本发明属于基因工程领域，具体涉及一种马铃薯gata转录因子及其克隆方法与应用。
背景技术：
：马铃薯(solanumtuberosuml.)是茄科(solanaceac)茄属(solanum)多年生草本块茎植物，是世界上种植和食用国家最多的作物，也是全球农业中继水稻、小麦和玉米之后的第四大作物。马铃薯作为主要的粮菜兼用型作物，在农业生产中占据重要地位。随着马铃薯在农业生产和农业经济中的地位更加重要，马铃薯的品种改良，产量提高是目前育种工作的重要目标。马铃薯块茎发育是一个复杂的生物学过程，并受内源以及外界因素的共同调控。外部因素包括光照、温度、氮水平等；内部因素包括光敏色素、转录因子、植物激素等。bachem等通过对马铃薯块茎膨大各个阶段的cdna扩增片断长度多态性分析，发现多种基因在块茎膨大中发挥作用。柳俊采用差异显示技术对试管块茎诱导前后基因转录情况进行了初步分析，发现块茎诱导前后有多个转录产物表现出差异。这些结果证明，块茎形成及发育涉及到一系列基因的连续表达，这些基因可能在块茎诱导的不同阶段起不同的调控作用，包括调节内源激素的平衡状态、细胞的生长和发育、块茎内含物的积累等。gata转录因子是一类广泛存在于真核植物中的转录因子，gata转录因子具有锌指结构，是锌指蛋白家族的成员之一，可以识别和特异性结合dna序列。在调控植物开花时间、叶片伸展生长、花的发育以及光周期和光信号转导等生物学过程中发挥重要作用，这些生物学过程与植物生长发育息息相关。gata类转录因子在植物的次生代谢中的作用，主要体现在叶绿素合成和碳、氮代谢调节等过程，这些生物学过程与作物产量息息相关，对gata家族的研究可以为作物增产提供一定的理论基础。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种马铃薯gata转录因子，包括如序列表seqno.1所示的核苷酸序列。优选地，本发明所述的马铃薯gata转录因子中，所述马铃薯gata转录因子编码的蛋白具有如序列表seqno.2所示的氨基酸序列。优选地，本发明所述的马铃薯gata转录因子中，所述马铃薯gata转录因子为通过pcr方法提取的。本发明的另一目的在于提供克隆马铃薯gata转录因子的引物，所述pcr的引物分别具有如序列表seqno.3～seqno.6所示的核苷酸序列：tmf:5’-agcgaactctgcgttccgtttgatgacttggctgagc-3’(seqno.3)tmr:5’-gctcagccaagtcatcaaacggaacgcagagttcgct-3’(seqno.4)tf:5’-agaggtaataaaagatgctt-3’(seqno.5)tr:5’-ttaaaatgaatctataaatta-3’(seqno.6)本发明的又一目的在于提供马铃薯gata转录因子的克隆方法，包括以下步骤：1)克隆马铃薯gata转录因子基因；2)构建包括马铃薯gata转录因子基因的表达载体；3)利用所述的表达载体转化农杆菌；4)使用转化的农杆菌转染马铃薯切片，诱导再生后筛选阳性马铃薯株系，将获得的阳性株系转入生根培养基获得转基因马铃薯阳性株。优选地，本发明所述的马铃薯gata转录因子的克隆方法中，所述步骤1)为：提取马铃薯总rna，使用试剂盒将mrna反转录为总cdna，分别使用分别具有如序列表seqno.3～seqno.7所示的核苷酸序列的引物进行pcr扩增，将扩增后的产物等体积混匀后作为模板，以seqno.6、seqno.7为引物进行扩增，扩增产物为马铃薯gata转录因子基因；优选地，本发明所述的马铃薯gata转录因子的克隆方法中，所述步骤2)为：将步骤1)获得的马铃薯gata转录因子基因，克隆到pmd-18t载体，使用大肠杆菌筛选阳性克隆；在扩增的马铃薯gata转录因子基因的引物两侧分别加上ndei/xbai酶切位点，以马铃薯rna为模板进行pcr扩增，并将扩增产物克隆至pmd-18t载体，，获得阳性菌株后提取质粒dna，利用ndei/xbai双酶切带有目的基因全长的质粒dna，同时以ndei/xbai双酶切植物表达载体，将各自的酶切产物回收后以1:2的质量比例混合，连接酶连接处理后，转化大肠杆菌dh5α感受态筛选阳性克隆，获得重组表达载体；优选地，本发明所述的马铃薯gata转录因子的克隆方法中，所述步骤3)为：利用步骤2)包括构建的表达载体的重组质粒转化农杆菌，筛选转化的阳性农杆菌；优选地，本发明所述的马铃薯gata转录因子的克隆方法中，所述步骤4)为：将阳性农杆菌在液体培养基中培养，浸染转化马铃薯外植体，将所述马铃薯外植体在含kan筛选的分化培养基培养后，转入生根培养基中诱导生根，完成马铃薯植株的再生，并鉴定阳性植株即得。因此，本发明还提供了上述方法获得的马铃薯转基因植株的非繁殖部分。通过本发明的后续实施例所证明，将筛选出的阳性株系和对照株系进行培养，结果发现，转基因阳性株系表现薯块增大、叶绿素含量增加及淀粉含量增加等优良性状，与对照相比差异显著。附图说明图1为马铃薯gata转录因子编码的蛋白与其他植物亲缘关系示意图；图2为马铃薯gata转录因子转基因样品pcr检测图；图3为本发明的一个实施例中的y5-ck和y5-6培养20天后对比图；图4为本发明的一个实施例中的转基因株系试管薯图。具体实施方式本发明克隆的基因被命名为stgata12，可以通过农杆菌介导的遗传转化方法或其他转基因方法把基因转入植物中，通过筛选鉴定获得的转基因植株或株系均属于本发明的保护范围。本发明通过在马铃薯体内超量表达该基因可以提前马铃薯块茎的熟期，提高马铃薯产量，其在增加淀粉含量及抗逆方面的应用均属于本发明保护的范围。下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1马铃薯gata转录因子stgata12基因克隆本发明利用overlappcr技术从马铃薯栽培品种‘陇薯3号’中分离克隆了马铃薯gata转录因子stgata12，tmf:5’-agcgaactctgcgttccgtttgatgacttggctgagc-3’tmr:5’-gctcagccaagtcatcaaacggaacgcagagttcgct-3’tf:agaggtaataaaagatgctttr:ttaaaatgaatctataaatta扩增方法为：先用试剂盒抽提马铃薯叶片总rna，具体过程参见说明书，然后用反转录试剂盒(购自天根公司)将mrna反转录为总cdna具体过程参见说明书，再以此为模板分别用tf、tmr和tmf、tr为引物进行pcr扩增，将扩增后的产物等体积混匀后作为模板，以tf和tr为引物进行扩增，扩增产物为stgata12基因全长，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带后，用胶回收试剂盒(购自天根公司)回收目标条带，克隆到pmd-18t载体(购自takara公司)，取5ul连接产物热击转化大肠杆菌dh5α感受态，涂布于新配置的含有氨苄青霉素/异丙基-β-d-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-d-半乳糖苷(amp/iptg/x-gal)的lb固体平板上，37℃培养过夜，挑选白斑若干，于含有amp50mg/l的液体lb培养基中，于37℃180r/min振荡培养过夜至浑浊，用tf和tr引物进行检测，检测菌液是否为阳性，送三个阳性克隆至上海生工生物技术公司完成测序工作。测序结果显示，该基因序列含有一个全长为1407bp的开放阅读框，编码一个由436个氨基酸残基构成，分子量为53417.2da，理论等电点为7.09的蛋白，含有c-x2-c-x18-c-x2-c锌指结构域。该蛋白与其他植物的亲缘关系见附图1。实施例2马铃薯gata转录因子stgata12基因的.表达载体构建在扩增的stgata12基因的引物两侧分别加上ndei/xbai酶切位点，以已构建的pmd-18t载体为模板进行pcr扩增，并将扩增产物克隆至pmd-18t载体，具体步骤见本发明的stgata12基因克隆部分。获得阳性菌株后提前质粒dna，利用ndei/xbai双酶切带有目的基因全长的质粒dna，同时以ndei/xbai双酶切植物表达载体pcambia1302，各自的酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒(购自天根公司)回收目标条带，并将目的基因片段与pcambia1302载体片段以1:2的比例混合，加入t4dna连接酶(购自promga公司)1u，1×反应缓冲液，无菌水补充支10ul提现，4℃连接过夜，取5ul连接产物进行热击转化大肠杆菌dh5α感受态，涂布于含有卡那霉素(km)50mg/l抗性平皿上筛选阳性克隆并酶切检测，结果见图2，其中1.marker，2.阳性对照，3.阴性对照，4-16.转基因抗性株系，由图2可见符合酶切预期片段大小。对获得的重组质粒利用热击转化法转化农杆菌gv3101，用含有利福平(rif)100mg/l，卡那(km)50mg/l的lb固体抗性平皿筛选转化阳性斑，挑取若干个阳性斑于含利福平(rif)100mg/l，卡那(km)50mg/l的lb液体培养基中28℃，180r/min培养过夜，取1ul做模板进行重组质粒的pcr检测，确认为阳性的菌株保存用于后续的遗传转化。实施例2马铃薯gata转录因子stgata12基因的遗传转化挑取单菌落接种于含50mg·l-1kan的50mllb液体培养基中，恒温摇床28℃，180rpm振荡培养24h后，用于浸染转化。将无菌试管薯切成1-2mm左右的薄片，浸入农杆菌菌液中浸染15min。取出后，无菌滤纸吸干菌液转入铺有2-3层滤纸的共培养基(ms+0.45％琼脂+3％蔗糖)中，进行48h的黑暗培养。暗培养后用500mg·l-1的cef无菌水清洗试管薯薄片3-4次，无菌水清洗2-3次，清洗过程中轻轻晃动使其清洗充分，后用无菌滤纸充分吸干外植体表面的水分，将其转移到含kan筛选的培养基(ms基础+0.45％琼脂+3％蔗糖+naa0.2mg/ml+400mg/lcef+50mg/lkm,ph5.8)中，置于光照强度2000lux,光周期8h/d，温度24℃的条件下培养直到抗性芽再生。待抗性芽分化至2-4cm时转入生根培养基中(ms基础+0.45％琼脂+3％蔗糖+naa0.2mg/ml+50mg/lkm+200mg/lcef,ph5.8)诱导生根，从而完成马铃薯植株的再生。提取再生株系dna，设计引物，以再生株系dna为模板进行pcr扩增，鉴定阳性株系。将筛选出的阳性株系和对照株系y5-ck为对照转入生根培养基中，置于光照强度2000lux、光周期8h/d，和试管薯诱导培养基(ms基础+0.45％琼脂+8％蔗糖+3mg/l6-ba)中，结果发现，如表1～表3所示转基因阳性株系y5-5、y5-9、y5-11表现出薯块增大、叶绿素含量增加及淀粉含量增加等优良性状，与对照相比，y5-6、y5-9、y5-12三个株系差异显著。其中，如图3所示，y5-ck和y5-6培养20天后对比图片(y5-ck为对照)，可知阳性植株明显长势；采用碘显色法测定马铃薯试管薯块茎淀粉含量，利用比色法检测马铃薯叶片叶绿素含量，并测量试管薯单薯重量。如图4所示，转基因阳性株系的单薯大小与重量明显高于对照株系的薯块单薯重量。表1转基因阳性株系与对照株系的薯块淀粉含量编号淀粉含量mg/gy5-ck45.423y5-567.188y5-1165.916y5-657.451y5-955.216y5-1247.261表2转基因阳性株系与对照株系的叶绿素含量比较编号叶绿素含量mg/gy5-50.217y5-60.368y5-70.360y5-90.222y5-110.285y5-120.256y5-ck0.204表3转基因阳性株系与对照株系的薯块单薯重量(60天收获)均为试管薯以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>宁夏农林科学院农业生物技术研究中心<120>一种马铃薯gata转录因子及其克隆方法与应用<130>阿斯达<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1427<212>dna<213>solanumtuberosum<400>1agaggtaataaaagatgctttaaaataataataaaaatggtgaggtgtaattacgagaaa60gaccttcattacacttatgaaaaggcctctgacccggaccccttactttcagcttttgag120cacttgtctgtcctcttcacactcaatgccttcattctctcttcctttttctcagcctcc180gattctccttataaagaattagtctcaaacctaccgttactttgcgttttacactccacc240attcttacactacacaccaacaacttcttcttcttttttctaacaatggaagcatcggat300ttattccttagcggctttttctcacatgccggagacgaacaaattccgaataacatcaac360aacaacatcaataataataactgtaacaatttttctgtggatgatcttttggttatccct420aaggaagatgaagttatggccgacgcatttttcaacagtattacaggaaattctgctgat480tcttccaccgttaccgtcgttgacagctgtaattcctctgtttctggtggagatggacaa540tttaacggcaacctcagcggccgcagcttcaccgatgctcccttccctaacagcgaactc600tgcgttccgtttgatgacttggctgagcatgaatggctctcaaattttgtggaggaatca660ttctcaagtgacgccgttcaaaacctgcagttcatccctgtagcaaacattaattcctcc720accatctccaccgacagttcctcctccgcaaccacattttccacaggacccaactcgcca780cctgccttccccaccgacacctctgttcctggcaaagctcgcagcaagcgctcacgcgcc840gctccctgtgactggtcctcacgcctccagctgctcttatcccctgccacatcatcatca900gagagcaacaacatctcgcctccatctgctaacaacactactttcgccacggccaaagcc960accaaagcgccgtcgaagaagcgagagagtgtggaaacgccgggacggaaatgcctgcac1020tgtgcttctgataagacaccacagtggcgcacagggccattaggtccaaaaactctgtgc1080aatgcatgtggagttaggtacaagtcaggtaggcttgtgccggagtatcgaccggcgtct1140agcccgacttttatctcagcgaggcactcgaattctcatcggaaagttctggagctccgg1200aggcaaaaggatctccagagacaccaagcacatcaccagcatcaattgcttagtcaaccc1260acaattttcggtgtatcaaatggtggtgatgaattcctgcttcatcatcaccaaaattgt1320ggtccaaatttcaggcacctcatctagtatcagtcacctagtgtaggggataactacttt1380gcacttttctcgttttaaaaaagtttgaattaacaatcccattttcc1427<210>2<211>448<212>prt<213>solanumtuberosum<400>2argglyasnlysargcysphelysileileilelysmetvalargcys151015asntyrglulysaspleuhistyrthrtyrglulysalaserasppro202530aspproleuleuseralaphegluhisleuservalleuphethrleu354045asnalapheileleuserserphepheseralaseraspserprotyr505560lysgluleuvalserasnleuproleuleucysvalleuhisserthr65707580ileleuthrleuhisthrasnasnphephephephepheleuthrmet859095glualaseraspleupheleuserglyphepheserhisalaglyasp100105110gluglnileproasnasnileasnasnasnileasnasnasnasncys115120125asnasnpheservalaspaspleuleuvalileprolysgluaspglu130135140valmetalaaspalaphepheasnserilethrglyasnseralaasp145150155160serserthrvalthrvalvalaspsercysasnserservalsergly165170175glyaspglyglnpheasnglyasnleuserglyargserphethrasp180185190alapropheproasnsergluleucysvalpropheaspaspleuala195200205gluhisglutrpleuserasnphevalglugluserpheserserasp210215220alavalglnasnleuglnpheileprovalalaasnileasnserser225230235240thrileserthraspserserserseralathrthrpheserthrgly245250255proasnserproproalapheprothraspthrservalproglylys260265270alaargserlysargserargalaalaprocysasptrpserserarg275280285leuglnleuleuleuserproalathrsersersergluserasnasn290295300ileserproproseralaasnasnthrthrphealathralalysala305310315320thrlysalaproserlyslysarggluservalgluthrproglyarg325330335lyscysleuhiscysalaserasplysthrproglntrpargthrgly340345350proleuglyprolysthrleucysasnalacysglyvalargtyrlys355360365serglyargleuvalproglutyrargproalaserserprothrphe370375380ileseralaarghisserasnserhisarglysvalleugluleuarg385390395400argglnlysaspleuglnarghisglnalahishisglnhisglnleu405410415leuserglnprothrilepheglyvalserasnglyglyaspgluphe420425430leuleuhishishisglnasncysglyproasnphearghisleuile435440445<210>3<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3agcgaactctgcgttccgtttgatgacttggctgagc37<210>4<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gctcagccaagtcatcaaacggaacgcagagttcgct37<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agaggtaataaaagatgctt20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ttaaaatgaatctataaatta21当前第1页12