本发明属于化学领域，涉及一种藻毒素及其提取纯化方法。
技术背景
近年来由水体富营养化导致的蓝藻水华污染已引起全球关注。蓝藻水华污染所带来的主要危害是有毒蓝藻向水体中释放多种不同类型的微囊藻毒素(microcystis,mcs)，其中微囊藻毒素mc-lr和mcrr是我国富营养化水体中最主要的两种藻毒素。mcs是一种公认的肝毒素和促癌剂，长期饮用含有mcs的水会对人的肝脏造成损伤，极端情况下会危及到人的生命。目前藻毒素纯品仅有美日德等少数几家公司可提供，价格昂贵，许多基于藻毒素的研究工作无法深入开展。这种背景下，研制开发一种藻毒素提取纯化的技术成为急需解决的问题。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种藻毒素及其提取纯化方法。该提取纯化方法适于毫克级微囊藻毒素的制备，制得作为标准样品的藻毒素。
为了达到前述的发明目的，本发明提供一种藻毒素的提取纯化方法，其包括以下步骤：
步骤一：采用质量浓度为60wt％的甲醇溶液溶解蓝藻干粉，超声振荡后形成藻浆，然后离心沉降，分离出上层清液和残渣；
步骤二：向所述残渣中加入质量浓度为60wt％的甲醇溶液溶解，然后磁力搅拌并超声振荡形成藻浆，随后离心沉降，再次分离出上层清液和残渣，将本步骤获得的上层清液与步骤一获得的上层清液混合，形成粗提液；
步骤三：重复所述步骤二2次以上，然后调节所述粗提液的ph值去除蛋白质，再经过滤、除甲醇后得到提取液；
步骤四：将所述提取液经滤膜初步过滤后采用固相萃取柱进行富集浓缩和洗脱，保护气吹干后得到藻毒素。
上述藻毒素的提取纯化方法中，离心沉降的转速≥12000r·min-1。上述藻毒素的提取纯化方法以收获于野外的水华蓝藻的干粉为原料，从中提取高纯度的微囊藻毒素具有效率高，投资少，安全性高，纯度高，对环境无污染等优点；通过采用调节粗提液的ph值至藻胆蛋白等电点的方法除去粗提液中大量存在的藻胆蛋白，简单有效，并取得了很好的纯化效果。所提纯得到的微囊藻毒素的纯度经hplc-uv/dad检测可达90％以上，因此，上述藻毒素的提取纯化方法提纯得到的微囊藻毒素可做标准样品。
根据本发明的具体实施例，优选地，所述蓝藻干粉包括水华蓝藻制得的干粉。
根据本发明的具体实施例，优选地，所述步骤三中，采用砂芯漏斗进行过滤。
根据本发明的具体实施例，优选地，所述步骤三中，所述除甲醇的步骤为：在40℃下，采用真空旋转蒸发去除甲醇，得到所述提取液。
根据本发明的具体实施例，优选地，所述步骤四中，所述滤膜的孔径为0.45μm以下。
根据本发明的具体实施例，优选地，所述步骤四中，在进行富集浓缩和洗脱前，依次采用纯甲醇和超纯水将所述固相萃取柱进行活化。
根据本发明的具体实施例，优选地，所述步骤四中，所述富集浓缩的流速为4ml·min-1。
根据本发明的具体实施例，优选地，所述步骤四中，所述富集浓缩和洗脱的步骤为：将经滤膜过滤后的提取液注入固相萃取柱中进行富集浓缩；然后采用质量浓度为20wt％的甲醇溶液和质量浓度为30wt％的甲醇溶液依次淋洗固定相；采用保护气吹干所述固相萃取柱，然后采用质量浓度为40wt％的甲醇溶液淋洗小柱，最后采用质量浓度为70wt％的甲醇溶液洗脱，再用保护气吹干浓缩至所需浓度，得到藻毒素。该藻毒素可以为浓缩液。
根据本发明的具体实施例，优选地，所述质量浓度为70wt％的甲醇溶液中添加有质量浓度为0.02wt％三氟乙酸。
本发明还提供一种藻毒素，其是通过上述藻毒素的提取纯化方法提纯得到的微囊藻毒素。
根据本发明的具体实施例，优选地，所述藻毒素的hplc-uv/dad检测纯度≥90％。可以作为标准样品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的藻毒素的提取纯化方法以收获于野外的水华蓝藻的干粉为原料，来源简单、来源广，在提取藻毒素的同时，能够一定程度治理水华蓝藻的污染；
(2)本发明提供的藻毒素的提取纯化方法效率高，投资少，安全性高，纯度高，对环境无污染；适于毫克级微囊藻毒素的制备，易于工业化生产，所得微囊藻毒素的纯度经hplc-uv/dad检测≥90％，可做标准样品。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明可实施范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种藻毒素的提取纯化方法，其包括以下步骤：
(1)提取粗提液：
采用质量浓度为60wt％的甲醇溶液溶解蓝藻干粉，超声振荡后形成藻浆，取100ml藻浆进行离心沉降，离心转速为12000r·min-1，沉降12min后分离出上层清夜和残渣；
抽取上层清液，然后向残渣中加入60ml质量浓度为60wt％甲醇溶液溶解，并放置在磁力搅拌器上搅拌60min，随后超声振荡20min，再在12000r·min-1的转速下离心沉降15min，再次分离出上层清夜和残渣；取上清液与第一步中的上层清夜混合，重复本步骤两次，将每次获得的上层清夜与第一次分离出的上层清夜混合，形成粗提液，然后去除残渣；
(2)去除蛋白质，制备提取液：
调节步骤(1)获得的粗提液的ph值，去除藻蛋白、产生沉淀，净化后经砂芯漏斗过滤，然后在40℃条件下进行真空旋转蒸发去除甲醇，得到提取液；
(3)纯化：
将步骤(2)获得的提取液通过0.45μm滤膜，收集滤液待提纯；
先依次采用10ml100％甲醇、10ml超纯水活化固相萃取柱；然后将滤液流经固相萃取柱进行富集浓缩，流速为4ml·min-1，接着用质量浓度为20wt％以及质量浓度为30wt％的甲醇溶液各用10ml分别淋洗固定相，再采用氮气吹干固相萃取柱，然后以5ml质量浓度为40wt％甲醇溶液淋洗小柱(不用吹干)，最后用5ml质量浓度为70wt％甲醇溶液洗脱，再氮气吹干浓缩至1ml，获得藻毒素浓缩液，并进行待hplc分析；
其中，质量浓度为70wt％的甲醇溶液中添加有质量浓度为0.02wt％的三氟乙酸。
经hplc-uv/dad检测，本实施例制得的藻毒素浓缩液的纯度为90％。
由此可见，本发明提供的藻毒素的提取纯化方法以收获于野外的水华蓝藻的干粉为原料，来源简单、来源广，在提取藻毒素的同时，能够一定程度治理水华蓝藻的污染；此外，本发明提供的藻毒素的提取纯化方法效率高，投资少，安全性高，纯度高，对环境无污染；适于毫克级微囊藻毒素的制备，易于工业化生产，所得微囊藻毒素的纯度经hplc-uv/dad检测≥90％，可做标准样品。