南方红豆杉的鉴定的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及用于鉴定南方红豆杉的snp分子标记及其应用。

背景技术：

南方红豆杉，学名：taxuswallichianavar.mairei，为裸子植物门(gymnospermae)，红豆杉科(taxaceae)，红豆杉属(taxus)，主要分布于长江流域以南各省区。南方红豆杉是珍贵的观赏、药用及用材树种，是国家一级重点保护植物。据《本草纲目》记载，其性辛、味甘、大温、归胃、肝经，具有解毒、散结、止痛等功效。现代研究表明，南方红豆杉枝叶中含有紫杉醇等数种抗肿瘤活性物质。形态学鉴定是南方红豆杉鉴定中常采用的方法，但形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。

近年来，利用分子生物学技术进行物种鉴定已经在一些珍惜物种及检验检疫方面得到了应用，如何利用分子生物学技术建立高效、快速、灵敏且准确度高的鉴定方法将是南方红豆杉鉴定领域的关键技术之一。

技术实现要素：

本发明第一个目的是提供一种用于鉴定南方红豆杉的snp分子标记，该snp分子标记为seqidno.1所示序列的第位57碱基为t，若第57为碱基为t则鉴定为南方红豆杉。

本发明的第二个目的是将上述snp分子标记在应用于南方红豆杉的鉴定。

本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定南方红豆杉的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括seqidno.1，或者seqidno.1所对应的cdna或mrna，所述seqidno.1序列的第57位碱基为t。

本发明的第四个目的是提供一种包含对应于seqidno.1序列至少10个连续核苷酸并且包含所述序列的第57位碱基为t的探针。

更具体的说，所述探针序列选自seqidno.6所示序列。

本发明的第五个目的是提供一种鉴定南方红豆杉的试剂盒，包括用于检测seqidno.1或包含有seqidno.1序列的核苷酸的反应体系，所述反应体系包含用于特异性地检测seqidno.1序列第57位碱基为t的存在与否的一种或多种引物和/或探针。

所述试剂盒的反应体系体可选择荧光pcr反应体系或测序反应体系。

所述引物或探针可选自seqidno.2至6中定义的引物或探针。

所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和空白对照。在一个具体的实例中，以南方红豆杉叶片dna为阳性对照，东北红豆杉叶片dna为阴性对照，灭菌双蒸水为空白对照。

本发明的第六个目的是提供一种鉴定南方红豆杉试剂盒的制备方法，包括制备反应体系的步骤，所述反应体系包含用于特异性地检测seqidno.1序列第57位碱基为t的存在与否的一种或多种引物和/或探针。

本发明还提供了一种鉴定南方红豆杉的方法，包括提取待测植物dna和pcr反应步骤，进一步的包括检测seqidno.1序列第57位碱基为t的存在与否的步骤。

检测seqidno.1序列第57位碱基为t的存在与否的步骤可采用荧光pcr反应步骤或测序反应步骤。

上述snp分子标记及应用、以及用于鉴定南方红豆杉的核苷酸序列、探针、试剂盒、制备方法和检测方法，均可用于从南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉和东北红豆杉等近源树种中鉴定出南方红豆杉。

本发明建立了基于snp位点的分子生物学技术鉴定南方红豆杉的方法体系，能迅速将南方红豆杉与曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉和东北红豆杉等近源树种区分开，对于口岸物种检验工作及品种资源鉴别、种质资源保护具有重大意义。

附图说明

图1是南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉和东北红豆杉样品的序列比对图。

图2是南方红豆杉(taxusmaireisyhu)荧光pcr扩增曲线图。

图3是曼地亚红豆杉荧光pcr扩增曲线图。

图4是欧洲红豆杉荧光pcr扩增曲线图。

图5是西藏红豆杉荧光pcr扩增曲线图。

图6是东北红豆杉荧光pcr扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明，这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。

以下实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(newyork:goldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1南方红豆杉snp分子标记的获得

rdna上的5.8、18和28srrna基因有极大的保守性,即存在着广泛的异种同源性。而由于its区不加入成熟核糖体,所以its片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小，因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性,即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在its序列上表现出差异,显示最近的进化特征。这种特点使its适合于物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的系统发育关系分析。由于its的序列分析能实质性地反映出属间、种间的碱基对差异,此外its序列片段较小、易于分析,目前已被广泛应用于不同种间或近似属间的系统发育研究中。

1、根据ncbi数据库公开的its基因，设计相应的引物进行pcr扩增，采用上游引物(its)：上游引物5’-gcggtaggatcattgtcg-3’(seqidno.2)；下游引物(its)5’-tcctccgcttattgatatgc-3(seqidno.3)和如下的pcr反应体系和pcr反应程序，以经鉴定的南方红豆杉(taxuswallichianavar.mairei)、曼地亚红豆杉(taxusmadia)、欧洲红豆杉(taxusbaccata)、西藏红豆杉(taxuswallichianazucc.)和东北红豆杉(taxuscuspidatas.etz.)5个红豆杉属物种基因组dna为模板，进行pcr扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并在紫外凝胶成像系统观察合格后进行测序。

其中，vazymeacetaqdna酶(货号p401-d1250u)。

所述红豆杉属物种基因组dna的提取采用杭州百迈生物股份有限公司的植物基因组dna提取试剂盒(koing^tm通用型基因组提取试剂盒，货号f1612)，参照试剂盒说明进行操作，将提取的dna置于-20℃下保存备用。

2、序列比对及物种特异的分子标记的开发

将步骤1获得的5个红豆杉属物种的its基因序列，通过dnaman软件进行序列比对寻找合适的snp位点。序列比对结果如图1所示，经分析发现位于南方红豆杉its基因内的seqidno.1所示序列第57位上的碱基为t，而其它红豆杉属物种为g。即seqidno.1所示序列的第57位上的碱基为t是南方红豆杉的snp位点(序列中方框所示位置)，seqidno.1基因序列为：

ataacactcaacgcatcggtgcggattgcaccaaggatctgataaatagctcgactctcggcaacgg

实施例2南方红豆杉snp分子标记在荧光pcr扩增法鉴定南方红豆杉中的应用

本实施例是在获得南方红豆杉snp位点的基础上，针对包含所述snp位点的基因序列，利用primerpremier5.0分别设计出特异性上游引物f、下游引物r和探针，引物和探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。利用所述特异性引物和探针对南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉和东北红豆杉进行荧光pcr扩增检测。具体的，所述上游引物f、下游引物r和探针分别是：

上游引物f：5’-gattgcaccaaggatctg-3’(seqidno.4)

下游引物r：5’-cgctacattcttcatcgt-3’(seqidno.5)

探针：5’-atagctgtgcgtgctgcgcg-3’(seqidno.6)

在一个具体实例中，探针5’端标记fam报告荧光染料，3’端标记bhq1淬灭荧光染料。

以5个红豆杉属物种基因组dna为模板，20μlpcr反应体系中包括：

反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整，也可用市售实时荧光pcr检测试剂盒进行体系配制，反应体系参照说明书进行。

pcr扩增程序：

包括以下步骤：1)提取待测植物的基因组dna；2)以待测植物的基因组dna为模板，利用引物和探针，pcr扩增南方红豆杉its基因；3)采用荧光pcr法检测pcr扩增产物，扩增曲线有标准的s型曲线，且ct≤36，则待测植物为南方红豆杉物种。并且以南方红豆杉叶片dna为阳性对照，东北红豆杉叶片dna为阴性对照，灭菌双蒸水为空白对照。

当分子生物学检测的阴性、阳性、空白对照试验结果正常，被检测样品有明显的荧光增幅现象，则判断样品为南方红豆杉。

本实施例2采用的南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉和东北红豆杉样品也是经现有方法鉴定不同与实施例1的另一组样品，按本发明所述方法对样品进行荧光pcr法检测，检测结果如图2至6所示，仅南方红豆杉出现s型曲线，且ct≤36,而其他红豆杉类没有出现s型曲线。并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常。这表明本发明针对南方红豆杉its基因snp位点具有极高的特异性，因此可以用于快速鉴定南方红豆杉。

序列表

<110>杭州百迈生物股份有限公司

浙江省检验检疫科学技术研究院

<120>南方红豆杉的鉴定

<130>201702

<150>2017108138390

<151>2017-09-11

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>117

<212>dna

<213>南方红豆杉(taxuswallichianavar.mairei)

<400>1

ataacactcaacgcatcggtgcggattgcaccaaggatctgataaatagctgtgcgtgct60

gcgcgccatgcgcgcgtcggactcacggcgccaattaaacacgactctcggcaacgg117

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcggtaggatcattgtcg18

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcctccgcttattgatatgc20

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gattgcaccaaggatctg18

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgctacattcttcatcgt18

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

atagctgtgcgtgctgcgcg20