感染细胞，使外周血cd4+t细胞持续破坏、减少。hiv的gp120与cd4受体结合可直接激活受感染的细胞凋亡，甚至感染hiv的t细胞表达的囊膜抗原也可启动正常t细胞，通过细胞表面cd4分子交联间接地引起cd4+细胞的大量破坏，结果造成以cd4+t细胞缺损为中心的严重免疫缺陷，患者主要表现：外周淋巴细胞减少，t4/t8比例配置，对植物血凝素和某些抗原的反应消失，迟发型变态反应下降，nk细胞、巨噬细胞活性减弱，il2、γ干扰素等细胞因子合成减少。cd4+t细胞是最重要的免疫细胞，感染者一旦失去了大量cd4+t细胞，整个免疫系统就会遭到致命的打击，对各种疾病的感染都失去了抵抗力。
cd4+t细胞是t淋巴细胞的一种，平均寿命一般为7天左右，难以在体外长期培养，用于制备cd4+t细胞因子，作为cd4+t细胞因子缺乏的艾滋病的治疗。
技术实现要素：
为了构建一种能在体外长期培养，用于cd4+t细胞因子制备的杂交瘤细胞株，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是要提供一种能在体外长期传代培养中产生cd4+t细胞因子的杂交瘤cd4+t细胞株的构建方法。
本发明的目的是这样实现的：以免疫磁珠法分选的cd4+t细胞，和骨髓瘤细胞(sp2/0)经含有pha、ifn-γ、sp2/0-igg、cd4+t-igg和spa的预融合剂处理，在pha和ifn-γ的活化下，iggfc段与spa结合而iggfab段各自与cd4+t细胞、sp2/0细胞结合，依赖于spa和igg的作用，将cd4+t细胞和骨髓瘤细胞(sp2/0)连接在一起，进而在融合剂聚乙二醇(peg1000-2000)的作用下使两种细胞融合，经细胞融合培养基(hat)选择培养，获得能在体外长期传代、能产生ifn-γ、il-2、il-4细胞因子的抗hiv感染的杂交瘤cd4+t细胞株。
本发明配制了含有pha、ifn-γ、sp2/0-igg、cd4+t-igg和spa的预融合剂，经融合前处理后，依赖于spa和igg的作用，使被融合细胞各自与与iggfab段结合，并经iggfc段与spa的结合，使待融合的cd4+t细胞和骨髓瘤细胞(sp2/0)连接在一起，继之在低浓度融合剂聚乙二醇(peg1000-2000)的作用下使两种细胞融合，经细胞融合培养基(hat)选择培养，获得能在体外长期培养、能产生ifn-γ、il-2、il-4细胞因子的抗hiv感染的杂交瘤cd4+t细胞株，这些细胞因子具有重要的生理功能，能为cd4+t细胞因子的体外制备、以用于相关疾病的治疗奠定基础，特别是以破坏cd4+t细胞为病理特征的艾滋病患者，可取含hiv的患者自身血浆与杂交瘤cd4+t细胞株在体外长期培养、不断提取培养液中的细胞因子，用于艾滋病的治疗。
具体实施方式
图1是本发明的spa协同双抗体助融示意图。
图2是本发明的细胞融合实拍图。
图3是本发明的细胞融合示意图。
在图1中，1表示具有iggfc受体的金黄色葡萄球菌a蛋白(spa)，2表示编号为6和7的待融合细胞的单克隆抗体，3表示编号为4和5的待融合细胞的单克隆抗体，在单克隆抗体[2]与编号为6和7的待融合细胞结合、单克隆抗体[3]与编号为4和5的待融合细胞结合后，再经spa的连接，编号为4、5、6和7的细胞均有利于在peg的作用下发生融合。
在图2中，在单克隆抗体和/或spa的助融下，经hat筛选2周，在倒置显微镜下拍摄(40x)，得到杂交瘤细胞克隆。
下面结合图1和图2，对本发明的实施方案作具体的描述。
1、cd4+t细胞的分选
参照有关文献，以密度梯度离心法从新鲜血液(新生儿脐带血或献血员血液)中分离单个核细胞，然后以免疫磁珠法分离cd4+t细胞。
2、杂交瘤cd4+t细胞的构建：
(1)培养基及主要试剂：dmem培养基、hat选择培养基购自sigma公司，胎牛血清(fbs)购白天津市灏洋生物制品科技责任有限公司；dmso(--甲基亚砜)为国产分析纯试剂；预融合剂：①基础液：在dmem培养基中配入终浓度为5μg/ml植物血凝素(pha)、5.5μg/lifn-γ；②应用液：先在基础液中配入与骨髓瘤细胞等效价的抗骨髓瘤细胞抗体(sp2/0-igg即抗cd138抗体)，再配入与骨髓瘤细胞等效价的抗cd4+t细胞抗体(cd4+t-igg即抗cd4抗体)，最后配入与骨髓瘤细胞等效价的金黄色葡萄球菌a蛋白(spa)，临用前配制并置37℃1h使用。其中pha的作用是活化cd4+t细胞、促其增殖；ifn-γ的作用是活化iggfc受体、促细胞融合；cd4+t-igg和sp2/0-igg可以cd4+t、sp2/0免疫动物制备(单克隆抗体)或商品购得，iggfab段各自与cd4+t细胞、sp2/0细胞结合，而iggfc段均与spa结合，每个spa分子有3个iggfc结合区但可结合2个iggfc，在融合前的预处理中2个iggfc段与spa结合而iggfab段各自与cd4+t细胞、sp2/0细胞结合，依赖于spa和igg的作用，将cd4+t细胞和骨髓瘤细胞连接在一起，使细胞融合。
(2)骨髓瘤细胞准备：融合前一周从液氮罐内取出一管冻存的骨髓瘤细胞(sp2/0)，立即放入热水解冻(应用最多的是sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h；与人体相关的实际应用中考虑选择同源细胞株，如上海复祥生物科技有限公司向atcc细胞库引进的nci-h929人骨髓瘤细胞株)。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加dmem培养液，置co2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合时将sp2/0从培养瓶上吹下，转入离心管中，1000r/m离心5-10min，重复洗涤细胞2次，轻轻敲打混匀后取少量悬液计数，调整好密度，按经验保证在融合时其密度为80％左右。
(3)待融合cd4+t细胞的准备：本发明分选的cd4+t细胞以dmem培养液(基础培养基)调整总细胞数到1×108～2×108，用于细胞融合，以台盼兰染色、相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。
(4)融合前处理：将cd4+t细胞与骨髓瘤细胞以10∶1-5∶1的比例加入离心管中，混和均匀，1000r/m离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，加入2ml预融合剂的应用液，37℃2小时，1000r/m离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀。
(5)细胞融合：在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μl的30％peg3000在60s内沿管壁滴加到融合管中，同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25ml基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，转置56℃水浴放散抗体5分钟(除去结合的抗体)，立即以1500r/m离心5min，弃去上清，加入50mlhat培养基，适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
(6)杂交瘤cd4+t细胞的筛选：观察96孔板细胞生长情况，7-10天后仅有杂交瘤cd4+t细胞能够生长，此时弃去hat培养基，更换完全培养基。细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，选择有生长状态良好的杂交瘤细胞株的培养孔，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，37℃，5％co2培养箱内培养约1周，显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，取细胞或培养上清检测杂交瘤cd4+t细胞的特性。
(7)杂交瘤cd4+t细胞特性检测
(a)传代寿命：将杂交瘤cd4+t细胞作扩增培养，培养3个月，随机分别取5个培养瓶的部份细胞，以台盼兰染色，用相差显微镜检查，计数100个细胞，活细胞数分别为93％、88％、91％、92％、89％；而非杂交瘤t细胞的平均寿命一般为7天左右。
(b)对hiv的抗感染性：取3例艾滋病(aids)患者的血浆，各1.0ml，其中的0.5ml与1.5ml浓度为1*105/ml的杂交瘤cd4+t细胞混合，另外的0.5ml与1.5ml细胞培养液混合(空白对照)，均在37℃培养48小时，然后分别分离细胞培养液，并分别按hiv-1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(od)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性。检测结果如表1，杂交瘤cd4+t细胞培养液与对照培养液的p24检测结果分别平均为85.13pg/ml和85.17pg/ml，p＞0.05，两者无统计学差异，说明hiv与杂交瘤cd4+t细胞在37℃混合培养48小时后，hiv基本不被杂交瘤cd4+t细胞吸附或基本未进入杂交瘤cd4+t细胞。
表1杂交瘤cd4+t细胞培养液与对照细胞培养液p24检测结果(pg/ml)
(c)杂交瘤cd4+t细胞分泌细胞因子的功能：取5例艾滋病(aids)患者的血浆，各1.0ml，与0.5ml浓度为1010/ml的杂交瘤cd4+t细胞混合，加5.0ml细胞培养液；另取1.0ml正常血浆，与5.5ml细胞培养液混合(空白对照)，均在37℃连续培养4周，然后从第2周开始，每周分别取更换的细胞培养液，进行cd4+t细胞因子检测，从检测结果(表2)可知，在第2、3、4周的培养液中，ifn-γ、il-2、il-4的平均检测值(μg/l)分别为2.4、2.3、2.3；2.5、2.3、2.4；2.3、2.5、2.4，而空白对照未检出相应的细胞因子，正常的非杂交瘤cd4+t细胞在1周内死亡，于第2周时已死亡的cd4+t细胞无法产生细胞因子，只有本申请的杂交瘤cd4+t细胞能在体外长期培养，并在培养过程中产生细胞因子，而这些细胞因子具有重要的生理功能，所以，本申请能为cd4+t细胞因子的体外制备、以用于相关疾病的治疗奠定基础。
表2杂交瘤cd4+t细胞体外长期培养过程产生的细胞因子检测结果(μg/l)