靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法与流程

本发明涉及基因改造技术领域，特别涉及一种靶向敲除atxn3基因中扩展突变型polyq序列的方法。

背景技术

多聚谷氨酰胺类(polyglutamine，polyq)疾病是一组常见的神经退行性疾病，它是由各自致病基因编码区cag异常重复扩增并编码多聚谷氨酰胺肽链而致病。目前已经发现包括亨廷顿病、脊髓延髓肌萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩及脊髓小脑共济失调1型(spinocerebellarataxia，sca1)、sca2、sca3、sca6、sca7及sca17在内的9种多聚谷氨酰胺疾病。polyq疾病患者多为成年起病，主要表现为进展性的神经系统功能障碍，除脊髓延髓肌萎缩症外，其余8种polyq疾病的发病年龄及病情的严重程度与cag重复扩增的长度相关。其中sca3是发病率最高的显性遗传性脊髓小脑共济失调，其致病基因atxn3基因中10号外显子区的cag重复数由正常的12-44突变到52-86导致了编码的atxn3蛋白羧基端多聚谷氨酰胺链异常扩展以及蛋白质的异常聚集，引起细胞功能障碍，从而引起神经毒性而致病。迄今为止，针对此类疾病的研究从未停止，但是具体的发病机制仍然知之甚少，有效的治疗手段也仅仅是对症治疗。

传统技术一般针对编码区增多的cag重复数进行干预。例如，采用rna干扰，外显子跳跃等技术去减少病变型atxn3基因的表达，从而缓解疾病表型，但是这些方法有所局限如特异性不高，表达不恒定等。还有传统技术采用反义寡核苷酸链沉默过度增长的polyq序列或者外显子跳跃掉包含polyq序列的10号外显子，从而达到在细胞或动物模型中缓解疾病表型的目的，但是这些方法存在如下问题：目的序列针对性不够高，容易对非atxn3基因中目的序列造成非特异性的干扰；干扰效果不持久，需要合适的浓度和次数才能达到一定的干扰效果。

技术实现要素：

基于此，有必要研发一种特异性高、干扰持久并且对atxn3基因的正常结构和功能不会造成破坏的靶向敲除atxn3基因中扩展突变型polyq序列的方法。

一种靶向敲除atxn3基因中扩展突变型polyq序列的方法，包括向含有扩展突变型polyq序列的细胞中转染入含有第一向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒，以及含有第二向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒；其中：

所述第一向导rna能够通过碱基互补配对靶向结合于atxn3基因9号内含子所含有的如下结构：5’-gnx-ngg-3’；

所述第二向导rna能够通过碱基互补配对靶向结合于所述atxn3基因10号外显子所含有的如下结构：5’-gnx-ngg-3’；

n代表a、t、c、g中的任一种；x为19或者20。

在其中一些实施例中，所述第一向导rna的序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述第二向导rna的序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

在其中一些实施例中，所述细胞为ipscs。

在其中一些实施例中，所述cas9质粒为px458。

在其中一些实施例中，所述转染中，含有第一向导rna的cas9质粒、含有第二向导rna的cas9质粒、细胞的比例为(4.8-5.2)μg∶(4.8-5.2)μg∶(0.5-1.5)×10⁶个。

用于靶向敲除atxn3基因中扩展突变型polyq序列的向导rna，包括第一向导rna、第二向导rna；

所述第一向导rna能够通过碱基互补配对靶向结合于atxn3基因9号内含子所含有的如下结构：5’-gnx-ngg-3’；

所述第二向导rna能够通过碱基互补配对靶向结合于所述atxn3基因10号外显子所含有的如下结构：5’-gnx-ngg-3’；

n代表a、t、c、g中的任一种；x为19或者20。

在其中一些实施例中，所述第一向导rna的序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述第二向导rna的序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

用于靶向敲除atxn3基因中扩展突变型polyq序列的融合质粒，包括上述的含有第一向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒，以及含上述的第二向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒。

与现有技术相比，本申请具备如下有益效果：

发明人经过长期的实验和研究，结合atxn3基因的特性，针对atxn3基因的9号内含子、10号外显子分别设计具有非常好靶向性的向导rna，特别是seqidno.1和seqidno.2所示的第一向导rna、如seqidno.3和seqidno.4所示的第二向导rna，第一向导rna能够特异性地通过碱基互补配对与9号内含子所含序列结合并与cas9核酸酶的共同作用下于扩展突变型polyq序列的上游形成第一双链切口，第二向导rna能够特异性地通过碱基互补配对与10号外显子所含序列结合并与cas9核酸酶的共同作用下于扩展突变型polyq序列的下游形成第二双链切口，第一双链切口与第二双链切口之间的区域被切除，最后再通过细胞自身的dna修复功能，可一次性完成扩展突变型polyq序列的敲除；不会对非atxn3基因中目的序列造成非特异性的干扰，也还不破坏atxn3基因中功能片段的结构，确保最终细胞的生物功能(例如增殖能力、分化能力等)不受影响；本发明属于对atxn3基因扩展突变型polyq序列的永久性干扰，能够彻底去除polyq序列，效果稳定，所得细胞传代10代后分子表型与理论预期结果保持一致。

附图说明

图1是围绕人atxn3基因cag序列设计的grna1和grna2序列并进行目的切割的示意图；

图2是验证grna1和grna2切割效率和脱靶效应结果图。

图3是验证筛选到的目的克隆结果图。

图4是筛选到的目的克隆干细胞多能性和分化能力的验证结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的靶向敲除atxn3基因中扩展突变型polyq序列的方法作进一步详细的说明。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

步骤1、获取sca3病人来源的ipscs

知情告知并签署知情同意书后，抽取sca3病人外周血并分离单个核细胞，取约1.5×10⁵细胞，对应cytotune2.0重编程试剂盒(lifetechnologies)中相应试剂诱导生成ipscs，计作sca3-ipscs。

步骤2、制备含有第一向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒以及含有第二向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒

(1)设计向导rna

于述atxn3基因的9号内含子定位筛选5’-gnx-ngg-3’(n代表a、t、c、g中的任一种；x为19或者20)结构，并针对该结构设计能够通过碱基互补配对与之靶向性结合的第一向导rna(计作grna1)，序列如下：

grna1f(seqidno.1)：5’-caccgttatgaatagtttttctca-3’(9号内含子含有该自5’第六个碱基至第二十四个碱基所示的序列结构)，

grna1r(seqidno.2)：5’-aaactgagaaaaactattcataac-3’；

于述atxn3基因的10号外含子定位筛选5’-gnx-ngg-3’(n代表a、t、c、g中的任一种；x为19或者20)结构，并针对性地设计与上述结构能够通过碱基互补配对靶向性结合的第二向导rna(计作grna2)，序列如下：

grna2f(seqidno.3)：5’-caccgatgtgaactctgtcctgat-3’(10号外显子含有该序列中自5’第五个碱基至第二十四个碱基所示的序列结构)，

grna2r(seqidno.4)：5’-aaacatcaggacagagttcacatc-3’。

grna1和grna2的作用示意图见图1。

(2)构建融合质粒

将10μm的grna1f、10μm的grna1r混匀，98℃加热10min，自然冷却至室温，得到含粘性末端且为双链dna的grna1，再采用t4dna连接酶(takara公司)通过连接反应连入与已经用内切酶bbsi(abcam公司)处理过的包含cas9酶的px458质粒中，得到含有第一向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒；

将10μm的grna2f、10μm的grna2r混匀，98℃加热10min，自然冷却至室温，得到含粘性末端且为双链dna的grna2，再采用t4dna连接酶(takara公司)通过连接反应连入与已经用内切酶bbsi(abcam公司)处理过的包含cas9酶的px458质粒中，得到含有第二向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒。

(3)验证融合质粒的靶向性

采用常规技术手段，结合lip3000转染试剂盒(lifetechnologies)，用上述构建的含有第一向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒、含有第二向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒分别转染293t细胞，通过t7e1酶切方法检测各自的切割效率；其后利用http://crispr.mit.edu网站预测grna1/2的脱靶位点，再用t7e1法检测其他位点有无脱靶现象发生。

结果见图2，其中：图2a为在293t细胞中采用t7e1酶切法验证grna1、grna2的切割效率，可见两者都可以切割目的带形成子带；图2b为在生物信息分析的基础上预测的脱靶位点上，运用t7e1酶切法验证是否有脱靶情况发生，可见除了主带之外并无其他带，说明在这些序列类似区域没有脱靶情况发生。

步骤3、转染、筛选目的克隆

(1)转染：取对数生长期sca3-ipscs，用accutase酶消化成单细胞，取约为1×10⁶个细胞，加入5μg含有第一向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒和5μg含有第一向导rna、cas9核酸酶表达基因的质粒，运用neon电转系统，采用1200v，20ms×2的电转参数进行转染；

(2)筛选：

1)将细胞转移至含10μmrock酶抑制剂(优选y27632)的mtesr培养基中，于37℃、5％co2的条件下培养24小时，待转染细胞贴壁后更换为不含rock酶抑制剂的mtesr培养基继续培养24小时；

2)采用bdariaiii流式细胞仪分选收集转染后gfp⁺细胞继续培养，培养条件：将流式细胞仪分选收集的gfp⁺细胞种植于已包被至60mm的培养皿中培养，种植密度约5000个每皿；前三天采用包含10μmrock酶抑制剂的mtesr培养基于37℃，5％co2培养箱培养，从第四天开始采用不含rock酶抑制剂的mtesr培养基培养，每天换液，培养约十天后克隆即足够大；

3)挑选足够大的克隆，提取dna，分别进行pcr反应，pcr反应程序为：98℃预变性30秒，然后98℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟共35个循环，最后72℃延伸10分钟。分离pcr反应产物，琼脂糖凝胶电泳中显示突变位点缺失的条带对应的克隆即为同时转入第一向导rna的cas9质粒、含有第二向导rna的cas9质粒的克隆。

步骤4、验证目的克隆

(1)验证突变位点中cag序列是否已被彻底切割消除

挑取筛选的同时转入第一向导rna的cas9质粒、含有第二向导rna的cas9质粒的克隆，进行pcr反应，pcr反应程序为：98℃预变性30秒，然后98℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟共35个循环，最后72℃延伸10分钟；

分离pcr反应产物并切取琼脂糖凝胶电泳中显示突变位点缺失的pcr产物进行胶回收；

将回收到的片段连接到pmd19t载体上，经常规转化及挑取克隆，采用测序的方法验证目的克隆中是否polyq序列被切割消除且正常位点序列予以保留不变。

结果见图3，其中：图3a为pcr筛选结果，表示基因修饰后突变位点消失，代之为片段变小的位点；图3b则为切割后位点的sanger测序结果，表明突变位点中cag序列已被彻底切割消除；图3c为蛋白电泳结果，表示基因修饰后，polyq多肽已经不表达，类似于正常对照细胞。

(2)验证目的克隆干细胞多能性和分化能力

挑取后的目的克隆继续进行培养和分化，培养和分化采用的培养基均为市购培养基，培养条件参照说明书即可，其中：

1)ipscs增殖培养：采用基质胶，结合mtesr1培养基，于37℃，5％co2培养箱中进行培养；

2)ipscs向神经元定向分化培养：采用赛默飞世尔科技公司的psc神经诱导培养基，神经扩增培养基和包含无血清添加剂的神经元分化培养基进行分阶段诱导分化；

3)神经元培养：聚鸟氨酸和层粘连蛋白作为基质胶，结合神经元培养基于37℃，5％co2培养箱中培养30天左右，可获得较为成熟的神经元，用于后续实验及鉴定。

采用rna提取试剂盒(takara公司)提取增殖培养阶段的ipscsrna，并用逆转录试剂盒(takara公司)提取然后逆转录获得cdna，再进行oct4，nanog，lin28和sox2等多能性基因的pcr检测，验证其多能性有无保留。结果见图4，其图4a为rt-pcr结果，表明切割后目的克隆干细胞多能性基因仍表达。

取成熟的神经元，采用常规免疫荧光染色法进行鉴定检测，步骤如下：4％多聚甲醛固定30分钟，pbs液漂洗5分钟3次，孵育一抗过夜，pbs液漂洗10分钟3次，荧光二抗孵育1小时，pbs液漂洗5分钟3次，dapi液进行细胞核dna染色10分钟，pbs液漂洗5分钟1次后置于荧光显微镜进行观察；其中标记神经元marker的一抗为abcam公司的抗tubb3，map2和neun，浓度为1∶100。

结果见图4，图4b为免疫荧光染色结果，表明切割后目的克隆干细胞能够定向分化到神经元，其表达相应的神经元marker。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。