包含TNF家族配体三聚体和生腱蛋白结合模块的抗原结合分子的制作方法

本发明涉及新的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与生腱蛋白-c(tnc)特异性结合的抗原结合模块和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中所述抗原结合分子的特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且在于该第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。本发明进一步涉及生成这些分子的方法和使用它们的方法。发明背景与tnf(肿瘤坏死因子)受体超家族分子相互作用的配体在免疫系统的组织和功能中具有关键作用。在调节正常功能如免疫应答，造血和形态发生的同时，tnf家族配体(也称为细胞因子)在肿瘤发生，移植排斥，脓毒性休克，病毒复制，骨吸收，类风湿性关节炎和糖尿病中起作用(aggarwal，2003)。tnf配体家族包括编码19个ii型(即细胞内n端和细胞外c端)跨膜蛋白的18个基因，其特征在于构成“tnf同源域”(thd)的保守c端域的存在。这个域负责受体结合，因此对tnf配体家族成员的生物学活性至关重要。家族成员之间的序列同一性约为20％-30％(bodmer，2002)。tnf配体家族的成员以自组装非共价三聚体的形式而发挥其生物学功能(banneretal.,cell1993,73,431-445)。因此，tnf家族配体形成能够结合并激活tnfr超家族的相应受体的三聚体。tnf受体超家族成员4-1bb(cd137)首先被鉴定为其表达经由t细胞激活诱导的分子(kwon和weissman，1989)。随后的研究证实4-1bb在t和b淋巴细胞(snell等人，2011；zhang等人，2010)，nk细胞(lin等人，2008)，nkt-细胞(kim等人，2008)，单核细胞(kienzle和vonkempis，2000；schwarz等人，1995)，嗜中性粒细胞(heinisch等人，2000)，肥大细胞(nishimoto等人，2005)和树突细胞以及非造血来源的细胞如内皮细胞和平滑肌细胞(broll等人，2001；olofsson等人，2008)中表达。4-1bb在不同细胞类型中的表达大多可由各种刺激信号诱导和驱动，例如t细胞受体(tcr)或b细胞受体触发，以及通过共刺激分子或促炎细胞因子的受体诱导的信号传导(diehl等人，2002；vonkempis等人，1997；zhang等人，2010)。4-1bb配体(4-1bbl或cd137l)的表达受到更多限制，在专职抗原呈递细胞(apc)如b细胞，树突细胞(dc)和巨噬细胞上观察到表达。4-1bbl的诱导表达对于包括αβ和γδt细胞子集二者在内的t细胞以及内皮细胞是特征性的(综述见shao和schwarz，2011)。已知cd137信号传导刺激nk细胞的ifnγ分泌和增殖(buechele等人，2012；lin等人，2008；melero等人，1998)以及促进dc激活(表现为其存活和分泌细胞因子的能力增加)，并上调共刺激分子(choi等人，2009；futagawa等人，2002；wilcox等人，2002)。然而，cd137最好被表征为调节t细胞的cd4+和cd8+子集的tcr诱导性激活的共刺激分子。与tcr触发联合，激动性4-1bb特异性抗体增强t细胞的增殖，刺激淋巴因子分泌并降低t淋巴细胞对激活诱导的细胞死亡的敏感性(综述见snell等人，2011)。与4-1bb抗体对体外t细胞的这些共刺激效应一致，在许多实验性肿瘤模型中将其施用于荷瘤小鼠导致有效的抗肿瘤作用(melero等人，1997；narazaki等人，2010)。然而，4-1bb通常仅在与其它免疫调节化合物(curran等人，2011；guo等人，2013；morales-kastresana等人，2013；teng等人，2009年；wei等人，2013)，化疗药物(ju等人，2008；kim等人，2009)，肿瘤特异性疫苗接种(cuadros等人，2005；lee等人，2011)，或放射治疗(shi和siemann，2006)联合给予时才显示其作为抗肿瘤剂的效力。体内消耗实验证明，cd8+t细胞在4-1bb特异性抗体的抗肿瘤作用中起最关键的作用。然而，取决于肿瘤模型或包括抗4-1bb的联合疗法，已经报道了其它类型的细胞如dc，nk细胞或cd4+t细胞的作用(melero等人1997；murillo等人；2009；narazaki等人，2010；stagg等人，2011)。除了4-1bb激动剂对不同淋巴细胞子集的直接作用之外，通过4-1bb介导的细胞间粘附分子1(icam1)和肿瘤血管内皮上的血管细胞粘附分子1(vcam1)的上调，4-1bb激动剂还可以诱导肿瘤中激活t细胞的浸润和保留(palazon等人，2011)。4-1bb触发还可以逆转由暴露于可溶性抗原诱导的t细胞无反应性的状态，其可能有助于破坏肿瘤微环境中或慢性感染期间的免疫耐受性(wilcox等人，2004)。似乎4-1bb激动性抗体在体内的免疫调节特性需要在抗体分子上野生型fc部分的存在，由此提示fc-受体结合为此类试剂的药理学活性所需的重要事件，所述试剂被描述为对tnfr超家族的其它的细胞凋亡诱导或免疫调节成员特异的激动性抗体(li和ravetch，2011；teng等人，2009)。然而，在小鼠中，具有功能活性fc域的4-1bb特异性激动性抗体的全身给药也诱导了与肝毒性相关的cd8+t细胞扩充(dubrot等人，2010)，在不存在功能性fc受体的情况下，肝毒性减弱或显著减轻。在人类临床试验(clinicaltrials.gov，nct00309023)中，每三周施用一次的有fc活性的4-1bb激动性抗体(bms-663513)持续12周诱导了黑素瘤，卵巢癌或肾细胞癌患者的病情稳定。然而，在另一项试验(nct00612664)中给予的相同抗体引起4级肝炎，导致试验终止(simeone和ascierto，2012)。总的来说，可用的临床前和临床数据清楚地表明，有效的4-1bb激动剂的临床需求很高。然而，新一代候选药物不仅会有效地使4-1bb接合在造血细胞和内皮细胞的表面上，而且还能通过除了与fc受体结合之外的机制来实现这种接合，以避免不可控制的副作用。后者可以通过对肿瘤特异性或肿瘤相关模块的优先结合来实现。生腱蛋白是在脊椎动物中找到的，较大多聚体细胞外基质(ecm)糖蛋白的一个高度保守的家族。已经在哺乳动物中鉴定出四种生腱蛋白旁系同源物(paralogue)，称作生腱蛋白-c，生腱蛋白-r，生腱蛋白-x和生腱蛋白-w。生腱蛋白家族蛋白质具有共同的一级结构，其包含n端七段重复，表皮生长因子(egf)样重复，纤连蛋白iii型域重复和c端纤连蛋白样球状域。经由n段寡聚化域，亚基个体装配成三聚体，或在tnc的情况中，装配成六聚体。确实，tnc的寡聚化域据报告在与相应tnf受体配体融合时改善cd27l，cd40l，41bbl，和糖皮质激素诱导的tnf受体配体的三聚化(见wyzgoletal.,jimmunol.183(3),1851-61(2009)及bergetal.,celldeatchanddifferentiation14(12),2021-2034(2007)。这些研究使用tnc多肽链的片段来稳定tnc-tnf配体融合多肽中的活性三聚体形式的tnf配体。哺乳动物生腱蛋白-c(tnc)单体通常具有由所有生腱蛋白-c同等型共享的14.5个egf样重复和8个纤连蛋白iii型域重复。然而，通过可变剪接，能独立包括或排除多至9个另外的纤连蛋白iii型域重复(域a1至d)，产生多种生腱蛋白-c同等型(见例如hsiaandschwarzbauer,jbiolchem280,26641-26644(2005))。生腱蛋白-c在发育的胚胎中瞬时表达，但是在成年组织中实际上缺失。然而，它在经历重塑过程的组织中再现，包括某些病理状况，诸如伤口愈合，炎症和癌症(综述见chiquet-ehrismann&chiquet,jpathol200,488-499(2003))。重要的是，生腱蛋白-c在大多数恶性实体瘤中高度表达，包括脑，乳房/乳腺，结肠，肺，皮肤和其它器官的肿瘤(综述见orendandchiquet-ehrismann,cancerletters244,143-163(2006))，在那里它可以由转化的上皮细胞以及肿瘤微环境中的基质细胞表达(yoshidaetal.,jpathol182,421-428(1997),hanamuraetal.,intjcancer73,10-15(1997))。特别地，含有可变剪接域a1至d的生腱蛋白-c“较大同等型”在侵入性癌瘤中表达，而在健康成年组织中几乎检测不到(borsietal.,intjcancer52,688-692(1992)及carnemollaetal.,eurjbiochem205,561-567(1992))。发明概述仍然需要有活性的且安全的4-1bb激动剂。具有至少一个将本发明的分子靶向较宽范围的恶性的肿瘤细胞的tnc抗原结合模块和三聚体和因而生物学活性tnf配体的本发明的双特异性分子提供一种独特的靶向性工具来解决肿瘤细胞。本发明的抗原结合分子具有足够的稳定性成为制药学上有用的且能用于以升高的效率和安全性治疗不同癌症。在一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与生腱蛋白-c(tnc)特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且在于第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在一个特定方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且在于第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在又一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，(i)第一多肽含有ch1或cl域，第二多肽含有相应的cl或ch1域，其中第二多肽通过ch1和cl域之间的二硫键与第一多肽连接，且其中第一多肽包含通过肽接头与ch1或cl域且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的cl或ch1域连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者(ii)第一多肽含有ch3域，第二多肽含有相应的ch3域，且其中第一多肽包含通过肽接头与ch3域的c端且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，且其中第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽的ch3域的c端连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者(iii)第一多肽含有vh-cl或vl-ch1域，第二多肽含有相应的vl-ch1域或vh-cl域，其中第二多肽通过ch1和cl域之间的二硫键与第一多肽连接，且其中第一多肽包含通过肽接头与vh或vl且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的vl或vh连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在一个特定方面，tnf配体家族成员是共刺激人t细胞激活的成员。因此，该含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中tnf配体家族成员共刺激人t细胞激活。更特别地，tnf配体家族成员选自4-1bbl和ox40l。在一个方面，tnf配体家族成员是4-1bbl。在又一个方面，tnf配体家族成员的胞外域包含选自由seqidno:172，seqidno:173，seqidno:174，seqidno:175，seqidno:183，seqidno:192，seqidno:193和seqidno:194组成的组的氨基酸序列，特别是seqidno:172或seqidno:183的氨基酸序列。在另一个方面，tnf配体家族成员的胞外域或其片段包含选自由seqidno:172，seqidno:173，seqidno:174，seqidno:175和seqidno:183组成的组的氨基酸序列，特别是seqidno:172或seqidno:183的氨基酸序列。更特别地，tnf配体家族成员的胞外域包含seqidno:183的氨基酸序列。在又一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自由seqidno:176，seqidno:184，seqidno:185和seqidno:186组成的组的氨基酸序列，第二多肽包含选自由seqidno:172，seqidno:174，seqidno:175和seqidno:183组成的组的氨基酸序列。在一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含seqidno:176的氨基酸序列，第二多肽包含seqidno:177的氨基酸序列。在又一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含seqidno:176的氨基酸序列，第二多肽包含seqidno:187的氨基酸序列。在还有又一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含seqidno:184的氨基酸序列，第二多肽包含seqidno:188或seqidno:189的氨基酸序列。在另一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，(b)含有ch1或cl域的第一多肽和含有相应的cl或ch1域的第二多肽，其中第二多肽通过ch1和cl域之间的二硫键与第一多肽连接，且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头与ch1或cl域且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，第二多肽仅包含通过肽接头与所述多肽的cl或ch1域连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在一个方面，提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，(b)含有ch1域的第一多肽和含有cl域的第二多肽，其中第二多肽通过ch1和cl域之间的二硫键与第一多肽连接，且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头与ch1域且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的cl域连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在另一个方面，提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，(b)含有cl域的第一多肽和含有ch1域的第二多肽，其中第二多肽通过ch1和cl域之间的二硫键与第一多肽连接，且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头与cl域且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的ch1域连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc特异性结合的模块是抗体片段。特别地，能够与tnc特异性结合的模块是抗原结合模块。特别地，能够与tnc特异性结合的模块选自由抗体片段，fab分子，交换fab分子，单链fab分子，fv分子，scfv分子，单域抗体，avh和支架抗原结合蛋白组成的组。特别地，含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个或两个能够与tnc特异性结合的模块。在一个特定方面，本发明与如上定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子有关，其中能够与tnc特异性结合的模块是fab分子。在一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc抗原特异性结合的模块是支架抗原结合蛋白。本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含至少一个能够与tnc特异性结合的模块。在一个特定方面，该含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个能够与tnc特异性结合的模块。在另一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与tnc特异性结合的模块。在一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc特异性结合的模块包含vh域和vl域，所述vh域包含(i)包含seqidno:67或seqidno:70的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:68或seqidno:71的氨基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:69或seqidno:72的氨基酸序列的cdr-h3，所述vl域包含(iv)包含seqidno:55或seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:56或seqidno:59的氨基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:57或seqidno:60的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc特异性结合的模块包含vh域和vl域，所述vh域包含(i)包含seqidno:67的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:68的氨基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:69的氨基酸序列的cdr-h3，所述vl域包含(iv)包含seqidno:55的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:56的氨基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:57的氨基酸序列的cdr-l3。在另一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc特异性结合的模块包含vh域和vl域，所述vh域包含(i)包含seqidno:70的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:71的氨基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:72的氨基酸序列的cdr-h3，所述vl域包含(iv)包含seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:59的氨基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:60的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面，提供了如上文中定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc特异性结合的模块包含包括seqidno:46的氨基酸序列的可变重链和包括seqidno:45的氨基酸序列的可变轻链，或其中能够与tnc特异性结合的模块包含包括seqidno:48的氨基酸序列的可变重链和包括seqidno:47的氨基酸序列的可变轻链。在又一个方面，提供了依照本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其c端通过第二肽接头与重链的ch1或cl域融合，且其中所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段在其c端通过第三肽接头与轻链上的cl或ch1域融合。在一个特定方面，本发明涉及如上定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中肽接头是(g4s)2，即，具有seqidno:150的肽接头。在一个方面，第一肽接头为(g4s)2，第二肽接头为gspgssssgs(seqidno:153)，第三肽接头为(g4s)2。在另一个方面，第一，第二和第三肽接头均为(g4s)2。本发明进一步涉及如上文中定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。特别地，本发明的包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子进一步包含(a)能够与靶细胞抗原特异性结合的fab分子，其中fab重链在c端与fc域中的ch2域的n端融合。在又一个方面，fc域为igg，具体地为igg1fc域或igg4fc域。更特别地，fc域为igg1fc域。在一个特定方面，fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。在另一个方面，本发明涉及如前文中定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，其中fc域包含一个或多个降低与fc受体尤其是fcγ受体结合的氨基酸替代。特别地，fc域包含在igg重链的位置234和235(eu编号方式)和/或329(eu编号方式)处的氨基酸替代。更特别地，提供了依照本发明的含有三聚体tnf家族配体的抗原结合分子，其包含具有氨基酸替代l234a，l235a和p329g(eu编号方式)的igg1fc域。在又一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与tnc特异性结合的fab分子，第一肽，其包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第一肽在其c端通过第二肽接头与第二重链或轻链融合，和第二肽，其包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域，所述第二肽通过第三肽接头在其c端与相应的第二轻链或重链融合。在另一个方面，提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的ch1域融合，且包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的cl域融合。在还有另一个方面，提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的cl域融合，且包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的ch1域融合。在又一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的vh域融合，且包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的vl域融合。进一步提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在邻近tnf配体家族成员的cl域中，在位置123(eu编号方式)的氨基酸已替换为精氨酸(r)，在位置124(eu编号方式)的氨基酸已替代为赖氨酸(k)，且其中在邻近tnf配体家族成员的ch1域中，在位置147(eu编号方式)和在位置213(eu编号方式)的氨基酸已替代为谷氨酸(e)。在又一个方面，提供了如前文中描述的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：(a)第一重链和第一轻链，这两者构成能够与tnc特异性结合的fab分子，(b)第二重链和第二轻链，所述第二重链包含选自由seqidno:176，seqidno:184，seqidno:185和seqidno:186组成的组的氨基酸序列，所述第二轻链包含选自由seqidno:172，seqidno:174，seqidno:175和seqidno:183组成的组的氨基酸序列。在一个方面，提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：(i)包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域的第一轻链或包含包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域的第一轻链，(ii)包含seqidno:178的氨基酸序列的第二重链，和(iii)包含seqidno:179的氨基酸序列的第二轻链。在另一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：(i)包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域的第一轻链或包含包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域的第一轻链，(ii)包含选自由seqidno:102，seqidno:108，seqidno:116和seqidno:120组成的组的氨基酸序列的第二重链，和(iii)包含选自由seqidno:103，seqidno:109，seqidno:117和seqidno:121组成的组的氨基酸序列的第二轻链。在还有另一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有ch3域且第二多肽含有相应的ch3域，且其中第一多肽包含通过肽接头与ch3域的c端且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的ch3域的c端连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在又一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域的亚基之一的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域的另一亚基的c端且其中该包含tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽包含选自由seqidno:176和seqidno:184组成的组的氨基酸序列且该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽包含选自由seqidno:172和seqidno:183组成的组的氨基酸序列。在一个方面，该包含tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽包含seqidno:176的氨基酸序列且该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽包含seqidno:172的氨基酸序列。在一个特定方面，该包含tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽包含seqidno:184的氨基酸序列且该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽包含seqidno:183的氨基酸序列。在一个方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)一个能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域的亚基之一的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域的另一亚基的c端。本发明如此涉及含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子对于结合靶细胞抗原是单价的。在又一个方面，本发明提供如之前定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其进一步包含(d)不能与tnc特异性结合的fab域。如此，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域的亚基之一的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域的另一亚基的c端，和(d)不能与靶细胞抗原特异性结合的fab域。特别地，提供的是如本文中之前定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(i)包含seqidno:127的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:125的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链，或(ii)包含seqidno:130的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:131的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链，或(ii)包含seqidno:124的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:133的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链，或(ii)包含seqidno:136的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:137的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链。特别地，此类含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与tnc特异性结合的模块。在一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与tnc特异性结合的模块。特别地，提供了如前文中描述的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(i)包含seqidno:112的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:113的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的两条轻链，或(ii)包含seqidno:124的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:125的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的两条轻链。在一个方面，tnf配体家族成员是ox40l。在又一个方面，tnf配体家族成员的胞外域包含选自由seqidno:181或seqidno:182组成的组的氨基酸序列，尤其是seqidno:181的氨基酸序列。在又一个方面，提供了如前文中描述的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含seqidno:190或seqid:191的氨基酸序列，第二多肽包含seqidno:181或seqidno:182的氨基酸序列。在另一个方面，提供了如本文中描述的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是生腱蛋白-c(tnc)，且其中能够与tnc特异性结合的模块包含vh域和vl域，所述vh域包含(i)包含seqidno:67或seqidno:70的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:68或seqidno:71的氨基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:69或seqidno:72的氨基酸序列的cdr-h3，所述vl域包含(iv)包含seqidno:55或seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:56或seqidno:59的氨基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:57或seqidno:60的氨基酸序列的cdr-l3。特别地，提供了如本文中描述的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：(i)包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域的第一轻链或包含包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域的第一轻链，(ii)包含选自由seqidno:195组成的组的氨基酸序列的第二重链，和(iii)包含seqidno:196的氨基酸序列的第二轻链。依照本发明的另一个方面，提供了编码如前文中定义的抗原结合分子的分离的多核苷酸。本发明进一步提供了包含本发明的分离的多核苷酸的载体，尤其是表达载体，和包含本发明的分离的多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，尤其是哺乳动物细胞。在另一个方面，提供了产生本发明的抗原结合分子的方法，该方法包括以下步骤：(i)在适合于表达该抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞，及(ii)回收抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法产生的抗原结合分子。本发明进一步提供了包含本发明的抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明还涵盖用作药剂的本发明的抗原结合分子，或本发明的药物组合物。在一个方面，提供了用于治疗有需要的个体中的疾病的本发明的抗原结合分子，或本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，提供了用于治疗癌症的本发明的抗原结合分子，或本发明的药物组合物。还提供了本发明的抗原结合分子在制造用于治疗有需要的个体中的疾病的药剂尤其是制造用于治疗癌症的药剂中的用途，以及治疗个体疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的药学上可接受的形式的包含本发明的抗原结合分子的组合物。在具体的实施方案中，该疾病是癌症。在任何上述实施方案中，个体优选为哺乳动物，尤其是人。附图简述图1显示100倍放大倍数时ls174t异种移植物肿瘤中的免疫组织学染色，如用抗tnc克隆18d4(图1b)和抗tnc克隆11c7(图1c)染色的。染色样式对应于特定的tnc基质纤维。克隆18d4和11c7二者的tnc染色以中等强度总体表达。阴性同种型对照信号验证该技术的特异性(图1a)。图2显示人肿瘤阵列中用家兔同种型对照的免疫组织学染色的结果。测试的所有组织中的阴性同种型对照信号验证该技术的特异性。图3显示人肿瘤阵列中用抗tnc克隆18d4的免疫组织学染色的结果。染色样式对应于特定的tnc基质纤维。tnc染色在大多数肿瘤组织中以与对照正常配对组织相比更高的水平表达。图4显示人肿瘤阵列中用抗tnc克隆11c7的免疫组织学染色的结果。染色样式对应于特定的tnc基质纤维。tnc染色在大多数肿瘤组织中以与对照正常配对组织相比更高的水平表达。图5显示用于组装单价tnc靶向性分拆三聚体人4-1bb配体(71-254)(构建体6.1)的构件。a)与人igg1-cl域融合的二聚体配体。b)与人igg1-ch1域融合的单体配体。图6显示本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子构建体6.1(含有ch-cl交叉有带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)pglala融合物)。此构建体的制备和生成描述于实施例1.1。vh和vl域是抗tnc抗体18d4的那些，粗黑点代表节-入-穴修饰。*象征ch1和cl域中的氨基酸修饰(所谓的带电荷残基)。图7显示用于组装单价tnc靶向性分拆三聚体人4-1bb配体(71-254)(构建体6.2)的构件。a)显示与人igg1-cl域融合的二聚体配体。b)显示与人igg1-ch1域融合的单体配体。图8显示含有ch-cl交叉无带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物(构建体6.2)。此构建体的制备和生成描述于实施例1.2。vh和vl域是抗tnc抗体18d4的那些，粗黑点代表节-入-穴修饰。图9显示用于组装二价tnc靶向性分拆三聚体人4-1bb配体(71-254)(构建体6.3)的构件。a)显示与人igg1fc穴链融合的二聚体配体。b)显示与人igg1fc节链融合的单体配体。图10显示二价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc(kih)pglala融合物(构建体6.3)。此构建体的制备和生成描述于实施例1.3。vh和vl域是抗tnc抗体18d4的那些，粗黑点代表节-入-穴修饰。图11显示用于组装单价tnc靶向性分拆三聚体人4-1bb配体(71-248)(构建体6.4)的构件。a)显示与人igg1-cl域融合的二聚体配体。b)显示与人igg1-ch1域融合的单体配体。图12显示含有ch-cl交叉有带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.4)。此构建体的制备和生成描述于实施例1.4。vh和vl域是抗tnc抗体18d4的那些，粗黑点代表节-入-穴修饰。图13显示用于组装单价tnc靶向性分拆三聚体人4-1bb配体(71-248)(构建体6.5)的构件。a)显示与人igg1-cl域融合的二聚体配体。b)显示与人igg1-ch1域融合的单体配体。图14显示含有ch-cl交叉无带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.5)。此构建体的制备和生成描述于实施例1.5。vh和vl域是抗tnc抗体18d4的那些，粗黑点代表节-入-穴修饰。图15显示用于组装二价tnc靶向性分拆三聚体人4-1bb配体(71-248)(构建体6.6)的构件。a)显示与人igg1fc穴链融合的二聚体配体。b)显示与人igg1fc节链融合的单体配体。图16显示二价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.6)。此构建体的制备和生成描述于实施例1.6。vh和vl域是抗tnc抗体18d4的那些，粗黑点代表节-入-穴修饰。图17显示用于组装在人fc的c端融合的单价靶向性分拆三聚体人4-1bb配体的构件。a)显示与人igg1fc穴或节链融合的二聚体配体。b)显示与人igg1fc节或穴链融合的单体配体。图18显示单价靶向性分拆三聚体c端4-1bb配体fc(kih)节融合物。a)显示构建体6.11，与穴fc链融合的二聚体4-1bbl和与节fc链融合的单体4-1bbl。b)显示构建体6.12，与节fc链融合的二聚体4-1bbl和与穴fc链融合的单体4-1bbl。这些构建体的制备和生成描述于实施例1.7。vh和vl域是抗tnc抗体18d4的那些，粗黑点代表节-入-穴修饰。图19显示单价靶向性(穴链)分拆三聚体c端4-1bb配体fc(kih)融合。a)构建体6.13，与穴fc链融合的二聚体4-1bbl和与节fc链融合的单体4-1bbl。b)构建体6.14，与节fc链融合的二聚体4-1bbl和与穴fc链融合的单体4-1bbl。这些构建体的制备和生成描述于实施例1.8。vh和vl域是抗tnc抗体18d4的那些，粗黑点代表节-入-穴修饰。图20涉及靶向性分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合分子的同时结合。a)显示spr实验的设置。b)显示构建体6.5对人4-1bb和人tnc的同时结合。c)显示构建体6.6对人4-1bb和人tnc的同时结合。图21显示tnc靶向性4-1bb分拆三聚体配体fc融合抗原结合分子对新鲜分离的pbmc的结合。显示的是pe缀合的检测二抗的荧光强度的几何均值(y轴)对所测试的构建体的浓度(x轴)。在新鲜人cd45+cd3+cd8-cd4+t细胞(图21a)，新鲜人cd45+cd3+cd4-cd8+t细胞(图21b)，新鲜人cd45+cd3-cd19+b细胞(图21c)和cd45+cd3+cd4-cd8-γδt细胞(图21d)上监测结合。图22显示tnc靶向性4-1bb分拆三聚体配体fc融合抗原结合分子对激活的pbmc的结合。显示的是pe缀合的检测二抗的荧光强度的几何均值(y轴)对所测试的构建体的浓度(x轴)。在激活的人cd45+cd3+cd8-cd4+t细胞(图22a)，激活的人cd45+cd3+cd4-cd8+t细胞(图22b)，cd45+cd3-cd19+b细胞(图22c)和激活的人cd45+cd3+cd4-cd8-γδt细胞(图22d)上监测结合。图23显示tnc靶向性或非靶向性分拆三聚体人4-1bb配体fc(kih)融合分子对表达人tnc的u87-mg肿瘤细胞系的结合。用r-藻红蛋白荧光染料缀合的抗人iggfcγ特异性山羊iggf(ab`)2片段检测结合并在y轴上显示通过流式细胞术测量的几何均值。在x轴上显示所使用的tnc靶向性4-1bb分拆三聚体配体fc融合抗原结合分子及其对照的浓度。图24显示使用表达人4-1bb的hela报告细胞系的激活测定法设置的图示。报告细胞上表达的4-1bb的交联诱导nfκb激活和nfκb介导的萤光素酶表达。细胞裂解后，萤光素酶能催化萤光素氧化成氧化萤光素。此化学反应与nfκb介导的萤光素酶表达的强度正相关且能通过发光强度(释放光单位)来测量。图25显示nfκb激活诱导的萤光素酶活性。测量0.5s/孔的释放光单位(url)并针对所使用的含有分拆三聚体4-1bb配体的融合分子和对照的浓度绘图。将表达人4-1bb的hela报告细胞在经由表达人tnc的u87mg细胞的交联缺失(图25a)或存在(图25b)下温育6小时。表达4-1bb的hela报告细胞对表达tnc的肿瘤细胞的细胞比为1:5。图26显示在表达tnc的u87mg，激动性抗人cd3抗体和双特异性抗tnc分拆三聚体4-1bbl融合分子构建体6.5存在下人pbmc激活的示意性设置的图示。图27显示在tnc+u87mg，激动性cd3抗体和tnc靶向性分拆三聚体4-1bbl融合分子存在下的人pbmc激活测定法。作为总cd8+t细胞的频率，cd25和cd137(4-1bb)的表达水平针对所使用的构建体6.5和6.6或对照(对照f，对照l和对照e)的浓度绘图。发明详述定义除非另外定义，本文中使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中通常使用的相同的含义。出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。如本文中使用的，术语“抗原结合分子”在其最广义上指的是特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是抗体，抗体片段和支架抗原结合蛋白。如本文中使用的，术语“能够特异性结合……的模块”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合模块能够通过其靶细胞抗原激活信号传导。在一个特定方面，抗原结合模块能够将与其连接的实体(例如，tnf家族配体三聚体)引导至靶位点，例如引导至具有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够特异性结合靶细胞抗原的模块包括本文中进一步定义的抗体及其片段。另外，能够特异性结合靶细胞抗原的模块包括本文中进一步定义的支架抗原结合蛋白，例如，基于设计的重复蛋白或设计的重复域的结合域(见例如wo2002/020565)。关于抗体或其片段，术语“能够特异性结合……的模块”是指分子的包含与抗原的部分或全部特异性结合并与其互补的区域的部分。可以例如由一个或多个抗体可变域(也称为抗体可变区)提供能够进行特异性抗原结合的模块。特别地，能够进行特异性抗原结合的模块包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。在本文中以最广义的方式使用术语“抗体”，其涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。如本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群获得的抗体，即包含该群的单独的抗体是同一的和/或结合同一表位，除了可能的变体抗体之外，例如，含有天然存在的突变的或在单克隆抗体制剂的产生过程中产生的抗体，这样变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点各自与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性地与至少两个不同的抗原决定簇结合。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点对于不同的抗原决定簇是特异性的。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两个抗原决定簇，尤其是在两个不同细胞上表达的两个抗原决定簇。在本申请中使用的术语“价”意味着在抗原结合分子中特定数目的结合位点的存在。正因为因此，术语“二价”，“四价”和“六价”分别意味着在抗原结合分子中存在两个结合位点，四个结合位点和六个结合位点。术语“全长抗体”，“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指的是具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体。“天然抗体”指的是具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由成二硫键的两条轻链和两条重链构成。从n端至c端，每个重链具有可变区(vh)，也称为可变重域或重链可变域，其后是三个恒定域(ch1，ch2，和ch3)，也称为重链恒定区。类似地，从n端至c端，每个轻链具有可变区(vl)，也称为可变轻域或轻链可变域，其后是轻链恒定域(cl)，也称为轻链恒定区。抗体重链可被指定为五种类型中的一种，称为α(iga)，δ(igd)，ε(ige)，γ(igg)，或μ(igm)，其中一些可以进一步分为亚类，例如γ1(igg1)，γ2(igg2)，γ3(igg3)，γ4(igg4)，α1(iga1)和α2(iga2)。基于其恒定域的氨基酸序列，抗体轻链可被指定为两种类型之一，称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。“抗体片段”指的是除了完整抗体之外的分子，其包含与完整抗体所结合的抗原结合的所述完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于fv，fab，fab'，fab’-sh，f(ab')2；双抗体，三抗体，四抗体，交叉fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和单域抗体。关于某些抗体片段的综述，见hudson等人，natmed9,129-134(2003)。关于scfv片段的综述，见例如plückthun，引自thepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburgandmooreeds.,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)；还见wo93/16185；和美国专利nos.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的fab和f(ab')2片段的讨论，见美国专利no.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的可以是二价或双特异性的抗体片段，见，例如ep404,097；wo1993/01161；hudson等人，natmed9,129-134(2003)；和hollinger等人，procnatlacadsciusa90,6444-6448(1993)。hudson等人在natmed9,129-134(2003)中也描述了三抗体和四抗体。单域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变域或全部或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(domantis,inc.,waltham,ma；见例如美国专利no.6,248,516b1)。可以通过各种技术制造抗体片段，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中所述。完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个完全相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，其各自含有重链和轻链可变域以及轻链的恒定域和重链的第一恒定域(ch1)。因此，如本文中使用的，术语“fab片段”是指包含包括轻链的vl域和恒定域(cl)的轻链片段，和重链的vh域和第一恒定域(ch1)的抗体片段。fab'片段因在重链chl域的羧基末端增加了少数残基而与fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab'-sh是其中恒定域的半胱氨酸残基具有游离巯基的fab'片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个fab片段)和fc区的一部分的f(ab')2片段。术语“交叉fab片段”或“xfab片段”或“交换fab片段”是指其中重链和轻链的可变区或恒定区之间被交换的fab片段。交换fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中：一方面，fab重链和轻链的可变区被交换，即交换fab分子包含由轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)构成的肽链，以及由重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)构成的肽链。这种交换fab分子也被称为crossfab(vlvh)。另一方面，当fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换fab分子包含由重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)构成的肽链，以及由轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)构成的肽链。这种交换fab分子也被称为crossfab(clch1)。“单链fab片段”或“scfab”是由抗体重链可变域(vh)，抗体恒定域1(ch1)，抗体轻链可变域(vl)，抗体轻链恒定域(cl)和接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述接头在n端至c端方向具有以下顺序之一：a)vh-ch1-接头-vl-cl，b)vl-cl-接头-vh-ch1，c)vh-cl-接头-vl-ch1或d)vl-ch1-接头-vh-cl；且其中所述接头是具有至少30个氨基酸，优选32至50个氨基酸之间的多肽。所述单链fab片段经由cl域和ch1域之间的天然二硫键而被稳定化。另外，通过插入半胱氨酸残基(例如根据kabat编号在可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)产生链间二硫键，这些单链fab分子可以进一步被稳定化。“交换单链fab片段”或“x-scfab”是由抗体重链可变域(vh)，抗体恒定域1(ch1)，抗体轻链可变域(vl)，抗体轻链恒定域(cl)和接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述接头在n端至c端方向具有以下顺序之一：a)vh-cl-接头-vl-ch1和b)vl-ch1-接头-vh-cl；其中vh和vl一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，且其中所述接头是具有至少30个氨基酸的多肽。另外，通过插入半胱氨酸残基(例如根据kabat编号在可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)产生链间二硫键，这些x-scfab分子可以进一步被稳定化。“单链可变片段(scfv)”是用具有10个至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的融合蛋白。该接头通常富含有关柔性的甘氨酸，以及有关溶解性的丝氨酸或苏氨酸，并且可将vh的n端与vl的c端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白质保留了原始抗体的特异性。scfv抗体例如描述于houston,j.s.,methodsinenzymol.203(1991)46-96)。另外，抗体片段包含具有vh域特征或vl域特征的单链多肽，所述vh域特征即能够与vl域一起组装到功能性抗原结合位点上，所述vl域特征即能够与vh域一起组装到功能性抗原结合位点上，从而提供全长抗体的抗原结合特性。“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的，例如，纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)已被用作抗原结合域的替代支架，见例如gebauer和skerra,engineeredproteinscaffoldsasnext-generationantibodytherapeutics.curropinchembiol13:245-255(2009)和stumpp等人，darpins:anewgenerationofproteintherapeutics.drugdiscoverytoday13:695-701(2008)。在本发明的一个方面，支架抗原结合蛋白选自ctla-4(evibody)，脂质运载蛋白(anticalin)，蛋白a衍生的分子，如蛋白a的z域(affibody)，a域(avimer/maxibody)，血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)，抗体轻链或重链的可变域(单域抗体，sdab)，抗体重链的可变域(纳米抗体，avh)，vnar片段，纤连蛋白(adnectin)，c型凝集素域(tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变域(vnar片段)，人γ-晶体蛋白或泛素(affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型域，诸如来自knottin家族的蛋白质的微体，肽适体和纤连蛋白(adnectin)。ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4)是主要在cd4+t细胞上表达的cd28家族受体。其细胞外域具有类似可变域的ig折叠。可用异源序列取代对应于抗体的cdr的环，以赋予不同的结合特性。经过工程化而具有不同结合特异性的ctla-4分子也被称为evibodies(例如，us7166697b1)。evibodies的大小与抗体(例如，域抗体)的分离可变区大约相同。进一步的详情见journalofimmunologicalmethods248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白为细胞外蛋白质家族，其转运小的疏水性分子，如类固醇，胆红素，类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端具有可被工程化以结合不同的靶抗原的多个环。anticalin的大小在160-180个氨基酸之间，并且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情见biochimbiophysacta1482:337-350(2000)，us7250297b1和us20070224633。亲和体是衍生自金黄色葡萄球菌蛋白a的支架，其可被工程化以结合抗原。该域由具有约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化生成了文库。进一步的详情见proteineng.des.sel.17,455-462(2004)和ep1641818a1。avimers是衍生自a域支架家族的多域蛋白。具有约35个氨基酸的天然域采用定义的成二硫键的结构。多样性是通过改变a域家族所显示的自然变异产生的。进一步的详情见naturebiotechnology23(12),1556-1561(2005)和expertopiniononinvestigationaldrugs16(6),909-917(june2007)。转铁蛋白是单体的血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列将转铁蛋白工程化以结合不同的靶抗原。工程化转铁蛋白支架的实例包括trans-body。进一步的详情见j.biol.chem274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)衍生自锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞骨架附着的蛋白质家族。单个锚蛋白重复是由两个α-螺旋和β-转角组成的33个残基的基序。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基，它们可以被工程化以结合不同的靶抗原。通过增加模块的数量(亲和力成熟法)可以增加它们的结合界面。进一步的详情见j.mol.biol.332,489-503(2003),pnas100(4),1700-1705(2003)和j.mol.biol.369,1015-1028(2007)以及us20040132028a1。单域抗体是由单个单体的可变抗体域组成的抗体片段。第一个单域抗体来源于来自骆驼科动物(camelids)抗体重链的可变域(纳米抗体或vhh片段)。此外，术语单域抗体包括自主的人重链可变域(avh)或来源于鲨鱼的vnar片段。纤连蛋白是一种可以被工程化为与抗原结合的支架。adnectin由人纤连蛋白iii型(fn3)的15个重复单元的第10个域的天然氨基酸序列的主链组成。可以将β-夹心一端的三个环工程化，使adnectin能够特异性地识别感兴趣的治疗靶标。进一步的详情见proteineng.des.sel.18,435-444(2005)，us20080139791，wo2005056764和us6818418b1。肽适体是由恒定骨架蛋白组成的组合识别分子，所述骨架蛋白通常是含有在活性位点插入的约束可变肽环的硫氧还蛋白(trxa)。进一步的详情见expertopin.biol.ther.5,783-797(2005)。微体源自长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的实例包括kalatabi以及芋螺毒素和半胱氨酸结肽(knottin)。微蛋白具有可以工程化以包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠的环。工程化的半胱氨酸结肽域的更多详情见wo2008098796。就参照分子而言“结合相同表位的抗原结合分子”是指在竞争测定中阻断参照分子与其抗原的结合的50％或以上的抗原结合分子，相反地，参照分子在竞争测定中阻断抗原结合分子与其抗原的结合的50％或以上。术语“抗原结合域”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的部分或全部特异性地结合且互补的区域。在大抗原的情况下，抗原结合分子可能仅与该抗原的特定部分结合，该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个可变域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。如本文中使用的，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指在抗原结合模块与其结合而形成抗原结合模块-抗原复合物的多肽大分子上的位点(例如氨基酸的连续段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构型)。有用的抗原决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上，病毒感染细胞的表面上，其它病变的细胞表面上，免疫细胞表面上发现，在血清中和/或细胞外基质(ecm)中游离。用作本文中的抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。在一个具体实施方案中，抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况下，该术语包括“全长”未加工的蛋白质以及通过在细胞中加工产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。术语“能够特异性结合tnc”或“能够与tnc特异性结合”指能够以足够亲和力结合生腱蛋白-c(tnc)，使得该抗原结合分子可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向tnc的抗原结合分子或抗原结合模块。抗原结合分子包括但不限于抗体，fab分子，交换fab分子，单链fab分子，fv分子，scfv分子，单域抗体，vh和支架抗原结合蛋白。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(ria)的测量，抗tnc抗原结合分子结合无关的，非tnc的蛋白质的程度小于该抗原结合分子对tnc的结合的约10％。在某些实施方案中，结合tnc的抗原结合分子具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m，例如10nm至0.1nm，例如5nm至0.1nm，例如2nm至0.1nm)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗tnc抗原结合分子结合在来自不同物种的tnc中保守的tnc表位。在某些实施方案中，结合tnc表位的抗原结合分子是对至少一种选自由a1，a2，a3，a4，b，ad1，ad2，c和d组成的组的域特异性的。在某些实施方案中，提供对tnca1和tnca4域特异性的抗原结合分子。在某些实施方案中，提供对tncc域特异性的抗原结合分子。“特异性结合”意指结合对于抗原而言是选择性的，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区别开。抗原结合分子与特异性抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量，例如，表面等离振子共振(spr)技术(在biacore仪器上分析)(liljeblad等人，glycoj17,323-329(2000))和传统结合测定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))。在一个实施方案中，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于该抗原结合分子与抗原结合的约10％，正如通过例如spr所测量的。在某些实施方案中，与抗原结合的分子具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm或≤0.001nm(例如10-8m或更小，例如10-8m至10-13m，例如10-9m至10-13m)的解离常数(kd)。“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，如本文中使用的，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子x对其伴侣y的亲和力通常可以通过解离常数(kd)来表示，亲和力是解离速率常数与结合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等同亲和力可以包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。可以通过本领域已知的常用方法测量亲和力，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的特定方法是表面等离振子共振(spr)。如本文中使用的“靶细胞抗原”是指靶细胞的表面上或靶细胞的环境中呈现的抗原决定簇，所述靶细胞例如肿瘤中的细胞，如癌细胞或肿瘤基质细胞。在某些实施方案中，靶细胞抗原在细胞外基质中或在肿瘤组织周围表达。特别地，靶细胞抗原是生腱蛋白-c(tnc)。如本文中使用的，术语“生腱蛋白-c”或“tnc”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人和食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然tnc，除非另外指明。该术语涵盖“全长”，未加工的tnc以及tnc因细胞中的加工所致的任何形式。该术语还涵盖tnc的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人tnc抗原序列的氨基酸序列(带n端gst和6xhis标签；和c端avi标签和6xhis标签)显示于seqidno：4。一种例示性小鼠tnc抗原序列的氨基酸序列(带n端gst和6xhis标签；和c端avi标签和6xhis标签)显示于seqidno：5。一种例示性食蟹猴tnc抗原序列的氨基酸序列(带n端gst和6xhis标签；和c端avi标签和6xhis标签)显示于seqidno：6。在人tnc分子中，已知多至九个可变剪接纤连蛋白iii型域，它们可以插入第五个和第六个恒定纤连蛋白iii型域之间(tnc的域结构的示意图见例如orendandchiquet-ehrismann,cancerletters244,143-163(2006))。类似地，在小鼠tnc分子中，记载了六个可变剪接纤连蛋白iii型域(例如joestnerandfaissner,jbiolchem274,17144-17151(1999))。术语“可变区”或“可变域”是指涉及抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为vh和vl)通常具有相似的结构，每个域包含四个保守的框架区(fr)和三个高变区(hvr)。见例如kindt等人，kubyimmunology,6thed.,w.h.freeman和co.,第91页(2007)。单个vh或vl域可足以赋予抗原结合特异性。如本文中使用的术语“高变区”或“hvr”是指在序列上高变/或形成结构上定义的环(“高变环”)的抗体可变域的每个区域。通常，天然四链抗体包含六个hvr：三个在vh中(h1，h2，h3)，三个在vl中(l1，l2，l3)。hvr通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(cdr)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或涉及抗原识别。示例性的高变环发生在氨基酸残基26-32(l1)，50-52(l2)，91-96(l3)，26-32(h1)，53-55(h2)，和96-101(h3)处。(chothia和lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987).)示例性的cdr(cdr-l1，cdr-l2，cdr-l3，cdr-h1，cdr-h2，和cdr-h3)发生在l1的24-34，l2的50-56，l3的89-97，h1的31-35b，h2的50-65，和h3的95-102氨基酸残基处。(kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991).)高变区(hvr)也被称为互补决定区(cdr)，并且在提到形成抗原结合区的可变区的部分时，这些术语在本文中可互换地使用。这个特定的区域已经由kabat等人在u.s.dept.ofhealthandhumanservices,"sequencesofproteinsofimmunologicalinterest"(1983)和chothia等人在j.mol.biol.196:901-917(1987)中描述，其中定义包括当针对彼此进行比较时的氨基酸残基的重叠或子集。然而，提及抗体的cdr或其变体的任一定义的应用预期在本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如以上每一篇引用的参考文献所定义的cdr的适当氨基酸残基在以下表a中列出作为比较。涵盖特定cdr的确切残基数将取决于cdr的序列和大小而变化。考虑到抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定的cdr。表a：cdr定义11表a中所有cdr定义的编号遵循kabat等人提出的编号规则(见下文)。2具有如表a中使用的小写“b”的“abm”是指oxfordmolecular的“abm”抗体建模软件所定义的cdr。kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域的普通技术人员可以将这个“kabat编号”系统明确地指定给任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文中使用的，“kabat编号”是指由kabat等人在u.s.dept.ofhealthandhumanservices,"sequenceofproteinsofimmunologicalinterest"(1983)中提出的编号系统。除非另有说明，抗体可变区中特定氨基酸残基位置编号的提及是根据kabat编号系统。除了vh中的cdr1之外，cdr通常包含形成高变环的氨基酸残基。cdr还包含作为接触抗原的残基的“特异性决定残基”或“sdr”。sdr被包含在称为缩略cdr(或a-cdr)的cdr区域中。示例性的a-cdr(a-cdr-l1，a-cdr-l2，a-cdr-l3，a-cdr-h1，a-cdr-h2，和a-cdr-h3)发生在l1的31-34，l2的50-55，l3的89-96，h1的31-35b，h2的50-58，和h3的95-102氨基酸残基处。(见almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008).)除非另外指明，在本文中根据上文kabat等人将可变域中的hvr残基和其它残基(例如fr残基)编号。如本文中使用的，在抗原结合分子(例如，抗体)的背景下，术语“亲和力成熟”是指例如通过突变而衍生自亲本抗原结合分子的抗原结合分子与亲本抗体结合相同的抗原，优选结合相同的表位；并且对抗原具有相比于对参照抗原结合分子更高的亲和力。亲和力成熟通常涉及抗原结合分子的一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸残基的修饰。通常，亲和力成熟的抗原结合分子与初始亲本抗原结合分子结合相同的表位。“框架”或“fr”是指除了高变区(hvr)残基之外的可变域残基。可变域的fr通常由fr1，fr2，fr3和fr4四个fr域组成。因此，hvr和fr序列通常在vh(或vl)中以下列顺序出现：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。出于本文的目的，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变域(vl)框架或重链可变域(vh)框架的氨基酸序列的框架，如下所定义。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者其可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，或2个或更少。在一些实施方案中，vl受体人框架在序列上与vl人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。术语“嵌合”抗体是指其中一部分重链和/或轻链衍生自特定来源或物种的抗体，同时重链和/或轻链的其余部分衍生自不同的来源或物种。抗体的“类”是指其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。有五大类的抗体：iga，igd，ige，igg和igm，其中几类可进一步分为亚类(同种型)，例如，igg1，igg2，igg3，igg4，iga1，和iga2。对应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ，和μ。“人源化”抗体是指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个(通常两个)可变域中的基本上所有的可变域，其中所有或基本上所有的hvr(例如，cdr)对应于非人抗体的hvr，并且所有或基本上所有的fr对应于人抗体的fr。人源化抗体任选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”是指经过人源化的抗体。本发明涵盖的其它形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经基于原始抗体的恒定区另外加以修饰或改变以产生依照本发明的特性特别是关于c1q结合和/或fc受体(fcr)结合的那些抗体。“人”抗体是具有此类氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于人或人细胞产生的抗体或衍生自利用人抗体全集或其它的人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这个定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。本文中的术语“fc域”或“fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的c端区。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。iggfc区包含iggch2和iggch3域。人iggfc区的“ch2域”通常从约位置231的氨基酸残基延伸至约位置340的氨基酸残基。在一个实施方案中，碳水化合物链与ch2域附接。本文中的ch2域可以是天然序列ch2域或变体ch2域。“ch3域”包含在fc区中的c端到ch2域的残基段(即从igg的约位置341的氨基酸残基到约位置447的氨基酸残基)。本文中的ch3区可以是天然序列ch3域或变体ch3域(例如，具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”)和在其另一条链中相应的引入的“空腔”(“穴”)的ch3域；见美国专利5,821,333，将其明确地通过提述并入本文)。如本文中所述，这种变体ch3域可用于促进两个不相同的抗体重链的异二聚化。在一个实施方案中，人igg重链fc区从cys226或从pro230延伸到重链的羧基末端。然而，fc区的c端赖氨酸(lys447)可能存在或可能不存在。除非在本文中另外说明，fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据eu编号系统也称为eu索引进行的，如kabat等人在sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中描述。“节入穴”(kih)技术例如描述于us5,731,168；us7,695,936；ridgway等人，proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得该隆起可以定位在该空腔中，从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建隆起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与隆起具有相同或相似大小的补偿空腔。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变，或通过肽合成而产生隆起和空腔。在具体的实施方案中，节修饰包括fc域的两个亚基之一中的氨基酸替代t366w，且穴修饰包括fc域的两个亚基中的另一个亚基中的氨基酸替代t366s，l368a和y407v。在又一个具体实施方案中，包含节修饰的fc域的亚基另外包含氨基酸替代s354c，且包含穴修饰的fc域的亚基另外包含氨基酸替代y349c。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc区的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定该二聚体(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。编号是根据kabat等人在sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中的eu索引进行的。“等同于免疫球蛋白fc区的区域”预期包括免疫球蛋白fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生替代，添加或删除的改变但不实质性地降低免疫球蛋白介导效应器功能(如抗体依赖性细胞毒性)的能力的变体。例如，可以从免疫球蛋白fc区的n端或c端删除一个或多个氨基酸，而没有生物学功能的实质性丧失。可以根据本领域已知的一般规则来选择这些变体，以便对活性具有最小的影响(见，例如bowie,j.u.等人，science247:1306-10(1990))。术语“效应器功能”是指可归因于抗体fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)，fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)，细胞因子分泌，免疫复合物介导的经由抗原呈递细胞的抗原摄取，细胞表面受体(例如b细胞受体)的下调，和b细胞激活。“激活性fc受体”是被抗体fc区接合之后引出信号传导事件的fc受体，所述事件刺激带有该受体的细胞履行效应器功能。激活性fc受体包括fcγriiia(cd16a)，fcγri(cd64)，fcγriia(cd32)，和fcαri(cd89)。特定的激活性fc受体是人fcγriiia(见uniprot登录号p08637，版本141)。术语“tnf配体家族成员”或“tnf家族配体”是指促炎细胞因子。细胞因子，特别是tnf配体家族的成员，通常在免疫系统的刺激和协调中起关键作用。目前，根据序列，功能和结构相似性，已将19种细胞因子鉴定为tnf(肿瘤坏死因子)配体超家族的成员。所有这些配体都是具有c端细胞外域(胞外域)，n端胞内域和单个跨膜域的ii型跨膜蛋白。称为tnf同源域(thd)的c端细胞外域在超家族成员之间具有20-30％的氨基酸同一性，并且负责与受体的结合。tnf胞外域还负责tnf配体形成被其特异性受体识别的三聚体复合物。tnf配体家族的成员选自由淋巴毒素α(也称为lta或tnfsf1)，tnf(也称为tnfsf2)，lt(也称为tnfsf3)，ox40l(也称为tnfsf4)，cd40l(也称为cd154或tnfsf5)，fasl(也称为cd95l，cd178或tnfsf6)，cd27l(也称为cd70或tnfsf7)，cd30l(也称为cd153或tnfsf8)，4-1bbl(也称为tnfsf9)，trail(也称为apo2l,cd253或tnfsf10)，rankl(也称为cd254或tnfsf11)，tweak(也称为tnfsf12)，april(也称为cd256或tnfsf13)，baff(也称为cd257或tnfsf13b)，light(也称为cd258或tnfsf14)，tl1a(也称为vegi或tnfsf15)，gitrl(也称为tnfsf18)，eda-a1(也称为外异蛋白a1)和eda-a2(也称为外异蛋白a2)组成的组。该术语是指任何脊椎动物来源的任何天然tnf家族配体，包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人)，非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。在本发明的具体实施方案中，tnf配体家族成员选自由ox40l，fasl，cd27l，trail，4-1bbl，cd40l和gitrl组成的组。在特定实施方案中，tnf配体家族成员选自4-1bbl和ox40l。可以从例如uniprot(www.uniprot.org)的可公开访问的数据库获得tnf配体家族成员的更多信息，特别是序列。例如，人tnf配体具有以下氨基酸序列：人淋巴毒素α(uniprot登录号p01374，seqidno:203)，人tnf(uniprot登录号p01375，seqidno:204)，人淋巴毒素β(uniprot登录号q06643，seqidno:205)，人ox40l(uniprot登录号p23510，seqidno:206)，人cd40l(uniprot登录号p29965，seqidno:207)，人fasl(uniprot登录号p48023，seqidno:208)，人cd27l(uniprot登录号p32970，seqidno:209)，人cd30l(uniprot登录号p32971，seqidno:210)，4-1bbl(uniprot登录号p41273，seqidno:211)，trail(uniprot登录号p50591，seqidno:212)，rankl(uniprot登录号o14788，seqidno:213)，tweak(uniprot登录号o43508，seqidno:214)，april(uniprot登录号o75888，seqidno:215)，baff(uniprot登录号q9y275，seqidno:216)，light(uniprot登录号o43557，seqidno:217)，tl1a(uniprot登录号o95150，seqidno:218)，gitrl(uniprot登录号q9ung2，seqidno:219)和外胚层发育异常蛋白a(uniprot登录号q92838，seqidno:220)。“胞外域”是延伸到细胞外空间(即靶细胞外的空间)的膜蛋白的域。胞外域通常是蛋白质中引发与表面接触的部分，导致信号转导。因此，如本文中定义的tnf配体家族成员的胞外域是指tnf配体蛋白中延伸进入细胞外空间的部分(细胞外域)，还包括负责三聚化和与相应tnf受体结合的较短部分或其片段。因此，术语“tnf配体家族成员的胞外域或其片段”是指形成细胞外域的tnf配体家族成员的细胞外域或其仍然能够与受体结合的部分(受体结合域)。术语“共刺激tnf配体家族成员”或“共刺激tnf家族配体”是指能够共刺激t细胞的增殖和细胞因子产生的tnf配体家族成员亚型。这些tnf家族配体可以在与其相应的tnf受体相互作用时共刺激tcr信号，并且与其受体的相互作用导致tnfr相关因子(traf)的募集，其引发导致t细胞激活的信号传导级联。共刺激tnf家族配体选自由4-1bbl，ox40l，gitrl，cd70，cd30l和light组成的组，更特特别地，共刺激tnf配体家族成员选自4-1bbl和ox40l。如前文中所述，4-1bbl是ii型跨膜蛋白，并且为tnf配体家族的一个成员。已经描述了在细胞表面上形成三聚体的具有氨基酸序列seqidno:212的完整或全长4-1bbl。通过4-1bbl的胞外域的特定基序而启动三聚体形成。所述基序在本文中命名为“三聚化区域”。人4-1bbl序列的氨基酸50-254(seqidno:180)形成4-1bbl的细胞外域，但是即使其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中，术语“4-1bbl的胞外域或其片段”是指具有选自seqidno:175(人4-1bbl的氨基酸52-254)，seqidno:172(人4-1bbl的氨基酸71-254)，seqidno:174(人4-1bbl的氨基酸80-254)和seqidno:173(人4-1bbl的氨基酸85-254)的氨基酸序列的多肽或具有选自seqidno:183(人4-1bbl的氨基酸71-248)，seqidno:194(人4-1bbl的氨基酸52-248)，seqidno:193(人4-1bbl的氨基酸80-248)和seqidno:192(人4-1bbl的氨基酸85-248)的氨基酸序列的多肽，但是能够三聚化的胞外域的其它片段也包括在本文中。如前文中所述，ox40l是另一种ii型跨膜蛋白，并且为tnf配体家族的另一个成员。完整或全长的人ox40l具有seqidno:206的氨基酸序列。人ox40l序列的氨基酸51-183(seqidno:181)形成ox40l的细胞外域，但是即使其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中，术语“ox40l的胞外域或其片段”是指具有选自seqidno:181(人ox40l的氨基酸51-183)或seqidno:182(人ox40l的氨基酸52-183)的氨基酸序列的多肽，但是能够三聚化的胞外域的其它片段也包括在本文中。术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸通常约2-20个氨基酸的肽。肽接头在本领域中是已知的或描述于本文中。适合的非免疫原性接头肽例如是，(g4s)n，(sg4)n或g4(sg4)n肽接头，其中“n”通常为1至10之间的数字，通常为1至4，特别是2，即，这些肽选自由ggggs(seqidno:162)，ggggsggggs(seqidno:150)，sggggsgggg(seqidno:151)和ggggsggggsgggg(seqidno:152)组成的组，但也包括序列gspgssssgs(seqidno:153)，gsgsgsgs(seqidno:154)，gsgsgngs(seqidno:155)，ggsgsgsg(seqidno:156)，ggsgsg(seqidno:157)，ggsg(seqidno:158)，ggsgngsg(seqidno:159)，ggngsgsg(seqidno:160)和ggngsg(seqidno:149)。特别感兴趣的肽接头是(g4s)1或ggggs(seqidno:162)，(g4s)2或ggggsggggs(seqidno:150)和gspgssssgs(seqidno:153)，更具体地为(g4s)2或ggggsggggs(seqidno:150)和gspgssssgs(seqidno:153)。在本申请中使用的术语“氨基酸”表示包含丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：a)，精氨酸(arg，r)，天冬酰胺(asn，n)，天冬氨酸(asp，d)，半胱氨酸(cys，c)，谷氨酰胺(gln，q)，谷氨酸(glu，e)，甘氨酸(gly，g)，组氨酸(his，h)，异亮氨酸(ile，i)，亮氨酸(leu，l)，赖氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，苯丙氨酸(phe，f)，脯氨酸(pro,p)，丝氨酸(ser，s)，苏氨酸(thr，t)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)的天然存在的羧基α-氨基酸的组。如本文中使用的“单链融合蛋白”是指由与抗原结合模块或fc部分的一部分融合的所述tnf配体家族成员的一个或两个胞外域构成的单链多肽。通过经由肽接头将抗原结合模块的n端或c端氨基酸直接与所述tnf配体家族成员的胞外域的c端或n端氨基酸连接，可以进行融合。“融合”或“连接”意指组分(例如多肽和所述tnf配体家族成员的胞外域)通过肽键直接连接或经由一个或多个肽接头连接。相对于参照多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在序列比对和引入空位(如果需要的话，达到最大序列同一性百分比，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代)之后候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。以本领域技术人员熟知的各种方法可实现为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对，例如，利用可公开获得的计算机软件，如blast，blast-2，align.sawi或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文的目的，通过使用序列比较计算机程序align-2生成了氨基酸序列同一性％值。align-2序列比较计算机程序由genentech公司创作，并且源代码已在美国版权局(u.s.copyrightoffice,washingtond.c.,20559)与用户文件一起备案，在美国版权局以美国版权登记号txu510087登记。align-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的genentech公司公开获得，或者可以从源代码编译。align-2程序应当编译为供在包括数字unixv4.0d在内的unix操作系统上使用。所有序列比较参数均由align-2程序设定且没有变化。在采用align-2进行氨基酸序列比较的情形下，给定氨基酸序列a相对于(与，或针对)给定氨基酸序列b的氨基酸序列同一性％(或者可表述为给定氨基酸序列a相对于(与，或针对)给定氨基酸序列b具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)计算如下：100乘以分数x/y其中x为通过序列比对程序align-2在a与b的程序比对中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中y为b中的氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况下，a相对于b的氨基酸序列同一性％不会等于b相对于a的氨基酸序列同一性％。除非另外特别说明，否则使用align-2计算机程序如前一段所述获得在本文中使用的所有氨基酸序列同一性％值。在某些实施方案中，考虑了本文提供的含有tnf配体三聚体的抗原结合分子的“氨基酸序列变体”。例如，可能希望改善含有tnf配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学性质。含有tnf配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可以通过向编码所述分子的核苷酸序列引入适当的修饰，或通过肽合成来制备。这些修饰包括，例如，抗体氨基酸序列中的残基的删除和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入和替代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终构建体具有期望的特征，例如抗原结合。取代型诱变的感兴趣部位包括hvr和框架(fr)。在表b中的标题“优选取代”下提供了保守取代，并且在下文中参照氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步加以描述。可以将氨基酸替代引入感兴趣的分子中，并筛选出具有期望活性的产物，所述活性例如保留/增强的抗原结合，降低的免疫原性，或增强的adcc或cdc。表b原始残基示例性取代优选取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；asp,lys；argglnasp(d)glu；asnglucys(c)ser；alasergln(q)asn；gluasnglu(e)asp；glnaspgly(g)alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leuleu(l)正亮氨酸；ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrtyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)val；sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸leu可以根据常见的侧链性质将氨基酸分组：(1)疏水的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性亲水的：cys，ser，thr，asn，gln；(3)酸性的：asp，glu；(4)碱性的：his，lys，arg；(5)影响链取向的残基：gly，pro；(6)芳香族的：trp，tyr，phe。非保守取代需要将这些类之一的成员替换为另一类。术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸替代的实质性变体。通常，经过选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗原结合分子在某些生物学特性(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)方面将具有改变(例如提高)和/或将具有基本上保留的亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性的取代变体是亲和力成熟抗体，可以例如使用例如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术来产生所述抗体。简言之，将一个或多个hvr残基突变，并将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定的生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施方案中，替代，插入或删除可以在一个或多个hvr内进行，只要这些改变基本上不降低抗原结合分子结合抗原的能力即可。例如，可以在hvr中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如本文中提供的保守取代)。用于鉴定可能被靶向诱变的抗体残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085所述。在该方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电荷残基，如arg，asp，his，lys和glu)，并用中性或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在针对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。替代地，或另外地，抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻残基可以作为取代候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列间插入。末端插入的实例包括具有n端甲硫氨酰残基的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子。分子的其它插入变体包括n端或c端与多肽的融合，以增加含有tnf配体三聚体的抗原结合分子的血清半衰期。在某些实施方案中，改变本文中提供的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子以增加或降低抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列从而产生或去除一个或多个糖基化位点，可以获得分子的糖基化变体。当含有tnf配体三聚体的抗原结合分子包含fc区时，附着于其上的碳水化合物可能被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双触角(biantennary)寡糖，其通常通过n键与fc区的ch2域的asn297连接。见，例如wright等人，tibtech15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖，n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)，半乳糖和唾液酸，以及与在双触角寡糖结构的“茎”中的glcnac附接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以在含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子进行寡糖修饰，以产生具有某些改良特性的变体。在一个方面，提供了具有缺乏与fc区附接(直接或间接)的岩藻糖的碳水化合物结构的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的变体。此类岩藻糖基化变体可具有增强的adcc功能，见，例如美国专利公开nos.us2003/0157108(presta,l.)或us2004/0093621(kyowahakkokogyoco.,ltd)。本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的其它变体包括具有两分寡糖的那些，例如，其中与fc区附接的双触角寡糖被glcnac两分。这些变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能，见例如wo2003/011878(jean-mairet等人)；美国专利no.6,602,684(umana等人)；和us2005/0123546(umana等人)。还提供了与fc区附接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可以具有改善的cdc功能，并被描述于例如wo1997/30087(patel等人)；wo1998/58964(raju,s.)；和wo1999/22764(raju,s.)中。在某些实施方案中，可能希望产生本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的半胱氨酸工程化的变体，例如“thiomab”，其中该分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基出现在分子的可接近位置。通过用半胱氨酸取代那些残基，由此反应性硫醇基团被定位在抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块(例如药物模块或接头-药物模块)缀合以产生免疫缀合物。在某些实施方案中，任何一个或多个以下残基可以被半胱氨酸取代：轻链的v205(kabat编号方式)；重链的a118(eu编号方式)；和重链fc区的s400(eu编号方式)。可以按照例如美国专利no.7,521,541中的描述产生半胱氨酸工程化的抗原结合分子。在某些方面，本文中提供的含有tnf家族的配体三聚体的抗原结合分子可进一步被修饰，以含有另外的本领域已知且易于获得的非蛋白质模块。适用于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(peg)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而具有在制造方面的优点。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。与抗体附接的聚合物的数量可以变化，并且如果附接一种以上的聚合物的话，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑事项来确定，包括但不限于，待改进的抗体的特定性质或功能，是否将抗体衍生物在限定的条件下用于治疗中，等等。在另一个方面，提供了可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体与非蛋白质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质模块是碳纳米管(kam,n.w.等人，proc.natl.acad.sci.usa102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞的波长，但所述波长将非蛋白质模块加热到杀死抗体-非蛋白质模块附近的细胞的温度。在另一个方面，可以获得本文中提供的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与包括但不限于细胞毒性剂在内的一个或多个异源分子缀合的抗体。“交叉物种反应性”指某些抗体特异性结合它们的相应靶抗原的能力，其中所述靶抗原可衍生自不同物种(例如人，小鼠，食蟹猴，等)。交叉物种反应性抗体以低于约1μm，优选低于约100nm，更优选低于约10nm，更优选低于约5nm，最优选低于约2nm的kd值结合自至少两种不同物种衍生的它的相应靶抗原。术语“以低于……的kd值结合自至少两种不同物种衍生的它的相应靶抗原”意味着相应抗体以低于指定kd值的解离常数kd结合自指定物种中每一种衍生的靶抗原。在优选的实施方案中，交叉物种反应性抗体以相似亲和力结合来自所有指定物种的靶抗原，优选在10nm至0.1nm，更优选5nm至0.1nm，最优选2nm至0.1nm的kd范围内。在一些实施方案中，相似的对自数种物种衍生的抗原的亲和力(其意味着对于所有感兴趣物种在窄kd范围内(例如在10nm至0.1nm或更窄的范围内)结合靶抗原)是有利的，例如对于人疾病的诊断测定法或动物模型。在进一步优选的实施方案中，交叉物种反应性抗体以相似亲和力结合来自所有指定物种(例如人，小鼠和食蟹猴)的靶抗原，特别是在因数为100的kd范围内，在因数为50的kd范围内，在因数为20的kd范围内，在因数为10的kd范围内，在因数为5的kd范围内。在一个优选的实施方案中，交叉物种反应性抗体以相似亲和力结合来自人，小鼠和食蟹猴的靶抗原，特别是在因数为10的kd范围内。为了清楚起见，交叉物种反应性抗体以与其它指定物种相比最高的亲和力结合指定物种之一。相应地，交叉物种反应性抗体以与其它指定物种相比最低的亲和力结合指定物种之一。在限定因数x的kd范围内意味着对具有最高亲和力的指定物种的亲和力没有超过比具有最低亲和力的指定物种的亲和力高x倍。换言之，对具有最低亲和力的指定物种的kd值没有超出对具有最高亲和力的指定物种的kd值的x倍。本领域清楚任何用于测量亲和力或亲合力的方法可用于验证交叉物种反应性抗体在本文所述给定kd因数范围内结合来自所有指定物种的靶抗原，只要将相同条件应用于对所有指定物种的kd测量。优选地，使用spr，特别是在25℃测量kd值。优选地，作为fab片段使用交叉物种反应性抗体测量亲和力。术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使rna(mrna)，病毒来源的rna或质粒dna(pdna)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如，可见于肽核酸(pna)中的酰胺键)。术语“核酸分子”是指任何一个或多个核酸区段，例如，存在于多核苷酸中的dna或rna片段。关于“分离的”核酸分子或多核苷酸，意指已经从其天然环境中移出的核酸分子，dna或rna。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被认为是分离的。分离的多核苷酸的另外的例子包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液形式的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常含有多核苷酸分子的细胞中所含的多核苷酸分子，但多核苷酸分子在染色体外存在或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。分离的rna分子包括本发明的体内或体外rna转录物，以及正链和负链形式以及双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，例如启动子，核糖体结合位点或转录终止子。关于具有至少例如与本发明的参照核苷酸序列95％“相同”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指除了该多核苷酸序列可以包括多至该参照核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外，所述多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同。换句话说，为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中多至5％的核苷酸可以被删除或被另一个核苷酸替代，或者，在参照序列中，总核苷酸的多至5％的多个核苷酸可被插入参照序列。参照序列的这些改变可以发生在参照核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何位置，独立散布在参照序列的残基之间或在参照序列内的一个基团或多个连续的基团中。实际情况是，使用例如上面针对多肽所讨论的已知的计算机程序(例如align-2)，可以常规地确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。术语“表达盒”是指重组或合成产生的多核苷酸，其具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒，染色体，线粒体dna，质体dna，病毒或核酸片段中。通常，除了其它序列之外，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的，并且是指用于将与其可操作地相关联的特定基因引入靶细胞中并且指导所述特定基因的表达的dna分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及组入其已被引入的宿主细胞中的基因组中的载体。本发明的表达载体包括表达盒。表达载体允许大量稳定的mrna的转录。一旦表达载体进入靶细胞内，则通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指在其中引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代在核酸含量方面与亲本细胞可能不完全相同，而可能含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞，例如cho细胞，bhk细胞，ns0细胞，sp2/0细胞，yo骨髓瘤细胞，p3x63小鼠骨髓瘤细胞，per细胞，per.c6细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，昆虫细胞和植物细胞，在此仅列举少数，还有包括在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。药剂的“有效量”是指导致其所施用的细胞或组织的生理学变化所必需的量。药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在剂量和时间段方面有效实现期望的治疗或预防结果所需的量。例如，治疗有效量的药剂消除，减少，延迟，最小化或预防疾病的不利影响。“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如母牛，绵羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如人类和非人灵长类动物如猴子)，兔，和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。术语“药物组合物”是指其为此类形式的制剂，所述形式允许其中所含的活性成分的生物学活性是有效的，并且所述制剂不含另外的对该配制剂所施用的受试者具有不可接受的毒性的组分。“药学上可接受的赋形剂”是指药物组合物中除了活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的赋形剂包括但不限于缓冲剂，稳定剂或防腐剂。术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这种治疗产品的适应症，用法，剂量，给药，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。如本文中使用的，“治疗/处理”是指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预，所述临床干预可用于预防或在临床病理过程中进行。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，症状减轻，疾病的任何直接或间接病理结果的削减，预防转移，降低疾病进展速度，改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的分子用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。如本文中使用的术语“癌症”是指增殖性疾病，例如淋巴瘤，癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，白血病，淋巴细胞性白血病，肺癌，非小细胞肺癌(nscl)，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠直肠癌(crc)，胰腺癌，乳腺癌，三阴性乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，食道癌，小肠癌，内分泌系统的癌症，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆道癌，中枢神经系统(cns)肿瘤，脊索瘤，脑干神经胶质瘤，多形性胶质母细胞瘤，星形细胞瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，成神经管细胞瘤，脑膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，黑素瘤，多发性骨髓瘤，b细胞癌(淋巴瘤)，慢性淋巴细胞性白血病(cll)，急性淋巴细胞性白血病(all)，毛细胞白血病，慢性髓细胞性白血病，包括任何上述癌症的难治性形式，或上述一种或多种癌症的组合。组合物和方法生腱蛋白-c(tnc)的独特可变剪接同等型在某些病理状况中特异性表达，但是在健康成年组织中基本上缺失，如此，靶向tnc的抗原结合分子具有极大的治疗潜力。本发明提供了新型的具有特别有利的性质的含有tnf家族配体三聚体抗原结合分子，所述性质例如可生产性，稳定性，结合亲和力，生物学活性，靶向效率和降低的毒性。本发明进一步提供了结合tnc的抗原结合分子，特别是具有改善的亲和力和交叉物种反应性的抗原结合分子。本发明的抗原结合分子可用于例如以tnc表达为特征的疾病，诸如癌症的诊断或治疗。在一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该靶细胞抗原是生腱蛋白-c(tnc)。在又一个方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与生腱蛋白-c(tnc)特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在一个特定方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个特定方面，该含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中tnf配体家族成员共刺激人t细胞激活。在另一个特定方面，该含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中tnf配体家族成员的这些胞外域在所有情况下是相同的。在又一个方面，提供了本文所述含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，(i)第一多肽含有ch1或cl域，第二多肽含有相应的cl或ch1域，其中第二多肽通过ch1和cl域之间的二硫键与第一多肽连接，且其中第一多肽包含通过肽接头与ch1或cl域且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的cl或ch1域连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者(ii)第一多肽含有ch3域，第二多肽含有相应的ch3域，且其中第一多肽包含通过肽接头与ch3域的c端且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，且其中第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽的ch3域的c端连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者(iii)第一多肽含有vh-cl或vl-ch1域，第二多肽含有相应的vl-ch1域或vh-cl域，其中第二多肽通过ch1和cl域之间的二硫键与第一多肽连接，且其中第一多肽包含通过肽接头与vh或vl且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的vl或vh连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在又一个方面，提供的是本文所述含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于(i)该第一多肽含有ch1或cl域且该第二多肽含有相应的cl或ch1域，其中该第二多肽与该第一多肽通过该ch1和cl域之间的二硫键连接，且其中该第一多肽包含通过肽接头与该ch1或cl域且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的cl或ch1域连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，或(ii)该第一多肽含有ch3域且该第二多肽含有相应的ch3域，且其中该第一多肽包含通过肽接头与该ch3域的c端且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段且其中该第二多肽仅包含一个经由肽接头与所述多肽的ch3域的c端连接的所述tnf配体家族成员的胞外域或其片段。在一个特定方面，含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含共刺激人t细胞激活的tnf配体家族成员，其选自4-1bbl和ox40l。更特别地，tnf配体家族成员是4-1bbl。在另一个方面，其中tnf配体家族成员的胞外域包含选自由seqidno:172，seqidno:173，seqidno:174，seqidno:175，seqidno:183，seqidno:192，seqidno:193和seqidno:194组成的组的氨基酸序列，特别是seqidno:172或seqidno:183的氨基酸序列。在一个方面，tnf配体家族成员的胞外域或其片段包含选自由seqidno:172，seqidno:173，seqidno:174，seqidno:175和seqidno:183组成的组的氨基酸序列，特别是seqidno:172或seqidno:183的氨基酸序列。在一个特定方面，tnf配体家族成员的胞外域或其片段包含seqidno:183的氨基酸序列。在又一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自由seqidno:176，seqidno:184，seqidno:185和seqidno:186组成的组的氨基酸序列，第二多肽包含选自由seqidno:172，seqidno:174，seqidno:175和seqidno:183组成的组的氨基酸序列。在一个特定方面，第一多肽包含seqidno:184的氨基酸序列，第二多肽包含seqidno:183的氨基酸序列。在一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含seqidno:176的氨基酸序列，第二多肽包含seqidno:177的氨基酸序列。在又一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含seqidno:176的氨基酸序列，第二多肽包含seqidno:187的氨基酸序列。在还有又一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含seqidno:184的氨基酸序列，第二多肽包含seqidno:188或seqidno:189的氨基酸序列。在另一个方面，tnf配体家族成员是ox40l。在一个特定方面，提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中tnf配体家族成员的胞外域包含seqidno:181或seqidno:182的氨基酸序列，尤其是seqidno:181的氨基酸序列。在一个方面，本发明涉及含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含seqidno:190或seqid:191的氨基酸序列，第二多肽包含相应的seqidno:181或seqidno:182的氨基酸序列。在一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，(b)含有ch1或cl域的第一多肽和含有相应的cl或ch1域的第二多肽，其中第二多肽通过ch1和cl域之间的二硫键与第一多肽连接，且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头与ch1或cl域且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽的cl或ch1域连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在一个方面，提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，(b)含有ch1域的第一多肽和含有cl域的第二多肽，其中第二多肽通过ch1和cl域之间的二硫键与第一多肽连接，且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头与ch1域且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的cl域连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在另一个方面，提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，(b)含有cl域的第一多肽和含有ch1域的第二多肽，其中第二多肽通过ch1和cl域之间的二硫键与第一多肽连接，且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头与cl域且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的ch1域连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在另一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在还有另一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)一个以上的能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)两个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在一个特定方面，提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有ch3域，第二多肽含有相应的ch3域，且其中第一多肽包含通过肽接头与ch3域的c端且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的ch3域的c端连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。特别地，此类含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与tnc特异性结合的模块。在又一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc特异性结合的模块选自由抗体，抗体片段和支架抗原结合蛋白组成的组。在一个方面，提供了如前文所述的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc特异性结合的模块选自由抗体片段，fab分子，交换fab分子，单链fab分子，fv分子，scfv分子，单域抗体，avh和支架抗原结合蛋白组成的组。在一个方面，能够与tnc特异性结合的模块是avh或支架抗原结合蛋白。在一个方面，能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是能够与靶细胞抗原特异性结合的支架抗原结合蛋白。特别地，含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个或两个能够与tnc特异性结合的模块。在一个特定方面，提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc特异性结合的模块是能够与靶细胞抗原特异性结合的fab分子或交换fab分子。特别地，能够与tnc特异性结合的模块是fab分子。在又一个方面，提供的是依照本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含第一重链和第一轻链，这两者构成能够与tnc特异性结合的fab分子，第一肽，其包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，在其c端通过第二肽接头与第二重或轻链融合，和第二肽，其包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域，在其c端通过第三肽接头与相应的第二轻或重链融合。在又一个方面，提供了依照本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其c端通过第二肽接头与重链的ch1域融合，且其中所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段在其c端通过第三肽接头与轻链上的cl域融合。在又一个方面，提供了依照本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的ch1域融合，且包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的cl域融合。在另一个方面，提供了依照本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其c端通过第二肽接头与重链的cl域融合，且其中所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段在其c端通过第三肽接头与轻链上的ch1域融合。在另一个方面，提供了依照本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的cl域融合，且包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的ch1域融合。在又一个方面，本发明与依照本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子有关，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其c端通过第二肽接头与轻链的cl域融合，且其中所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段在其c端通过第三肽接头与重链的ch1域融合。在另一个方面，提供了依照本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的vh域融合，且包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的vl域融合。在一个特定方面，本发明涉及如上定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中肽接头是(g4s)2。在一个方面，第一肽接头为(g4s)2(seqidno:150)，第二肽接头为gspgssssgs(seqidno:153)，第三肽接头为(g4s)2(seqidno:150)。特别地，本发明涉及如上所述的含有tnf配体三聚体的抗原结合分子，其中第一肽接头为(g4s)2(seqidno:150)，第二肽接头为(g4s)2(seqidno:150)，第三肽接头为(g4s)2(seqidno:150)。在另一个方面，如前文中定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。特别地，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)能够与tnc特异性结合的fab分子，其中fab重链在c端与fc域中的ch2域的n端融合，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在又一个方面，fc域为igg，具体地为igg1fc域或igg4fc域。更特别地，fc域为igg1fc域。在一个特定方面，fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。降低fc受体结合和/或效应器功能的fc域修饰本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的fc域由包含免疫球蛋白分子的重链域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白g(igg)分子的fc域是二聚体，其每个亚基包含igg重链恒定域ch2和ch3。fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。fc域对本发明的抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达fc受体的细胞而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定方面，与天然igg1fc域相比，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的fc域表现出降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个方面，该fc基本上不与fc受体结合和/或不诱导效应器功能。在一个特定方面，该fc受体是fcγ受体。在一个方面，该fc受体是人fc受体。在一个具体方面，该fc受体是激活性人fcγ受体，更特别地是人fcγriiia，fcγri或fcγriia，最特别地是人fcγriiia。在一个方面，该fc域不诱导效应器功能。降低的效应器功能可以包括但不限于以下一者或多者：降低的补体依赖性细胞毒性(cdc)，降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)，细胞因子分泌减少，免疫复合物介导的经由抗原呈递细胞的抗原摄取减少，与nk细胞的结合减少，与巨噬细胞的结合减少，与单核细胞的结合减少，与多形核细胞的结合减少，直接信号传导诱导性细胞凋亡减少，降低的树突细胞成熟，或减少的t细胞引发。在某些方面，可以在本文中提供的抗原结合分子的fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生fc区变体。fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置上含有氨基酸修饰(例如取代)的人fc区序列(例如人igg1，igg2，igg3或igg4fc区)。在一个特定方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，其中fc域包含一个或多个降低与fc受体尤其是fcγ受体结合的氨基酸替代。在一个方面，本发明的抗原结合分子的fc域包含一个或多个降低fc域与fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，在fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一个或多个氨基酸突变。特别地，fc域包含在位置e233，l234，l235，n297，p331和p329(eu编号方式)处的氨基酸替代。特别地，fc域包含在igg重链的位置234和235(eu编号方式)和/或329(eu编号方式)处的氨基酸替代。更特别地，提供了依照本发明的抗原结合分子，其包含具有在igg重链中的氨基酸替代l234a，l235a和p329g(“pglala”，eu编号方式)的fc域。氨基酸替代l234a和l235a是指所谓的lala突变。氨基酸替代的“pglala”组合几乎完全消除了人igg1fc域的fcγ受体结合，并被描述于国际专利申请公开no.wo2012/130831a1中，该文献还描述了制备这种突变体fc域的方法以及用于确定其特性诸如fc受体结合或效应器功能的方法。“eu编号方式”是指根据kabat等人在sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中的eu索引的编号。具有降低的fc受体结合和/或效应器功能的fc域还包含具有一个或多个fc域残基238，265，269，270，297，327和329的取代的fc域(美国专利no.6,737,056)。此类fc突变体包括具有在两个或多个氨基酸位置265，269，270，297和327处的取代的fc突变体，包括所谓的“dana”fc突变体，其残基265和297被替代为丙氨酸(美国专利no.7,332,581)。在另一个方面，fc域为igg4fc域。与igg1抗体相比，igg4抗体展现出对fc受体的降低的结合亲和力和降低的效应器功能。在更具体的方面，fc域是包含在位置s228(kabat编号方式)处的氨基酸替代具体地为氨基酸替代s228p的igg4fc域。在更具体的方面，fc域是包含氨基酸替代l235e和s228p和p329g(eu编号方式)的igg4fc域。此类igg4fc域突变体及其fcγ受体结合特性也描述于wo2012/130831中。可以使用本领域熟知的遗传学或化学方法通过氨基酸删除，替代，插入或修饰来制备突变体fc域。遗传学方法可包括编码dna序列的位点特异性诱变，pcr，基因合成等。可以通过例如测序来验证正确的核苷酸变化。可以例如通过elisa或通过使用诸如biacore仪(gehealthcare)的标准仪器的表面等离振子共振(spr)容易地确定与fc受体的结合，并且可以例如通过重组表达获得fc受体。适合的此类结合测定描述于本文中。或者，可以使用已知表达特定fc受体的细胞系例如表达fcγiiia受体的人nk细胞来评估fc域或包含fc域的细胞激活性双特异性抗原结合分子针对fc受体的结合亲和力。可以通过本领域已知的方法测量fc域或包含fc域的本发明的抗原结合分子的效应器功能。适合的用于测量adcc的测定法描述于本文中。评估感兴趣分子的adcc活性的体外测定法的其它实例描述于美国专利no.5,500,362；hellstrom等人，proc.natlacadsciusa83,7059-7063(1986)和hellstrom等人，procnatlacadsciusa82,1499-1502(1985)；美国专利no.5,821,337；bruggemann等人，jexpmed166,1351-1361(1987)。或者，可以采用非放射性测定方法(见，例如actitm用于流式细胞术的非放射性细胞毒性测定法(celltechnology,inc.mountainview,ca)；cytotox非放射性细胞毒性测定法(promega,madison,wi))。用于这种测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。替代地，或另外地，可以在体内，例如，在clynes等人，procnatlacadsciusa95,652-656(1998)中公开的动物模型中评估感兴趣分子的adcc活性。在一些实施方案中，fc域与补体成分特别是c1q的结合减少。因此，在其中将fc域工程化以具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的cdc。可以进行c1q结合测定以确定本发明的抗原结合分子是否能够与c1q结合并因此具有cdc活性。见，例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体激活，可以进行cdc测定(见，例如gazzano-santoro等人，jimmunolmethods202,163(1996)；cragg等人，blood101,1045-1052(2003)；以及cragg和glennie,blood103,2738-2743(2004))。在一个特定方面，fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。促进异二聚化的fc域修饰在一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含：(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且第二多肽仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，其中fc域包含一个或多个降低与fc受体尤其是fcγ受体结合的氨基酸替代。因此，它们包含与fc域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同模块，所述亚基通常包含在两个不相同的多肽链(“重链”)中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致两条多肽的若干可能的组合。为了在重组生产中提高含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的产率和纯度，因此在本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的fc域中引入促进期望多肽的联合的修饰将是有利的。因此，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的fc域包含促进fc域的第一和第二亚基的联合的修饰。人iggfc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在fc域的ch3域中。因此，所述修饰具体地在fc域的ch3域中。在一个具体方面，所述修饰是所谓的“节入穴”修饰，包括在fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和fc域的两个亚基的另一个中的“穴”修饰。因此，在一个特定方面，本发明涉及如前文中描述的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包括igg分子，其中第一重链的fc部分包含第一个二聚化模块，且第二重链的fc部分包含允许igg分子的两条重链异二聚化的第二个二聚化模块；根据节入穴技术，第一个二聚化模块包括节，第二个二聚化模块包括穴。“节入穴”技术例如描述于us5,731,168；us7,695,936；ridgway等人proteng9,617-621(1996)及carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得该隆起可以定位在该空腔中，从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建隆起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与隆起具有相同或相似大小的补偿空腔。因此，在特定方面，在本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的fc域的第一亚基的ch3域中，将氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在第一亚基的ch3域内产生可定位于第二亚基的ch3域内的空腔中的隆起；且在fc域的第二亚基的ch3域中，将氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸酸残基，由此在第二亚基的ch3域内产生可将第一亚基的ch3域内的隆起定位在其中的空腔。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变，或通过肽合成而产生隆起和空腔。在一个具体方面，在fc域的第一亚基的ch3域中，第366位的苏氨酸残基替换为色氨酸残基(t366w)，而在fc域的第二亚基的ch3域中，第407位酪氨酸残基替换为缬氨酸残基(y407v)。更特别地，在fc域的第二亚基中，另外将366位的苏氨酸残基替换为丝氨酸残基(t366s)，将368位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(l368a)。更特别地，在fc域的第一亚基中，另外将第354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基(s354c)，而另外在fc域的第二亚基中，第349位酪氨酸残基替换为半胱氨酸残基(y349c)。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc域的两个亚基之间形成二硫桥。二硫桥进一步使该二聚体稳定(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。在一个替代方面，促进fc域的第一和第二亚基的联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰，例如，如pct公开wo2009/089004中所述。通常，这种方法包括通过将两个fc域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷氨基酸残基，使得在静电方面不利于同二聚体形成，但在静电方面有利于异二聚化。ch1/cl域的修饰为了进一步提高正确配对，含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子可以包含不同的带电荷氨基酸替代(所谓的“带电荷残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉ch1和cl域中。在一个特定方面，本发明涉及含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在cl域之一中在位置123(eu编号方式)处的氨基酸已替换为精氨酸(r)，在位置124(eu编号方式)处的氨基酸已替代为赖氨酸(k)，其中在ch1域之一中在位置147(eu编号方式)处和在位置213(eu编号方式)处的氨基酸已替代为谷氨酸(e)。更特别地，本发明涉及含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在邻近tnf配体家族成员的cl域中，在位置123(eu编号方式)处的氨基酸已替换为精氨酸(r)，在位置124(eu编号方式)处的氨基酸已替代为赖氨酸(k)，且其中在邻近tnf配体家族成员的ch1域中，在位置147(eu编号方式)处和在位置213(eu编号方式)处的氨基酸已替代为谷氨酸(e)。特定的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子在另一个方面，本发明提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与tnc特异性结合的fab分子，第一肽，其包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第一肽在其c端通过第二肽接头与第二重链或轻链融合，和第二肽，其包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域，所述第二肽通过第三肽接头在其c端与相应的第二轻链或重链融合。在又一个方面，提供了含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的ch1域融合，且包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的cl域融合。在还有另一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的cl域融合，且包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的ch1域融合。在又一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的vh域融合，且包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的vl域融合。在一个方面，本发明提供如本文中描述的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在邻近tnf配体家族成员的cl域中，在位置123(eu编号方式)处的氨基酸已替换为精氨酸(r)且在位置124(eu编号方式)处的氨基酸已替代为赖氨酸(k)，且其中在邻近tnf配体家族成员的ch1域中，在位置147(eu编号方式)和在位置213(eu编号方式)处的氨基酸已替代为谷氨酸(e)。这些修饰导致所谓的带电荷残基，其具有避免不想要的结果诸如例如错配的有利特性。在一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域中包含节突变的第二亚基的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域包含穴突变的第一亚基的c端。在一个特定方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域中包含节突变的第二亚基的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域中包含穴突变的第一亚基的c端且其中该fab重链在c端融合至该fc域中包含节突变的第二亚基的n端。在另一个方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域中包含节突变的第二亚基的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域中包含穴突变的第一亚基的c端且其中该fab重链在c端融合至该fc域中包含穴突变的第一亚基的n端。在又一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域中包含穴突变的第一亚基的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域中包含节突变的第二亚基的c端。在一个特定方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域中包含穴突变的第一亚基的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域中包含节突变的第二亚基的c端且其中该fab重链在c端融合至该fc域中包含节突变的第二亚基的n端。在另一个方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域中包含穴突变的第一亚基的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域中包含节突变的第二亚基的c端且其中该fab重链在c端融合至该fc域中包含穴突变的第一亚基的n端。特定的tnc结合模块在一个方面，本发明提供tnc结合模块。在另一个方面，本发明的tnc结合模块可包括在如本文中描述的二价或多价结合分子中。在一个实施方案中，该能够与tnc特异性结合的模块选自由抗体片段，fab分子，交换fab分子，单链fab分子，fv分子，scfv分子，单域抗体，avh和支架抗原结合蛋白组成的组。在另一个方面，本发明提供包含一个或多个能够与tnc特异性结合的模块的抗原结合分子。包含如本文中描述的tnc结合模块的本发明分子具有较高的对一种或多种tnc域的亲和力和/或交叉物种反应性。在一个实施方案中，本发明的抗tnc抗原结合分子包含至少一种(例如一种，两种，三种，四种，五种，或六种)选自下组的重或轻链互补决定区(cdr)：seqidno:55，seqidno:56，seqidno:57，seqidno:58，seqidno:59，seqidno:60，seqidno:67，seqidno:68，seqidno:69，seqidno:70，seqidno:71和seqidno:72，或其变异或截短形式(其至少含有特异性决定残基(sdr))，作为所述cdr。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含至少一种，至少两种，或所有三种重链cdr(hcdr)序列，其选自(a)包含选自由seqidno:67和seqidno:70组成的组的氨基酸序列的hcdr1；(b)包含选自由seqidno:68和seqidno:71组成的组的氨基酸序列的hcdr2；和(c)包含选自由seqidno:69和seqidno:72组成的组的氨基酸序列的hcdr3。在又一个实施方案中，该抗原结合分子包含重链可变区，其包含(a)选自由seqidno:67和seqidno:70组成的组的重链cdr1；(b)选自由seqidno:68和seqidno:71组成的组的重链cdr2；和(c)选自由seqidno:69和seqidno:72组成的组的重链cdr3，或其变异或截短形式(其至少含有sdr)，作为所述cdr。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含至少一种，至少两种，或所有三种轻链cdr(lcdr)序列，其选自(a)包含选自由seqidno:55和seqidno:58组成的组的氨基酸序列的lcdr1；(b)包含选自由seqidno:56和seqidno:59组成的组的氨基酸序列的lcdr2；和(c)包含选自由seqidno:57和seqidno:60组成的组的氨基酸序列的lcdr3。在又一个实施方案中，该抗原结合分子包含轻链可变区，其包含(a)选自由seqidno:55和seqidno:58组成的组的轻链cdr1；(b)选自由seqidno:56和seqidno:59组成的组的轻链cdr2；和(c)选自由seqidno:57和seqidno:60组成的组的轻链cdr3，或其变异或截短形式(其至少含有的sdr)，作为所述cdr。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含选自由seqidno:67和seqidno:70组成的组的重链cdr1；选自由seqidno:68和seqidno:71组成的组的重链cdr2；和选自由seqidno:69和seqidno:72组成的组的重链cdr3，该轻链可变区包含选自由seqidno:55和seqidno:58组成的组的轻链cdr1；选自由seqidno:56和seqidno:59组成的组的轻链cdr2；和由seqidno:57和seqidno:60组成的组轻链cdr3，或其变异或截短形式(其至少含有sdr)，作为所述cdr。在还有另一个具体实施方案中，本发明的抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含seqidno:67的重链cdr1；seqidno:68的重链cdr2；和seqidno:69的重链cdr3，该轻链可变区包含seqidno:55的轻链cdr1；seqidno:56的轻链cdr2；和seqidno:57的轻链cdr3。在还有另一个具体实施方案中，本发明的抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含seqidno:70的重链cdr1；seqidno:71的重链cdr2；和seqidno:72的重链cdr3，该轻链可变区包含seqidno:58的轻链cdr1；seqidno:59的轻链cdr2；和seqidno:60的轻链cdr3。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含重链可变区(vh)，该重链可变区(vh)包含与选自由seqidno:46和seqidno:48组成的组的序列具有至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗原结合分子包含重链可变区，该重链可变区包含选自由seqidno:46和seqidno:48组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的vh序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗tnc抗原结合分子保留结合tnc的能力。在某些实施方案中，已经在seqidno:46或seqidno:48中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在hvr或cdr外部的区域(即在fr中)发生替代，插入，或删除。任选地，依照本发明的抗tnc抗原结合分子包含seqidno:46或seqidno:48中的vh序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特别的实施方案中，vh包含1，2或3个选自seqidno:67，seqidno:68，seqidno:69，seqidno:70，seqidno:71和seqidno:72所示序列的重链cdr作为hcdr1，hcdr2和hcdr3。在另一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含与选自由seqidno:45和seqidno:47组成的组的序列具有至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列。在还有另一个实施方案中，该抗原结合分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含选自由seqidno:45和seqidno:47组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的vl序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗tnc抗原结合分子保留结合tnc的能力。在某些实施方案中，已经在seqidno:45或seqidno:47中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在hvr或cdr外部的区域(即在fr中)发生替代，插入，或删除。任选地，本发明的抗tnc抗原结合分子包含seqidno:45或seqidno:47中的vl序列，包括该序列的翻译后修饰序列。在一个特别的实施方案中，vl包含1，2或3个选自seqidno:55，seqidno:56，seqidno:57，seqidno:58，seqidno:59和seqidno:60所示序列的轻链cdr作为lcdr1，lcdr2和lcdr3。在另一个方面，提供了抗tnc抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含如上文提供的任何实施方案中的vh和如上文提供的任何实施方案中的vl。在一个实施方案中，该抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含与选自seqidno:46和seqidno:48的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与选自seqidno:45和seqidno:47的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗原结合分子包含分别在seqidno:46或seqidno:48和seqidno:45或seqidno:47中的vh和vl序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含seqidno:46的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:45的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含seqidno:48的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:47的氨基酸序列。在一个特别的实施方案中，依照任何上述实施方案的抗原结合分子额外包含fc区或与免疫球蛋白fc区等同的区域。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含fc区，特别是iggfc区，最特别地igg1fc区。在一个特别的实施方案中，本发明的抗原结合分子是全长抗体，特别是igg类抗体，最特别地igg1同种型抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗原结合分子的tnc结合模块是抗体片段，其选自下组：scfv片段，fv片段，fab片段，和f(ab’)2片段。在又一个实施方案中，本发明的抗原结合分子是具有fc区的抗体片段，或包含与免疫球蛋白fc区等同的区域的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子是单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子是嵌合的，最特别地人源化的。在一个特别的实施方案中，本发明的抗原结合分子是人的。在另一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含人恒定区。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含人fc区，优选人iggfc区，最特别是人igg1fc区。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含重链恒定区，其中所述重链恒定区是人igg恒定区，特别是人igg1恒定区，其包含fc区。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含重链区，其中所述重链区是人igg重链区，特别是人igg1重链区，其包含fc区。在一个具体的实施方案中，该抗原结合分子包含重链区，其包含选自由seqidno:78，seqidno:80，seqidno:83，和seqidno:84组成的组的氨基酸序列。在另一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合分子包含轻链区，其包含选自由seqidno:77和seqidno:79组成的组的氨基酸序列。在还有另一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合分子包含重链区和轻链区，该重链区包含氨基酸序列seqidno:78，该轻链区包含氨基酸序列seqidno:77。在还有另一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合分子包含重链区和轻链区，该重链区包含氨基酸序列seqidno:80，该轻链区包含氨基酸序列seqidno:79。在一个特定实施方案中，本发明提供包含fc区或与免疫球蛋白fc区等同的区域的特异性结合tnc的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含a)包含与选自由seqidno:78和seqidno:80组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链区，或包含与选自由seqidno:77和seqidno:79组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链区，或其组合。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子以低于约1μm至约0.001nm的解离常数(kd)值，特别是低于约100nm，低于约10nm，或低于约1nm的kd值结合生腱蛋白-c(tnc)。在一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合分子以低于约1nm的解离常数(kd)值结合人生腱蛋白-c(tnc)。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子结合人，小鼠，和食蟹猴tnc。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子具有交叉物种反应性。在另一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合分子结合人，小鼠，和食蟹猴tnc的c域。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子具有交叉物种反应性。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子以低于约100nm，低于10nm，低于5nm或低于2nm的kd值结合人，小鼠和食蟹猴tnc中至少一种。在一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合分子以低于约2nm的kd值结合人，小鼠和食蟹猴tnc中至少一种。在又一些实施方案中，本发明的抗原结合分子以第一kd值kd1结合人tnc，其中所述抗原结合分子以第二kd值kd2结合小鼠tnc，且其中所述抗原结合分子以第三kd值kd3结合食蟹猴tnc，其中所有选自由kd1，kd2和kd3组成的组的kd值低于约10nm，低于约5nm或低于约2nm。在还有又一些实施方案中，本发明的抗原结合分子以第一kd值kd1结合人tnc，其中所述抗原结合分子以第二kd值kd2结合小鼠tnc，且其中所述抗原结合分子以第三kd值kd3结合食蟹猴tnc，其中所有选自由kd1，kd2和kd3组成的组的kd值在10nm至0.1nm的范围中，在5nm至0.1nm的范围中或在2nm至0.1nm的范围中。在又一个实施方案中，本发明的抗体以第一kd值kd1结合人tnc，其中所述抗体以第二kd值kd2结合小鼠tnc，且其中所述抗体以第三kd值kd3结合食蟹猴tnc，其中所有选自由kd1，kd2和kd3组成的组的kd值在因数为20的kd范围中。在又一个实施方案中，本发明的抗体以第一kd值kd1结合人tnc，其中所述抗体以第二kd值kd2结合小鼠tnc，且其中所述抗体以第三kd值kd3结合食蟹猴tnc，其中所有选自由kd1，kd2和kd3组成的组的kd值在因数为10的kd范围中。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子是对至少一种选自由a1，a2，a3，a4，b，ad1，ad2，c和d组成的组的tnc域特异性的。在一个实施方案中，提供抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合至少一种选自由a1，a4和c组成的组的tnc域。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子是对tnc域a1和a4特异性的。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子是对tnc域c特异性的。在一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合分子结合人，小鼠，和食蟹猴tnc的a1和a4域。在另一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合分子结合人，小鼠，和食蟹猴tnc的c域。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子具有交叉物种反应性。在一个更具体的实施方案中，本发明的抗原结合分子以低于约100nm，低于约10nm，低于约5nm或低于约2nm的kd值结合人，小鼠和食蟹猴tnca1的a1域和人，小鼠和食蟹猴tnca4的a4域。作为fab或igg使用抗体，通过表面等离振子共振测定kd值。在一个实施方案中，本发明的抗tnc抗原结合分子结合人组织中的tnc。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含fc区，其中所述抗原结合分子包含fc区中的至少一处氨基酸替代。在一个实施方案中，本发明的包含fc区中的至少一处氨基酸替代的抗原结合分子与包含亲本非替代fc区的抗原结合分子相比具有降低的效应器功能和/或降低的fc受体结合亲和力。在一个具体的实施方案中，所述亲本非替代fc区包含氨基酸残基leu234，leu235和pro329，其中替代fc区相对于亲本非替代fc区包含至少一处选自由leu234ala，leu235ala和pro329gly组成的组的氨基酸替代。在一个特定实施方案中，本发明提供特异性结合tnc的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含a)包含与选自由seqidno:83和seqidno:84组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链区和包含与选自由seqidno:77和seqidno:79组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链区。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含包含选自seqidno:83和seqidno:84的组的氨基酸序列的重链区。在又一个实施方案中，包含替代fc区的抗原结合分子与包含亲本非替代重链区的抗原结合分子相比具有降低的效应器功能和/或降低的fc受体结合亲和力。在又一个具体的实施方案中，本发明的包含所述替代fc区的抗原结合分子相对于亲本非替代fc区包含氨基酸替代leu234ala，leu235ala和pro329gly，其中对fcγr和c1q的结合消除和/或其中fc介导的效应器功能消除。在一个特定实施方案中，降低的效应器功能是降低的adcc。在另一个特定实施方案中，降低的效应器功能是消除的adcc。降低的fc受体结合优选是降低的对激活性fc受体，最优选fcγriiia的结合。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子在以治疗有效量对个体施用时不引起临床显著水平的毒性。在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合tnc的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含a)重链可变区或轻链可变区，该重链可变区包含与选自由seqidno:46和seqidno:48组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与选自由seqidno:45和seqidno:47组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列，或其组合，和b)fc区或与免疫球蛋白fc区等同的区域。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含fc区，其中所述fc区是糖工程化的fc区。在又一个实施方案中，本发明的抗原结合分子经过糖工程化改造成具有fc区中修饰的寡糖。在一个具体的实施方案中，与非糖工程化抗原结合分子相比，该抗原结合分子具有fc区中比例升高的两分型寡糖。在一个更具体的实施方案中，该抗原结合分子的fc区中至少约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约100％，优选至少约50％，更优选至少约70％的n连接寡糖是两分型的。该两分型寡糖可以是杂合物或复合物类型。在另一个具体的实施方案中，与非糖工程化抗原结合分子相比，本发明的抗原结合分子具有fc区中比例升高的非岩藻糖基化寡糖。在一个更具体的实施方案中，该抗原结合分子的fc区中至少约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约100％，优选至少约50％，更优选至少约70％的n连接寡糖是非岩藻糖基化的。该非岩藻糖基化寡糖可以是杂合物或复合物类型。在一个特别的实施方案中，与非糖工程化抗原结合分子相比，本发明的抗原结合分子具有fc区中比例升高的两分型，非岩藻糖基化寡糖。具体地，该抗原结合分子包含fc区，其中至少约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约100％，优选至少约15％，更优选至少约25％，至少约35％或至少约50％的n连接寡糖是两分型，非岩藻糖基化的。该两分型，非岩藻糖基化寡糖可以是杂合物或复合物类型。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子具有升高的效应器功能和/或升高的fc受体结合亲和力。升高的效应器功能和/或升高的fc受体结合可源自例如抗体的糖工程和/或亲和力成熟。在一个实施方案中，升高的效应器功能和/或升高的fc受体结合是糖工程化改造抗原结合分子fc区的结果。在另一个实施方案中，升高的效应器功能和/或升高的fc受体结合是升高的亲和力和糖工程组合的结果。升高的效应器功能可包括但不限于下述一项或多项：升高的fc介导的细胞的细胞毒性(包括升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc))，升高的抗体依赖性细胞的吞噬(adcp)，升高的细胞因子分泌，升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，升高的对nk细胞的结合，升高的对巨噬细胞的结合，升高的对单核细胞的结合，升高的对多形核细胞的结合，升高的诱导凋亡的直接信号传导，升高的靶物结合的抗体的交联，升高的树突细胞成熟，或升高的t细胞引发。在一个特别的实施方案中，升高的效应器功能是升高的adcc。升高的fc受体结合优选升高对fc激活受体的结合，最优选对fcγriiia的结合。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子在以治疗有效量对个体施用时不引起临床显著水平的毒性。在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合tnc的a1和a4域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区，轻链可变区，和人iggfc区，该重链可变区包含seqidno:46的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:45的氨基酸序列。在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合tnc的c域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区，轻链可变区，和人iggfc区，该重链可变区包含seqidno:48的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:47的氨基酸序列。在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合tnc的a1和a4域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区，轻链可变区，和人iggfc区，该重链可变区包含seqidno:46的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:45的氨基酸序列，且其中所述抗原结合分子糖工程化改造成具有升高的效应器功能和/或fc受体结合亲和力。在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合tnc的c域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区，轻链可变区，和人iggfc区，该重链可变区包含seqidno:48的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:47的氨基酸序列，且其中所述抗原结合分子糖工程化改造成具有升高的效应器功能和/或fc受体结合亲和力。在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合tnc的a1和a4域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区，轻链可变区，和人iggfc区，该重链可变区包含seqidno:46的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:45的氨基酸序列，其中所述抗原结合分子包含fc区中的至少一处氨基酸替代，其中亲本非替代fc区包含氨基酸残基leu234，leu235和pro329，其中替代fc区相对于亲本非替代fc区包含至少一处选自由leu234ala，leu235ala和pro329gly组成的组的氨基酸替代，其中包含替代fc区的抗原结合分子具有与包含亲本非替代fc区的抗原结合分子相比降低的效应器功能和/或降低的fc受体结合亲和力。在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合tnc的c域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区，轻链可变区，和人iggfc区，该重链可变区包含seqidno:48的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:47的氨基酸序列，其中所述抗原结合分子包含fc区中的至少一处氨基酸替代，其中亲本非替代fc区包含氨基酸残基leu234，leu235和pro329，其中替代fc区相对于亲本非替代fc区包含至少一处选自由leu234ala，leu235ala和pro329gly组成的组的氨基酸替代，其中包含替代fc区的抗原结合分子具有与包含亲本非替代fc区的抗原结合分子相比降低的效应器功能和/或降低的fc受体结合亲和力。在一个特定实施方案中，本发明提供特异性结合tnc的a1和a4域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含(a)seqidno:67的重链cdr1；(b)seqidno:68的重链cdr2；和(c)seqidno:69的重链cdr3，该轻链可变区包含(a)seqidno:55的轻链cdr1；(b)seqidno:56的轻链cdr2；和(c)seqidno:57的轻链cdr3。在一个特定实施方案中，本发明提供特异性结合tnc的c域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含(a)seqidno:70的重链cdr1；(b)seqidno:71的重链cdr2；和(c)seqidno:72的重链cdr3，该轻链可变区包含(a)seqidno:58的轻链cdr1；(b)seqidno:59的轻链cdr2；和(c)seqidno:60的轻链cdr3。在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合tnc的a1和a4域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链区和轻链区，该重链区包含seqidno:78的氨基酸序列，该轻链区包含seqidno:77的氨基酸序列。在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合人，小鼠和食蟹猴tnc的a1和a4域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区，轻链可变区，和人iggfc区，该重链可变区包含seqidno:46的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:45的氨基酸序列。在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合tnc的c域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链区和轻链区，该重链区包含seqidno:80的氨基酸序列，该轻链区包含seqidno:79的氨基酸序列。在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合人，小鼠和食蟹猴tnc的c域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区，轻链可变区，和人iggfc区，该重链可变区包含seqidno:48的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:47的氨基酸序列。在另一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合tnc的a1和a4域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区，轻链可变区，和人iggfc区，该重链可变区包含seqidno:46的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:45的氨基酸序列，且其中所述抗原结合分子具有所述fc区中比例升高的非岩藻糖基化寡糖和/或比例升高的两分型寡糖。在另一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合tnc的c域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含重链可变区，轻链可变区，和人iggfc区，该重链可变区包含seqidno:48的氨基酸序列，该轻链可变区包含seqidno:47的氨基酸序列，且其中所述抗原结合分子具有所述fc区中比例升高的非岩藻糖基化寡糖和/或比例升高的两分型寡糖。在一个方面，本发明提供了特异性结合tnc的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子在该亲本抗原结合分子的至少一种重或轻链cdr中包含至少一处氨基酸替代。例如，该抗原结合分子可以在亲本抗原结合分子的一种或多种高变区或cdr(即1，2，3，4，5，或6种高变区或cdr)中包含至少一处，例如约一处至约十处(即约1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10处)，特别是约两处至约五处替代。另外，与亲本抗原结合分子相比，该抗原结合分子还可包含一种或多种重或轻链的框架区中的一处或多处添加，删除和/或替代。在一个实施方案中，所述至少一种cdr中的至少一处氨基酸替代促成该抗原结合分子的结合亲和力与其亲本抗原结合分子相比升高。在另一个实施方案中，所述抗原结合分子具有比亲本抗原结合分子大至少约2倍至约10倍的对tnc的亲和力(在以相同形式，例如fab形式比较本发明的抗原结合分子和亲本抗原结合分子时)。另外，自亲本抗原结合分子衍生的抗原结合分子可单一地或组合地并入前述段落中涉及本发明抗体描述的任何特征。具有特定tnc结合模块的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子在一个方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc特异性结合的模块包含vh域和vl域，该vh域包含(i)包含seqidno:67或seqidno:70的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:68或seqidno:71的氨基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:69或seqidno:72的氨基酸序列的cdr-h3，该vl域包含(iv)包含seqidno:55或seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:56或seqidno:59的氨基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:57或seqidno:60的氨基酸序列的cdr-l3。在一个特定方面，提供的是本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc特异性结合的模块是能够与tnc特异性结合且包含vh域和vl域的fab分子，该vh域包含(i)包含seqidno:67的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:68的氨基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:69的氨基酸序列的cdr-h3，该vl域包含(iv)包含seqidno:55的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:56的氨基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:57的氨基酸序列的cdr-l3。在另一个方面，提供的是本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与tnc特异性结合的模块是能够与tnc特异性结合且包含vh域和vl域的fab分子，该vh域包含(i)包含seqidno:70的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:71的氨基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:72的氨基酸序列的cdr-h3，该vl域包含(iv)包含seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:59的氨基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:60的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面，能够与tnc特异性结合的模块包含包含seqidno:46的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:45的氨基酸序列的可变轻链或包含seqidno:48的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:47的氨基酸序列的可变轻链。在又一个方面，能够与tnc特异性结合的模块包含包含与seqidno:46的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno:45的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个方面，能够与tnc特异性结合的模块包含包含与seqidno:48的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno:47的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区。在一个特定方面，能够与tnc特异性结合的模块包含包含seqidno:46的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:45的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个特定方面，能够与tnc特异性结合的模块包含包含seqidno:48的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:47的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体方面，能够与tnc特异性结合的模块包含由seqidno:46的氨基酸序列组成的vh域和由seqidno:45的氨基酸序列组成的vl域。在又一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)第一重链和第一轻链，这两者构成能够与tnc特异性结合的fab分子，(b)包含选自由seqidno:176，seqidno:184，seqidno:185和seqidno:186组成的组的氨基酸序列的第二重链，和包含选自由seqidno:172，seqidno:174，seqidno:175和seqidno:183组成的组的氨基酸序列的第二轻链。在又一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，其包含包含seqidno:46的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:45的氨基酸序列的轻链可变区，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由seqidno:176，seqidno:184，seqidno:185和seqidno:186组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由seqidno:172，seqidno:174，seqidno:175和seqidno:183组成的组的氨基酸序列。在一个特定方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，其包含包含seqidno:46的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:45的氨基酸序列的轻链可变区，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含seqidno:176的氨基酸序列且该第二多肽包含seqidno:172的氨基酸序列。在一个特定方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，其包含包含seqidno:46的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:45的氨基酸序列的轻链可变区，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含seqidno:184的氨基酸序列且该第二多肽包含seqidno:183的氨基酸序列。在另一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，其包含包含seqidno:48的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:47的氨基酸序列的轻链可变区，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由seqidno:176，seqidno:184，seqidno:185和seqidno:186组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由seqidno:172，seqidno:174，seqidno:175和seqidno:183组成的组的氨基酸序列。在一个特定方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，其包含包含seqidno:48的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:47的氨基酸序列的轻链可变区，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含seqidno:176的氨基酸序列且该第二多肽包含seqidno:172的氨基酸序列。在一个特定方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，其包含包含seqidno:48的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:47的氨基酸序列的轻链可变区，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含seqidno:184的氨基酸序列且该第二多肽包含seqidno:183的氨基酸序列。在一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(i)包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域的第一轻链或包含包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域的第一轻链，(ii)包含seqidno:178的氨基酸序列的第二重链，和(iii)包含seqidno:179的氨基酸序列的第二轻链。在另一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含第一重链和第一轻链，这两者构成能够与tnc特异性结合的fab分子，第二重链，其包含通过第一肽接头彼此连接的在其c端通过第二肽接头与ch1域融合的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，和第二轻链，其包含在其c端通过第三肽接头与cl域融合的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，且其中该抗原结合分子包含(i)包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域的第一轻链或包含包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域的第一轻链，(ii)包含seqidno:178的氨基酸序列的第二重链，和(iii)包含seqidno:179的氨基酸序列的第二轻链。在又一个特定方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含第一重链和第一轻链，这两者构成能够与tnc特异性结合的fab分子，第二重链，其包含通过第一肽接头彼此连接的在其c端通过第二肽接头与cl域融合的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，和第二轻链，其包含在其c端通过第三肽接头与ch1域融合的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，且其中该分子包含(i)包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域的第一轻链或包含包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域的第一轻链，(ii)包含选自由seqidno:102，seqidno:108，seqidno:116和seqidno:120组成的组的氨基酸序列的第二重链，和(iii)包含选自由seqidno:103，seqidno:109，seqidno:117和seqidno:121组成的组的氨基酸序列的第二轻链。在另一个方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(i)包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域的第一轻链或包含包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域的第一轻链，(ii)包含选自由seqidno:102，seqidno:108，seqidno:116和seqidno:120组成的组的氨基酸序列的第二重链，和(iii)包含选自由seqidno:103，seqidno:109，seqidno:117和seqidno:121组成的组的氨基酸序列的第二轻链。在还有另一个方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽含有ch3域且该第二多肽含有相应的ch3域，且其中该第一多肽包含通过肽接头与该ch3域的c端且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的ch3域的c端连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。在又一个方面，本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域的亚基之一的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域的另一亚基的c端且其中该包含tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽包含选自由seqidno:176和seqidno:184组成的组的氨基酸序列且该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽包含选自由seqidno:172和seqidno:183组成的组的氨基酸序列。在一个方面，该包含tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽包含seqidno:176的氨基酸序列且该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽包含seqidno:172的氨基酸序列。在一个特定方面，该包含tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽包含seqidno:184的氨基酸序列且该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽包含seqidno:183的氨基酸序列。在一个方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)一个能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域的亚基之一的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域的另一亚基的c端。本发明如此涉及含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子对于结合靶细胞抗原是单价的。在又一个方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，其包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域和包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域，或包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域和包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域的亚基之一的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域的另一亚基的c端。在另一个方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，其包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域和包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域，或包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域和包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域的亚基之一的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域的另一亚基的c端且其中该包含tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽包含选自由seqidno:176和seqidno:184组成的组的氨基酸序列且该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽包含选自由seqidno:172和seqidno:183组成的组的氨基酸序列。在一个特定方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，其包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域和包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，和(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域的亚基之一的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域的另一亚基的c端且其中该包含tnf配体家族成员的两个胞外域的第一多肽包含氨基酸序列的seqidno:184且该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域的第二多肽包含seqidno:183的氨基酸序列。在另一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(i)轻链，其包含能够与tnc特异性结合的fab域的vl域，(ii)融合多肽，其包含fc域的第一亚基和包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域的第一亚基的c端，和(iii)重链，其包含能够与tnc特异性结合的fab域的vh域，该fc域的第二亚基和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该能够与tnc特异性结合的fab域的可变重链在其c端融合至该fc域的第二亚基的n端且其中该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽在其n端融合至该fc域的第二亚基的c端。在又一个方面，本发明提供如之前定义的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其进一步包含(d)不能与tnc特异性结合的fab域。如此，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)能够与tnc特异性结合的fab域，(b)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域，(c)包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第一多肽在其n端融合至该fc域的亚基之一的c端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域的另一亚基的c端，和(d)不能与靶细胞抗原特异性结合的fab域。在本发明的又一个特定方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)第一重链和第一轻链，这两者构成能够与tnc特异性结合的fab分子，其中该第一重链包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域且该第一轻链包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域，和(b)第二重链，其包含通过第一肽接头彼此连接的在其c端通过第二肽接头与cl域融合的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，和第二轻链，其包含在其c端通过第三肽接头与ch1域融合的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中该第二重链包含seqidno:116或seqidno:120的氨基酸序列，且该第二轻链包含seqidno:117或seqidno:121的氨基酸序列。特别地，该第二重链包含seqidno:116的氨基酸序列且该第二轻链包含seqidno:117的氨基酸序列。而且，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽含有ch3域且该第二多肽含有相应的ch3域，且其中该第一多肽包含通过肽接头与该ch3域的c端且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的ch3域的c端连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。特别地，提供的是如本文中之前描述的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(i)包含seqidno:127的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:125的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链，或(ii)包含seqidno:130的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:131的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链，或(iii)包含seqidno:124的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:133的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链，或(iv)包含seqidno:136的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:137的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链。在一个特定方面，此类含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与tnc特异性结合的模块。在一个方面，本发明提供含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与tnc特异性结合的模块。特别地，提供的是如本文中之前描述的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(i)包含seqidno:112的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:113的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的两条轻链，或(ii)包含seqidno:124的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:125的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的两条轻链。在另一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(i)轻链，其包含能够与tnc特异性结合的fab域的vl域，(ii)融合多肽，其包含fc域的第一亚基和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该第二多肽在其n端融合至该fc域的第一亚基的c端，和(iii)重链，其包含能够与tnc特异性结合的fab域的vh域，该fc域的第二亚基和包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽，其中能够与tnc特异性结合的fab域的可变重链在其c端融合至该fc域的第二亚基的n端且其中该包含tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽在其n端融合至该fc域的第二亚基的c端。在又一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(i)第一轻链，其包含能够与tnc特异性结合的fab域的vl域，(ii)第一重链，其包含能够与tnc特异性结合的fab域的vh域，fc域的第一亚基和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该能够与tnc特异性结合的fab域的可变重链在其c端融合至该fc域的第二亚基的n端且其中该第二多肽在其n端融合至该fc域的第一亚基的c端，(iii)第二重链，其包含不能与靶细胞抗原特异性结合的fab域的vh域，该fc域的第二亚基和包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽，其中该不能与靶细胞抗原特异性结合的fab域的可变重链在其c端融合至该fc域的第二亚基的n端且其中该包含tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽在其n端融合至该fc域的第二亚基的c端，和(iv)第二轻链，其包含该不能与靶细胞抗原特异性结合的fab域的vl域。在另一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(i)第一轻链，其包含能够与tnc特异性结合的fab域的vl域，(ii)第一重链，其包含该能够与tnc特异性结合的fab域的vh域，fc域的第一亚基和和包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一多肽，其中该能够与tnc特异性结合的fab域的可变重链在其c端融合至该fc域的第二亚基的n端且其中该包含tnf配体家族成员的胞外域或其片段的第一多肽在其n端融合至该fc域的第一亚基的c端，(iii)第二重链，其包含不能与靶细胞抗原特异性结合的fab域的vh域，该fc域的第二亚基和包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽，其中该不能与靶细胞抗原特异性结合的fab域的可变重链在其c端融合至该fc域的第二亚基的n端且其中该包含tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二多肽在其n端融合至该fc域的第二亚基的c端，和(iv)第二轻链，其包含该不能与靶细胞抗原特异性结合的fab域的vl域。在又一些特定方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含a)包含与seqidno:104的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一重链，包含与seqidno:77的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一轻链，包含与seqidno:102的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二重链和包含与seqidno:103的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二轻链；或b)包含与seqidno:104的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一重链，包含与seqidno:77的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一轻链，包含与seqidno:108的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二重链和包含与seqidno:109的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二轻链；或(c)包含与seqidno:112的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一重链，包含与seqidno:113的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二重链和包含与seqidno:77的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的两条轻链；或d)包含与seqidno:104的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一重链，包含与seqidno:77的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一轻链，包含与seqidno:116的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二重链和包含与seqidno:117的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二轻链；或e)包含与seqidno:104的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一重链，包含与seqidno:77的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一轻链，包含与seqidno:120的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二重链和包含与seqidno:121的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二轻链；或(f)包含与seqidno:124的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一重链，包含与seqidno:125的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二重链，和包含与seqidno:77的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的两条轻链；或(g)包含与seqidno:127的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一重链，包含与seqidno:128的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二重链，和包含与seqidno:77的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的一条轻链；或(h)包含与seqidno:130的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一重链，包含与seqidno:131的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二重链，和包含与seqidno:77的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的一条轻链；或(i)包含与seqidno:124的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一重链，包含与seqidno:133的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二重链，和包含与seqidno:77的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的一条轻链；或(j)包含与seqidno:136的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第一重链，包含与seqidno:137的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的第二重链，和包含与seqidno:77的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％同一的氨基酸序列的一条轻链。在又一些特定方面，本发明涉及含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其选自由下述各项组成的组：a)一种分子，其包含包含seqidno:104的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:77的氨基酸序列的第一轻链，包含seqidno:102的氨基酸序列的第二重链和包含seqidno:103的氨基酸序列的第二轻链；b)一种分子，其包含包含seqidno:104的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:77的氨基酸序列的第一轻链，包含seqidno:108的氨基酸序列的第二重链和包含seqidno:109的氨基酸序列的第二轻链；(c)一种分子，其包含包含seqidno:112的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:113的氨基酸序列的第二重链和包含seqidno:77的氨基酸序列的两条轻链；d)一种分子，其包含包含seqidno:104的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:77的氨基酸序列的第一轻链，包含seqidno:116的氨基酸序列的第二重链和包含seqidno:117的氨基酸序列的第二轻链；e)一种分子，其包含包含seqidno:104的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:77的氨基酸序列的第一轻链，包含seqidno:120的氨基酸序列的第二重链和包含seqidno:121的氨基酸序列的第二轻链；(f)一种分子，其包含包含seqidno:124的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:125的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的两条轻链；(g)一种分子，其包含包含seqidno:127的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:128的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链；(h)一种分子，其包含包含seqidno:130的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:131的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链；(i)一种分子，其包含包含seqidno:124的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:133的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链；(j)一种分子，其包含包含seqidno:136的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:137的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链。在另一个方面，提供的是含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该tnf配体家族成员是ox40l且其中该靶细胞抗原是生腱蛋白-c(tnc)且该能够与tnc特异性结合的模块包含vh域和vl域，该vh域包含(i)包含seqidno:67或seqidno:70的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:68或seqidno:71的氨基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:69或seqidno:72的氨基酸序列的cdr-h3，该vl域包含(iv)包含seqidno:55或seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:56或seqidno:59的氨基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:57或seqidno:60的氨基酸序列的cdr-l3。在一个特定方面，该含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域的第一轻链或包含包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域的第一轻链，(ii)包含选自由seqidno:195组成的组的氨基酸序列的第二重链，和(iii)包含seqidno:196的氨基酸序列的第二轻链。多核苷酸类本发明进一步提供了编码如本文中描述的抗原结合分子的分离的多核苷酸或其片段。编码本发明的抗原结合分子的分离的多核苷酸可以表述为编码整个抗原结合分子的单个多核苷酸或共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以通过例如二硫键或其它手段联合以形成功能性抗原结合分子。例如，免疫球蛋白的轻链部分可以由与免疫球蛋白的重链部分分开的多核苷酸编码。重链多肽将在共表达时与轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。在一些方面，分离的多核苷酸编码如本文中描述的依照本发明的完整的抗原结合分子。特别地，分离的多核苷酸编码包含在如本文中描述的依照本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子中的多肽。在一个方面，本发明涉及编码含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与tnc特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其两个片段的多肽的序列，和(c)编码包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的多肽的序列。在另一个方面，提供了编码含有4-1bb配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与tnc特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的4-1bbl的两个胞外域或其两个片段的多肽的序列，和(c)编码包含4-1bbl的一个胞外域或其片段的多肽的序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包含编码seqidno:55，seqidno:56，seqidno:57，seqidno:58，seqidno:59，seqidno:60，seqidno:67，seqidno:68，seqidno:69，seqidno:70，seqidno:71和seqidno:72所示一种或多种(例如一种，两种，三种，四种，五种，或六种)重或轻链互补决定区(cdr)，或其变异或截短形式(其至少含有特异性决定残基(sdr))的序列，作为所述cdr。在另一个实施方案中，该多核苷酸包含编码选自seqidno:55，seqidno:56，seqidno:57，seqidno:58，seqidno:59，seqidno:60，seqidno:67，seqidno:68，seqidno:69，seqidno:70，seqidno:71和seqidno:72，或其变异或截短形式(其至少含有sdr)的三种重链cdr(例如hcdr1，hcdr2，和hcdr3)或三种轻链cdr(例如lcdr1，lcdr2，和lcdr3)的序列，作为所述三种互补决定区每一种。在还有另一个实施方案中，该多核苷酸包含编码选自seqidno:55，seqidno:56，seqidno:57，seqidno:58，seqidno:59，seqidno:60，seqidno:67，seqidno:68，seqidno:69，seqidno:70，seqidno:71和seqidno:72的三种重链cdr(例如hcdr1，hcdr2，和hcdr3)和三种轻链cdr(例如lcdr1，lcdr2，和lcdr3)的序列。在一个特别的实施方案中，该多核苷酸编码一种或多种cdr，包含与seqidno:49，seqidno:50，seqidno:51，seqidno:52，seqidno:53，seqidno:54，seqidno:61，seqidno:62，seqidno:63，seqidno:64，seqidno:65和seqidno:66中一种或多种cdr核苷酸序列至少约90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列。在又一个实施方案中，该多核苷酸包含编码选自seqidno:46和seqidno:48的重链可变区的序列和/或编码选自seqidno:45和seqidno:47的轻链可变区的序列。在一个特别的实施方案中，该多核苷酸编码重链和/或轻链可变区，其包含选自由seqidno:41，seqidno:42，seqidno:43和seqidno:44组成的可变区核苷酸序列组的序列，或其组合。在一个具体的实施方案中，该多核苷酸包含编码选自seqidno:46和seqidno:48的重链可变区的序列和编码重链恒定区，特别是人重链恒定区的序列。在一个特别的实施方案中，所述重链恒定区是包含fc区的人igg重链恒定区，具体是人igg1重链恒定区。在另一个具体的实施方案中，该多核苷酸包含编码选自seqidno:45和seqidno:47的轻链可变区的序列和编码轻链恒定区，特别是人轻链恒定区的序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含第一分离的多核苷酸和第二分离的多核苷酸，该第一分离的多核苷酸编码包含与选自由seqidno:77和seqidno:79组成的组的序列至少约90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的氨基酸序列的多肽，该第二分离的多核苷酸编码包含与选自由seqidno:78和seqidno:80组成的组的序列至少约90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含第一分离的多核苷酸和第二分离的多核苷酸，该第一分离的多核苷酸包含与选自由seqidno:77和seqidno:79组成的组的序列至少约90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列，该第二分离的多核苷酸包含与选自由seqidno:83和seqidno:84组成的组的序列至少约90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列。在又一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含编码包含两个4-1bbl片段的多肽的序列，所述两个4-1bbl片段包含与seqidno:172，seqidno:173，seqidno:174，seqidno:175或seqidno:183所示氨基酸序列具有至少约90％，95％，98％或100％同一性的氨基酸序列，并且涉及多核苷酸，其包含编码包含一个4-1bbl片段的多肽的序列，所述一个4-1bbl片段包含与seqidno:172，seqidno:173，seqidno:174，seqidno:175或seqidno:183所示氨基酸序列具有至少约90％，95％，98％或100％同一性的氨基酸序列。此外，提供了编码含有ox40配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与tnc特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的ox40l的两个胞外域或其两个片段的多肽的序列，和(c)编码包含ox40l的一个胞外域或其片段的多肽的序列。在另一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含编码包含两个4-1bbl片段的多肽的序列，所述两个4-1bbl片段包含与seqidno:181或seqidno:182所示氨基酸序列至少约90％，95％，98％或100％同一的氨基酸序列，并且涉及多核苷酸，其包含编码包含一个4-1bbl片段的多肽的序列，所述一个4-1bbl片段包含与seqidno:181或seqidno:182所示氨基酸序列至少约90％，95％，98％或100％同一的氨基酸序列。在另外的方面，本发明涉及包含与本文中公开的特定cdna序列至少约90％，95％，98％或100％同一的序列的多核苷酸。在一个特定方面，本发明涉及包含与本文中公开的特定cdna序列之一相同的序列的多核苷酸。在其它方面，核酸分子包含编码在seqidno:176，177，184，185，186，187，188或189任一者中提出的氨基酸序列的核苷酸序列或由其组成。在又一个方面，核酸分子包含编码在seqidno:102，103，104，108，109，112，113，116，117，120，121，124，125，127，130，131，133，136，137，178和179任一者中提出的氨基酸序列的核苷酸序列或由其组成。还在其它方面，核酸分子包含核苷酸序列seqidno:41，42，43，44，49，50，51，52，53，54，61，62，63，64，65，66，73，74，75，76，81，82，88，89，90，91，96，98，99，100，106，107，110，111，114，115，118，119，122，123，126，128，129，132，134或135或由其组成。在某些方面，多核苷酸或核酸是dna。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是rna，例如呈信使rna(mrna)的形式。本发明的rna可以是单链或双链的。重组方法可以例如通过固态肽合成(例如merrifield固相合成)或重组生产获得本发明的抗原结合分子。对于重组生产，分离一个或多个编码例如上文所述的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸，并将其插入到一个或多个载体中用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用常规程序容易地分离此类多核苷酸并将其测序。在本发明的一个方面，提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的载体，优选表达载体。可使用本领域技术人员熟知的方法构建包括抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术，合成技术和体内重组/遗传重组。见，例如描述于maniatis等人，molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,n.y.(1989)；和ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociatesandwileyinterscience,n.y.(1989)中的技术。表达载体可以是质粒，病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括将编码抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即，编码区)与启动子和/或其它转录或翻译控制元件以可操作地关联的方式克隆到其中的表达盒。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的部分。虽然“终止密码子”(tag，tga或taa)不翻译成氨基酸，但如果存在的话，它可被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列，例如启动子，核糖体结合位点，转录终止子，内含子，5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。在单个多核苷酸构建体中，例如，在单个载体上，或在分开的多核苷酸构建体中，例如，在分开的(不同的)载体上可以存在两个或更多个编码区。此外，任何载体可以包含单个编码区，或者可以包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一条或多条多肽，其通过蛋白水解切割在翻译后或以共翻译方式分离成最终的蛋白质。另外，本发明的载体，多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明的抗原结合分子或其多肽片段或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能域。可操作地关联是指这样一种方式：基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调节序列相关联以使基因产物的表达在调节序列的影响或控制下进行。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mrna的转录，并且如果两个dna片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或不干扰dna模板被转录的能力，则所述两个dna片段(例如多肽编码区和与其关联的启动子)是“可操作地关联的”。因此，如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录，则启动子区与该核酸可操作地关联。启动子可以是仅在预定细胞中指导实质性dna转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外，其它转录控制元件例如增强子，操纵子，阻抑物和转录终止信号，可与多核苷酸可操作地关联以指导细胞特异性转录。本文中公开了适合的启动子和其它转录控制区。许多转录控制区是本领域中的技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子，与内含子a联合)，猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如，例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括衍生自脊椎动物基因如肌动蛋白，热休克蛋白，牛生长激素和兔α珠蛋白的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，许多翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点，翻译起始和终止密码子以及衍生自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点或ires，也称为cite序列)。表达盒还可以包括诸如复制起点的其它特征，和/或诸如逆转录病毒长末端重复序列(ltr)或腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的染色体整合元件。本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌肽或信号肽的编码区相关联，所述分泌肽或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果希望分泌抗原结合分子或其多肽片段，则编码信号序列的dna可以位于编码本发明的抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，所述信号肽或分泌前导序列在起始生长蛋白质链输出穿过粗面内质网后被从成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道，脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽的n端融合的信号肽，其被从翻译的多肽切割下来以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中，使用了天然信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的功能衍生物，所述衍生物保留了指导与其可操作地相关联的多肽分泌的能力。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以替代为人组织纤溶酶原激活物(tpa)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列。编码可用于促进后续纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的dna可以包括在编码本发明的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。在本发明的又一个方面，提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含一个或多个本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可分别掺入关于核苷酸和载体的单一或组合地在本文中描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的抗原结合分子的(一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。可以使用特定的表达载体适当地转染或转导此类细胞，并且可以培养大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵罐以获得足够量的用于临床应用的抗原结合分子。适合的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(cho)，昆虫细胞等。例如，尤其是在不需要糖基化时，可以在细菌中产生多肽。表达后，可以从细菌细胞糊分离出作为可溶性级分的多肽，并可将其进一步纯化。除了原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是编码多肽的载体的适合克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的导致产生具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。见gerngross,natbiotech22,1409-1414(2004)，和li等人，natbiotech24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的适合宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞结合使用尤其是用于转染草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可以用作宿主。见例如美国专利nos.5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978，和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的plantibodiestm技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是经sv40(cos-7)转化的猴肾cv1系；人胚胎肾细胞系(例如，在graham等人，jgenvirol36,59(1977)中描述的293或293t细胞)；仓鼠婴肾细胞(bhk)；小鼠塞托里细胞(如在mather,biolreprod23,243-251(1980)所述的tm4细胞)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck)；牛鼠(buffalorat)肝细胞(brl3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hepg2)；小鼠乳房肿瘤细胞(mmt060562)；tri细胞(如在mather等人，annalsn.y.acadsci383,44-68(1982)中描述)；mrc5细胞和fs4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub等人，procnatlacadsciusa77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如yo，ns0，p3x63和sp2/0。对于适用于蛋白质产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如yazaki和wu,methodsinmolecularbiology,vol.248(b.k.c.lo,ed.,humanapress,totowa,nj),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞，酵母细胞，昆虫细胞，细菌细胞和植物细胞，在此仅列举少数，还有包括在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞，人胚胎肾(hek)细胞或淋巴样细胞(例如y0，ns0，sp20细胞)。在这些系统中表达外源基因的标准技术在本领域中是已知的。可以将表达包含免疫球蛋白重链或轻链的多肽的细胞工程化，以便也表达另一个免疫球蛋白链，使得所表达的产物是具有重链和轻链两者的免疫球蛋白。在一个方面，提供了产生本发明的抗原结合分子或其多肽片段的方法，其中所述方法包括在适于表达本发明的抗原结合分子或其多肽片段的条件下培养在本文中提供的包含编码本发明的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收本发明的抗原结合分子或其多肽片段。在本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子中，多个组分(能够与tnc特异性结合的至少一个模块，包含tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的一条多肽，包含所述tnf家族配体家族成员的一个胞外域或其片段的一条多肽)在遗传上不彼此融合。多肽被设计成使得其组分(tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段和其它成分如ch或cl)直接地或通过接头序列彼此融合。可以根据本领域熟知的方法测定接头的组成和长度，并且可以测试其效果。本发明的抗原结合分子的不同组分之间的接头序列的实例见本文中提供的序列。如果需要的话，还可以包括另外的序列，例如内肽酶识别序列，以便组入切割位点来分开融合蛋白的各个组分。在某些实施方案中，形成抗原结合分子的一部分的能够与tnc特异性结合的模块(例如fab片段)至少包含能够与抗原结合的免疫球蛋白可变区。可变区可以形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并且自其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(见例如harlow和lane,"antibodies,alaboratorymanual",coldspringharborlaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如美国专利no.4,186,567中所述)，或者可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库而获得(见例如授予mccafferty的美国专利no.5,969,108)。任何动物物种的免疫球蛋白都可用于本发明。可用于本发明的非限制性免疫球蛋白可以是鼠，灵长类，或人来源的。如果预期融合蛋白用于人类使用，则可以使用免疫球蛋白的嵌合形式，其中免疫球蛋白的恒定区域来自人。还可以根据本领域熟知的方法制备免疫球蛋白的人源化或完全人形式(见例如授予winter的美国专利no.5,565,332)。人源化可以通过各种方法来实现，包括但不限于(a)将非人(例如，供体抗体)cdr移植到人(例如受体抗体)框架和具有或不具有关键框架残基(例如，对于保留良好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)保留的恒定区，(b)仅将非人特异性决定区(sdr或a-cdr；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)移植到人框架和恒定区，或(c)移植整个非人可变域，但通过替换表面残基用类似于人的区段将其“遮盖”。人源化抗体及其制备方法综述于，例如，almagro和fransson,frontbiosci13,1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如riechmann等人，nature332,323-329(1988)；queen等人，procnatlacadsciusa86,10029-10033(1989)；美国专利no.5,821,337，7,527,791，6,982,321，和7,087,409；jones等人，nature321,522-525(1986)；morrison等人，procnatlacadsci81,6851-6855(1984)；morrison和oi,advimmunol44,65-92(1988)；verhoeyen等人，science239,1534-1536(1988)；padlan,molecimmun31(3),169-217(1994)；kashmiri等人，methods36,25-34(2005)(描述sdr(a-cdr)移植)；padlan,molimmunol28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；dall’acqua等人，methods36,43-60(2005)(描述“fr改组”)；以及osbourn等人，methods36,61-68(2005)和klimka等人，brjcancer83,252-260(2000)(描述用于fr改组的“导向选择”办法)。依照本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体通常描述于vandijk和vandewinkel,curropinpharmacol5,368-74(2001)以及lonberg,curropinimmunol20,450-459(2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并且可以从其衍生(见，例如，monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(marceldekker,inc.,newyork,1987))。人抗体和人可变区还可以通过向转基因动物施用免疫原加以制备，所述转基因动物已经被修饰以产生响应抗原攻击的完整人抗体或具有人可变区的完整抗体(见，例如，lonberg,natbiotech23,1117-1125(2005)。也可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的fv克隆可变区序列来产生人抗体和人可变区(见，例如，hoogenboom等人，引自methodsinmolecularbiology178,1-37(o’brien等人编辑，humanpress,totowa,nj,2001)；和mccafferty等人，nature348,552-554；clackson等人，nature352,624-628(1991))。噬菌体通常以单链fv(scfv)片段或fab片段的形式展示抗体片段。在某些方面，根据例如pct公开wo2012/020006或美国专利申请公开no.2004/0132066中公开的方法，将包含在本发明的抗原结合分子中的能够与靶细胞抗原特异性结合的模块(例如fab片段)工程化，以具有增强的结合亲和力。本发明抗原结合分子与特异性抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量，例如，表面等离振子共振技术(liljeblad等人，glycoj17,323-329(2000)))和传统结合测定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))。可使用竞争测定法鉴定与参照抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施方案中，这种竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与参照抗原结合分子结合的相同。用于抗原结合分子所结合的表位作图的详细的示例性方法提供于morris(1996)“epitopemappingprotocols”,inmethodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中。在示例性竞争测定中，将固定化抗原在包含与抗原结合的第一经标记的抗原结合分子和第二未标记的抗原结合分子的溶液中温育，测试第二未标记的抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合该抗原的能力。第二抗原结合分子可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化抗原在包含第一经标记的抗原结合分子但不包含第二未标记的抗原结合分子的溶液中温育。在允许第一抗体与抗原结合的条件下温育之后，去除过量未结合的抗体，并测量与固定化抗原结合的标记物的量。如果在测试样品中与固定化抗原结合的标记物的量相对于对照样品实质性降低，则表明第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合该抗原。见harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanualch.14(coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny)。可以通过本领域已知的技术如高效液相层析术，离子交换层析术，凝胶电泳，亲和层析术，大小排阻层析术等来纯化如本文中描述制备的本发明的抗原结合分子。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分地取决于诸如净电荷，疏水性，亲水性等因素，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。对于亲和层析术纯化，可以使用与抗原结合分子结合的抗体，配体，受体或抗原。例如，为了本发明的融合蛋白的亲和层析术纯化，可以使用具有蛋白a或蛋白g的基质。可以基本上如实施例中描述依次使用蛋白a或g亲和层析术和大小排阻层析术分离抗原结合分子。抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种加以测定，包括凝胶电泳，高压液相层析术等。例如，正如通过还原和非还原性sds-page证实，如通过实施例中描述表达的抗原结合分子被显示为是完整且正确组装的。测定法可以通过本领域已知的各种测定法来鉴定，筛选或通过其物理/化学性质和/或生物学活性来表征在本文中提供的抗原结合分子。1.亲和力测定法根据实施例中提出的通过表面等离振子共振(spr)的方法，使用标准仪器如biacore仪器(gehealthcare)，以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白，可以测定在本文中提供的抗原结合分子对tnc和/或相应的tnf受体的亲和力。通过表面等离振子共振(spr)，使用标准仪器如biacore仪器(gehealthcare)，以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白，也可以测定含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子对靶细胞抗原的亲和力。在实施例4中描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案。根据一个方面，使用t100仪(gehealthcare)通过表面等离振子共振在25℃测量kd。2.结合测定法和其它测定法例如通过流式细胞术(facs)，使用表达特定受体或靶细胞抗原的细胞系，可以评价在本文中提供的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子与相应的受体表达细胞的结合。在一个方面，在结合测定法中使用表达tnf受体的新鲜外周血单核细胞(pbmc)。在分离后(幼稚pmbc)或刺激后(激活的pmbc)直接使用这些细胞。在另一个方面，使用激活的小鼠脾细胞(表达tnf受体分子)来证明本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子与相应的tnf受体表达细胞的结合。在又一个方面，使用表达tnc的癌细胞系来证明抗原结合分子与靶细胞抗原的结合。在另一个方面，可以使用竞争测定法来鉴定与特异性抗体或抗原结合分子分别竞争结合靶标或tnf受体的抗原结合分子。在某些实施方案中，这种竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与特异性抗靶标抗体或特异性抗tnf受体抗体结合的相同。用于抗体所结合的表位的作图的详细示例性方法提供于morris(1996)“epitopemappingprotocols,”inmethodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中。3.活性测定法在一个方面，提供了用于鉴定与特定靶细胞抗原和具有生物学活性的特定tnf受体结合的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的测定法。生物学活性可以包括例如通过表达靶细胞抗原的细胞上的tnf受体的激动性信号传导。还提供了通过测定法鉴定为具有此类体外生物学活性的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子。在某些方面，测试了本发明的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的这种生物学活性。用于检测本发明分子的生物学活性的测定法是实施例12中所述的那些。此外，用于检测细胞裂解的测定法(例如通过测量ldh释放)，诱导的凋亡动力学(例如通过测量半胱天冬酶3/7活性)或凋亡(例如使用tunel测定)是本领域熟知的。另外，可以通过评估复合物对各种淋巴细胞子集如nk细胞，nkt细胞或γδt细胞的存活，增殖和淋巴因子分泌的影响，或评估其调节抗原呈递细胞如树突细胞，单核细胞/巨噬细胞或b细胞的表型和功能的能力来评估此类复合物的生物学活性。药物组合物，制剂和施用途径在又一个方面，本发明提供了包含本文中提供的任一种抗原结合分子的药物组合物，以供例如在任何下列治疗方法中使用。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种抗原结合分子和至少一种另外的例如如下文所述的治疗剂。本发明的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种溶解或分散在药学上可接受的赋形剂中的抗原结合分子。短语“药学的或药学上可接受的”是指在采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒的分子实体和组合物，即在适当施用于动物时例如人时不产生不利的，过敏的或其它不良的反应。根据本公开内容，包含至少一种抗原结合分子和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将是本领域技术人员已知的，如remington'spharmaceuticalsciences第18版，mackprintingcompany,1990所例示，通过提述将其并入本文。特别地，组合物是冻干制剂或水溶液。如本文中使用的，正如本领域普通技术人员已知，“药学上可接受的赋形剂”包括溶剂，缓冲剂，分散介质，包衣，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如抗菌剂，抗真菌剂)，等渗剂，盐，稳定剂中任一种和全部及其组合。肠胃外组合物包括通过注射给药而设计的那些，例如皮下，皮内，病灶内，静脉内，动脉内，肌内，鞘内或腹膜内注射。为了注射，可以将本发明的抗原结合分子配制在水溶液中，优选在生理学相容的缓冲液如汉克斯溶液，林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。溶液可以含有配制剂，例如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，融合蛋白在使用前可处于粉末形式以与适合的载体(例如无菌无热原水)组构。根据需要，通过将在适当溶剂中的本发明融合蛋白以所要求的量并入下文列举的多种其它成分中来制备无菌注射溶液。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和/或其它成分。在用于制备无菌注射溶液，悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，从而产生来自其先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何另外的期望的成分的粉末。必要时应该适当缓冲该液体介质并且在注射之前首先用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂变得等张。在制造和储存条件下该组合物必须是稳定的，并且保持对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。应当理解，内毒素污染应该最低限度地保持在安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。适合的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖类，二糖类，和其它碳水化合物类，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，如edta；糖类，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子，如钠；金属复合物(例如，zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(peg)。水性注射悬液可含有增加该悬液粘度的化合物，例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，或葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的药剂。另外，这些活性化合物的悬液可制备为适当的油性注射悬液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油)，合成脂肪酸酯(如油酸乙酯(ethylcleats)或甘油三酯)，或脂质体。可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合将活性成分包埋在制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳液，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。此类技术公开于remington'spharmaceuticalsciences(18thed.mackprintingcompany,1990)中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有该多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品的形式，例如薄膜，或微胶囊。在特定实施方案中，通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝，明胶或其组合，可延长注射组合物的吸收。本文中的示例性药学上可接受的赋形剂还包括诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)的间质药物分散剂，例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，例如rhuph20(baxterinternational,inc.)。在美国专利公开no.2005/0260186和2006/0104968中描述了包括rhuph20的某些示例性的shasegp和使用方法。在一个方面，将shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。示例性的冻干抗体配制剂描述于美国专利no.6,267,958中。水性抗体配制剂包括美国专利no.6,171,586和wo2006/044908中描述的那些，后一种配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。除前述组合物之外，融合蛋白还可配制为贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如，融合蛋白可以用适合的聚合材料或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如微溶盐。包含本发明融合蛋白的药物组合物可以通过常规的混合，溶解，乳化，包封，包埋或冻干过程进行制造。可以使用有利于将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学上可接受的载体，稀释剂，赋形剂或助剂以常规方式配制药物组合物。适当的配制剂取决于所选择的施用途径。可以将抗原结合分子配制成游离酸或碱，中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些盐包括酸加成盐，例如由蛋白质组合物的游离氨基形成的或与无机酸例如盐酸或磷酸形成的那些，或与诸如乙酸，草酸，酒石酸或扁桃酸的有机酸形成的那些。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙或氢氧化铁；或诸如异丙胺，三甲胺，组氨酸或普鲁卡因的有机碱。与相应的游离碱形式相比，药物盐在水性溶剂和其它质子溶剂中的溶解度更高。在被治疗的特殊适应症需要时，本文中的组合物还可含有一种以上的活性成分，优选地，所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。此类活性成分以对预期目的有效的量适当地组合存在。用于体内施用的配制剂通常是无菌的。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。治疗方法和组合物本文中提供的任何抗原结合分子均可在治疗方法中使用。为了在治疗方法中使用，本发明的抗原结合分子可以以符合良好医学实践的方式配制，给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体紊乱，被治疗的具体哺乳动物，个体患者的临床状况，紊乱的原因，药剂的递送部位，施用方法，施用日程表，以及执业医师已知的其它因素。在一个方面，提供了用作药剂的本发明的抗原结合分子。在另外的方面，提供了在治疗疾病中使用尤其是在癌症治疗中使用的本发明的抗原结合分子。在某些方面，提供了在治疗方法中使用的本发明的抗原结合分子。在一个方面，本发明提供了用于治疗有需要的个体中的疾病的如本文中描述的抗原结合分子。在某些方面，本发明提供了在治疗患有疾病的个体的方法中使用的抗原结合分子，所述方法包括向个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些方面，待治疗的疾病是癌症。癌症的实例包括实体瘤，膀胱癌，肾细胞癌，脑癌，头颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫癌，子宫颈癌，子宫内膜癌，食道癌，结肠癌，结肠直肠癌，直肠癌，胃癌，前列腺癌，血癌，皮肤癌，鳞状细胞癌，骨癌，肾癌，黑素瘤，b细胞淋巴瘤，b细胞白血病，非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。因此，提供了在癌症治疗中使用的如本文中描述的抗原结合分子。需要治疗的受试者，患者或“个体”通常是哺乳动物，更特别地是人。在另一个方面，提供了用于治疗感染性疾病尤其是治疗病毒感染的如本文中描述的抗原结合分子。在又一个方面，提供了用于治疗自身免疫病例如狼疮病的如本文中描述的抗原结合分子。在一个方面，提供了依照本发明的用于治疗头颈鳞状细胞癌(hnscc)，乳腺癌，结肠直肠癌(crc)，胰腺癌(pac)，胃癌，非小细胞肺癌(nsclc)和间皮瘤的抗原结合分子，其中靶细胞抗原为tnc。在又一个方面，本发明涉及抗原结合分子在制造或制备用于治疗有需要的个体中的疾病的药剂中的用途。在一个方面，所述药剂用于在治疗疾病的方法中使用，所述方法包括向患有疾病的个体施用治疗有效量的药剂。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性紊乱，具体地是癌症。因此，在一个方面，本发明涉及本发明的抗原结合分子在制造或制备用于治疗癌症的药剂中的用途。癌症的实例包括实体瘤，膀胱癌，肾细胞癌，脑癌，头颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫癌，子宫颈癌，子宫内膜癌，食道癌，结肠癌，结肠直肠癌，直肠癌，胃癌，前列腺癌，血癌，皮肤癌，鳞状细胞癌，骨癌，肾癌，黑素瘤，b细胞淋巴瘤，b细胞白血病，非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。可以使用本发明的抗原结合分子进行治疗的其它细胞增殖紊乱包括但不限于位于腹部，骨骼，乳腺，消化系统，肝脏，胰腺，腹膜，内分泌腺(肾上腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺)，眼，头颈部，神经系统(中枢和外周)，淋巴系统，盆腔，皮肤，软组织，脾脏，胸部，和泌尿生殖系统的肿瘤。还包括癌前状态或病变和癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自由肾细胞癌，皮肤癌，肺癌，结肠直肠癌，乳腺癌，脑癌，头颈癌组成的组。技术人员可以认识到，在一些情况下，抗原结合分子可能不能提供治愈，而可能仅提供部分益处。在一些方面，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗有益的。因此，在一些方面，提供生理变化的抗原结合分子的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。在又一个方面，本发明涉及如本文中描述的抗原结合分子在制造或制备用于治疗感染性疾病尤其是治疗病毒感染或治疗自身免疫病例如狼疮病的药剂中的用途。在又一个方面，本发明提供了治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的抗原结合分子。在一个方面，向所述个体施用呈药学上可接受的形式的包含本发明融合蛋白的组合物。在某些方面，待治疗的疾病是增殖性紊乱。在一个特定方面，该疾病是癌症。在另一个方面，该疾病是感染性疾病或自身免疫病。在某些方面，该方法进一步包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如果待治疗的疾病是癌症，则为抗癌剂。根据任何上述实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选人。为了预防或治疗疾病，本发明的抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型，给药途径，患者的体重，融合蛋白的类型，疾病的严重程度和病程，施用融合蛋白是用于预防还是治疗目的，先前或同时的治疗干预，患者的临床病史，和对融合蛋白的反应，和主治医师的决定。在任何情况下，负责给药的医师将决定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。本文中考虑到各种给药方案，包括但不限于在各个时间点上的单次或多次施用，推注施用和脉冲输注。一次性地或以一系列治疗的方式适当地向患者施用抗原结合分子。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗原结合分子可以是向患者施用的初始候选剂量，例如无论是通过一次或多次分开施用，还是通过连续输注。取决于上面提到的因素，一个典型的日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。对于数天或更长时间的反复施用，根据病情，治疗通常将持续到出现期望的疾病症状的抑制时为止。抗原结合分子的一个示例性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它实例中，剂量还可以包含每次施用从约1μg/kg体重，约5μg/kg体重，约10μg/kg体重，约50μg/kg体重，约100μg/kg体重，约200μg/kg体重，约350μg/kg体重，约500μg/kg体重，约1mg/kg体重，约5mg/kg体重，约10mg/kg体重，约50mg/kg体重，约100mg/kg体重，约200mg/kg体重，约350mg/kg体重，约500mg/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可推导的任何范围。在本文中所列数字的可推导范围的实例中，可以基于上述数字以约5mg/kg体重至约100mg/kg体重，约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等范围进行施用。因此，可向患者施用约0.5mg/kg，2.0mg/kg，5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。此类剂量可以间歇施用，例如，每周或每三周一次(例如使得患者接受约2个至约20个，或例如约6个剂量的融合蛋白)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。然而，其它剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法易于监测这种疗法的进展。通常以有效实现预期目的的量使用本发明的抗原结合分子。为了用于治疗或预防疾病状况，以治疗有效量施用或应用本发明的抗原结合分子或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是在根据本文中提供的详细公开内容的情况下。对于全身给药，可以根据体外测定法(例如细胞培养物测定法)初步估计治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养中确定的ic50在内的循环浓度范围。这类信息可以用来更精确地确定用于人的剂量。也可以使用本领域熟知的技术根据体内数据(例如，动物模型)估计初始剂量。根据动物数据，本领域普通技术人员可以容易地优化对人的施用。可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的抗原结合分子的血浆水平。通常注射施用的患者剂量范围为约0.1至50mg/kg/天，一般为约0.5至1mg/kg/天。可以通过每天施用多个剂量来实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过hplc测量血浆中的水平。在局部给药或选择性摄取的情况下，抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够优化治疗有效的局部剂量而无需过度实验。本文中描述的抗原结合分子的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起实质性毒性。可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定融合蛋白的毒性和治疗效果。可使用细胞培养物测定法和动物研究来确定ld50(对群体的50％致死的剂量)和ed50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，它可以被表述为比率ld50/ed50。表现出较大治疗指数的抗原结合分子是优选的。在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制适合于在人类中使用的剂量范围中加以使用。剂量优选地处在循环浓度范围内，其包括具有很小或没有毒性的ed50。取决于多种因素，例如采用的剂型，所用给药途径，受试者的状况等，剂量可以在这个范围内变化。考虑到患者的状况，个体医师可以选择确切的配方，给药途径和剂量(见，例如fingl等人，1975,in:thepharmacologicalbasisoftherapeutics,ch.1,p.1，通过提述将其完整并入本文)。用本发明的融合蛋白治疗患者的主治医师知道如何并且何时由于毒性，器官功能障碍等而终止，中断或调整给药。相反，如果临床反应不足(排除毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在感兴趣紊乱的管理中，施用剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度，给药途径等而变化。可以例如部分地通过标准预后评价方法来评价病症的严重程度。此外，剂量和可能剂量频率也将根据个体患者的年龄，体重和反应而变化。其它药剂和治疗本发明的抗原结合分子可以在治疗中与一种或多种其它药剂组合施用。例如，本发明融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”涵盖可以为了治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病而施用的任何药剂。这种另外的治疗剂可包含任何适合于被治疗的特定适应症的任何活性成分，优选地，所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。在某些实施方案中，另外的治疗剂是另一种抗癌剂。此类其它药剂以对预期目的有效的量适当地组合存在。此类其它药剂的有效量取决于所使用的融合蛋白的量，紊乱或治疗的类型，以及以上讨论的其它因素。通常以与本文中所述相同的剂量和施用途径，或本文中所述剂量的约1％至99％，或以在经验/临床上确定为适当的任何剂量并通过任何途径使用本发明的抗原结合分子。上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一个或分开的组合物中)和分开施用，在分开施用的情况下，本发明的抗原结合分子的施用可以发生在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前，同时和/或之后。制品在本发明的另一个方面，提供了含有用于治疗，预防和/或诊断上述病症的物质的制品。制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。适合的容器包括例如瓶，小瓶，注射器，iv溶液袋等。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。容器容纳组合物本身或连同另一种有效治疗，预防和/或诊断疾患的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的抗原结合分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的疾患。而且，制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另外的细胞毒性治疗剂或其它治疗剂。在本发明的这个实施方案中的制品可以进一步包括指示组合物可用于治疗特定疾患的包装插页。替代地或另外，制品可以进一步包括第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌性注射用水(bwfi)，磷酸盐缓冲盐水，林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括立足于商业和用户立场所需的其它物质，包括其它缓冲剂，稀释剂，过滤器，针头和注射器。表c(序列)关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见：kabat,e.a.etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)。抗体链的氨基酸根据kabat(kabat,e.a.etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))根据eu编号系统如上文定义进行编号和参考。特定实施方案1.一种含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与生腱蛋白-c(tnc)特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段且在于该第二多肽仅仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。2.一种含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与生腱蛋白-c(tnc)特异性结合的抗原结合模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段且在于该第二多肽仅仅包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。3.实施方案1或2的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其进一步包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。4.实施方案1至3任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于(i)该第一多肽含有ch1或cl域且该第二多肽含有相应的cl或ch1域，其中该第二多肽与该第一多肽通过该ch1和cl域之间的二硫键连接，且其中该第一多肽包含通过肽接头与该ch1或cl域且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的cl或ch1域连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，或(ii)该第一多肽含有ch3域且该第二多肽含有相应的ch3域，且其中该第一多肽包含通过肽接头与该ch3域的c端且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段且其中该第二多肽仅仅包含经由肽接头与所述多肽的ch3域的c端连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段，或(iii)该第一多肽含有vh-cl或vl-ch1域且该第二多肽含有相应的vl-ch1域或vh-cl域，其中该第二多肽与该第一多肽通过该ch1和cl域之间的二硫键连接，且其中该第一多肽包含通过肽接头与vh或vl且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的vl或vh连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。5.实施方案1至4任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该tnf配体家族成员共刺激人t细胞激活。6.实施方案1至5任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该tnf配体家族成员选自4-1bbl和ox40l。7.实施方案1至6任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该tnf配体家族成员是4-1bbl。8.实施方案1至7任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该tnf配体家族成员的胞外域包含选自由seqidno:172，seqidno:173，seqidno:174，seqidno:175，seqidno:183，seqidno:192，seqidno:193和seqidno:194组成的组的氨基酸序列，特别是seqidno:172或seqidno:183的氨基酸序列。9.实施方案1至8任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该tnf配体家族成员的胞外域包含seqidno:183的氨基酸序列。10.实施方案1至9任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由seqidno:176，seqidno:184，seqidno:185和seqidno:186组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由seqidno:172，seqidno:174，seqidno:175和seqidno:183组成的组的氨基酸序列。11.实施方案1至10任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)含有ch1或cl域的第一多肽和含有相应的cl或ch1域的第二多肽，其中该第二多肽与该第一多肽通过该ch1和cl域之间的二硫键连接，且其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该ch1或cl域且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段且在于该第二多肽仅仅包含经由肽接头与所述多肽的cl或ch1域连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。12.实施方案1至11任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够与tnc特异性结合的模块选自由抗体片段，fab分子，交换fab分子，单链fab分子，fv分子，scfv分子，单域抗体，avh和支架抗原结合蛋白组成的组。13.实施方案1至12任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该分子包含一个或两个能够与tnc特异性结合的模块。14.实施方案1至13任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够与tnc特异性结合的模块是能够与tnc特异性结合的fab分子。15.实施方案1至14任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够与tnc特异性结合的模块包含vh域和vl域，该vh域包含(i)包含seqidno:67或seqidno:70的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:68或seqidno:71的氨基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:69或seqidno:72的氨基酸序列的cdr-h3，该vl域包含(iv)包含seqidno:55或seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:56或seqidno:59的氨基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:57或seqidno:60的氨基酸序列的cdr-l3。16.实施方案1至15任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够与tnc特异性结合的模块包含包含seqidno:46的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:45的氨基酸序列的可变轻链或其中该能够与tnc特异性结合的模块包含包含seqidno:48的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:47的氨基酸序列的可变轻链。17.实施方案3至16任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该fc域是igg，特别是igg1fc域或igg4fc域。18.实施方案3至17任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该fc域是包含位置234和235(eu编号方式)和/或329(eu编号方式)处的氨基酸替代的igg1fc域。19.实施方案1至18任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含第一重链和第一轻链，这两者构成能够与tnc特异性结合的fab分子，第一肽，其包含通过第一肽接头彼此连接的在其c端通过第二肽接头与第二重或轻链融合的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段，和第二肽，其包含在其c端通过第三肽接头与相应的第二轻或重链融合的所述tnf配体家族成员的一个胞外域。20.实施方案1至19任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的ch1域融合，且该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的cl域融合。21.实施方案1至20任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的cl域融合，且该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的ch1域融合。22.实施方案1至21任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该包含通过第一肽接头彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其c端通过第二肽接头与作为重链一部分的vh域融合，且该包含所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其c端通过第三肽接头与作为轻链一部分的vl域融合。23.实施方案20或21的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在邻近该tnf配体家族成员的cl域中，在位置123(eu编号方式)的氨基酸已替换为精氨酸(r)且在位置124(eu编号方式)的氨基酸已替代为赖氨酸(k)，且其中在邻近该tnf配体家族成员的ch1域中，在位置147(eu编号方式)和在位置213(eu编号方式)的氨基酸已替代为谷氨酸(e)。24.实施方案1至23任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(a)第一重链和第一轻链，这两者构成能够与tnc特异性结合的fab分子，(b)第二重链，其包含选自由seqidno:176，seqidno:184，seqidno:185和seqidno:186组成的组的氨基酸序列，和第二轻链，其包含选自由seqidno:172，seqidno:174，seqidno:175和seqidno:183组成的组的氨基酸序列。25.实施方案1至20任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(i)包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域的第一轻链或包含包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域的第一轻链，(ii)包含seqidno:178的氨基酸序列的第二重链，和(iii)包含seqidno:179的氨基酸序列的第二轻链。26.实施方案1至19和21任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(i)包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域的第一轻链或包含包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域的第一轻链，(ii)包含选自由seqidno:102，seqidno:108，seqidno:116和seqidno:120组成的组的氨基酸序列的第二重链，和(iii)包含选自由seqidno:103，seqidno:109，seqidno:117和seqidno:121组成的组的氨基酸序列的第二轻链。27.实施方案1至18任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与tnc特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽含有ch3域且该第二多肽含有相应的ch3域，且其中该第一多肽包含通过肽接头与该ch3域的c端且彼此连接的tnf配体家族成员的两个胞外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的ch3域的c端连接的所述tnf配体家族成员的一个胞外域或其片段。28.实施方案27的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(i)包含seqidno:127的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:125的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链，或(ii)包含seqidno:130的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:131的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链，或(ii)包含seqidno:124的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:133的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链，或(ii)包含seqidno:136的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:137的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的一条轻链。29.实施方案27的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。30.实施方案27或29任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(i)包含seqidno:112的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:113的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的两条轻链，或(ii)包含seqidno:124的氨基酸序列的第一重链，包含seqidno:125的氨基酸序列的第二重链，和包含seqidno:77的氨基酸序列的两条轻链。31.实施方案1至6，11至23和27至29任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该tnf配体家族成员是ox40l。32.实施方案1至6，11至23和27至29任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该tnf配体家族成员的胞外域包含seqidno:181或seqidno:182的氨基酸序列，特别是seqidno:181的氨基酸序列。33.实施方案1至6，11至23，27至29，31和32任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含seqidno:190或seqid:191的氨基酸序列且在于该第二多肽包含seqidno:181或seqidno:182的氨基酸序列。34.实施方案1至6，11至23，27至29和31至33任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该靶细胞抗原是生腱蛋白-c(tnc)且该能够与tnc特异性结合的模块包含vh域和vl域，该vh域包含(i)包含seqidno:67或seqidno:70的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:68或seqidno:71的氨基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:69或seqidno:72的氨基酸序列的cdr-h3，该vl域包含(iv)包含seqidno:55或seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:56或seqidno:59的氨基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:57或seqidno:60的氨基酸序列的cdr-l3。35.实施方案1至6，11至23，27至29和31至33任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够与tnc特异性结合的抗原结合模块包含vh域和vl域，该vh域包含(i)包含seqidno:67的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:68的氨基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:69的氨基酸序列的cdr-h3，该vl域包含(iv)包含seqidno:55的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:56的氨基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:57的氨基酸序列的cdr-l3。36.实施方案1至6，11至23，27至29和31至33任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够与tnc特异性结合的抗原结合模块包含vh域和vl域，该vh域包含(i)包含seqidno:70的氨基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:71的氨基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:72的氨基酸序列的cdr-h3，该vl域包含(iv)包含seqidno:58的氨基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:59的氨基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:60的氨基酸序列的cdr-l3。37.实施方案1至6，11至23，27至29和31至36任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含(i)包含包含seqidno:46的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:45的氨基酸序列的vl域的第一轻链或包含包含seqidno:48的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:47的氨基酸序列的vl域的第一轻链，(ii)包含选自由seqidno:195组成的组的氨基酸序列的第二重链，和(iii)包含seqidno:196的氨基酸序列的第二轻链。38.实施方案1至37任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合模块具有改善的亲和力。39.实施方案1至38任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合模块以低于约1nm的kd值结合人tnc。40.实施方案1至39任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合模块具有交叉物种反应性。41.实施方案1至40任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合模块以低于约2nm的kd值结合人，小鼠和食蟹猴tnc中的至少一种。42.实施方案1至41任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合模块结合人，小鼠和食蟹猴tnc。43.实施方案40至42任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合模块以相似亲和力结合来自所有指定物种的靶抗原。44.实施方案40至43任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合模块以相似亲和力结合来自所有指定物种的靶抗原，特别是在因数为100的kd范围内，在因数为50的kd范围内，在因数为20的kd范围内，在因数为10的kd范围内，在因数为5的kd范围内。45.实施方案40至44任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合模块以因数为10的kd范围内的相似亲和力结合来自所有指定物种的靶抗原。46.一种分离的多核苷酸，其编码实施方案1至45任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子。47.一种载体，特别是表达载体，其包含实施方案46的分离的多核苷酸。48.一种宿主细胞，其包含实施方案46的分离的多核苷酸或实施方案47的载体。49.一种用于生成实施方案1至45任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的方法，其包括下述步骤：(i)在适合于表达该抗原结合分子的条件下培养实施方案48的宿主细胞，并(ii)回收该抗原结合分子。50.一种药物组合物，其包含实施方案1至45任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。51.实施方案1至45任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，或实施方案50的药物组合物，其用作药物。52.实施方案1至45任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子，或实施方案50的药物组合物，其用于治疗癌症。53.实施方案1至45任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子制造用于治疗癌症的药物的用途。54.一种在个体在治疗疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的包含药学可接受形式的实施方案1至45任一项的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子的组合物。55.实施方案54的方法，其中所述疾病是癌症。实施例以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，根据上面提供的一般描述，可以实践各种其它实施方案。重组dna技术使用标准方法操作dna，如sambrook等人在molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989中所述。按照制造商的说明使用分子生物试剂。通过双链测序确定dna序列。在一些情况中，由geneartag(regensburg,germany)从合成的寡核苷酸和pcr产物通过自动基因合成来制备期望的基因区段。将侧翼为单个限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆到指定质粒中。从转化的细菌中纯化质粒dna，并通过紫外光谱法测定浓度。通过dna测序证实亚克隆基因片段的dna序列。设计具有适合的限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到对应的表达载体中。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见：kabat,e.a.等人，(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthed.,nih公开no91-3242。为了表达，所有构建体均含有编码前导肽的5'端dna序列，所述前导肽靶向在真核细胞中分泌的蛋白质。例示性前导肽和编码它们的多核苷酸序列在seqidno163至seqidno171中给出。细胞培养技术使用如currentprotocolsincellbiology(2000),bonifacino,j.s.,dasso,m.,harford,j.b.,lippincott-schwartz,j.和yamada,k.m.(eds.),johnwiley&sons,inc.中所述的标准细胞培养技术。蛋白质纯化参考标准方案，从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体应用于蛋白a琼脂糖凝胶柱(gehealthcare)并用pbs清洗。在ph2.8实现抗体的洗脱，然后立即中和样品。通过大小排阻层析术(superdex200,gehealthcare)在pbs或在20mm组氨酸，150mmnacl(ph6.0)中从单体抗体分离聚集的蛋白质。合并单体抗体级分，使用例如milliporeamiconultra(30mwco)离心浓缩机进行浓缩(如果需要的话)，在-20℃或-80℃冷冻并储存。提供部分样品用于随后例如通过sds-page，大小排阻层析术(sec)或质谱术进行蛋白质分析和分析表征。sds-page根据制造商的说明使用预制凝胶系统(invitrogen)。特别地，使用10％或4-12％的bis-tris预制凝胶(ph6.4)和mes(还原凝胶，具有抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或mops(非还原凝胶)运行缓冲液。分析性大小排阻层析术通过hplc层析术进行大小排阻层析术(sec)，用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之，将蛋白a纯化的抗体应用于在agilenthplc1100系统上的300mmnacl，50mmkh2po4/k2hpo4(ph7.5)中的tosohtskgelg3000sw柱上，或者在dionexhplc系统上的2xpbs中的superdex200柱(gehealthcare)上。通过uv吸光度和峰面积的积分将洗脱的蛋白质定量。以biorad凝胶过滤标准151-1901作为标准。质谱术本节描述了具有vh/vl交换(vh/vlcrossmabs)的多特异性抗体的表征，重点在于它们的正确装配。通过去糖基化的完整crossmabs和去糖基化的/纤溶酶消化的或替代地去糖基化的/限制性lysc消化的crossmabs的电喷雾电离质谱术(esi-ms)分析预期的一级结构。在37℃，以1mg/ml的蛋白质浓度将vh/vlcrossmabs用磷酸盐或tris缓冲液中的n-糖苷酶f进行去糖基化达17个小时。用tris缓冲液(ph8)中的100μg去糖基化的vh/vlcrossmabs，分别于室温进行120小时和在37℃，进行40分钟的纤溶酶或限制性lysc(roche)消化。在进行质谱分析之前，将样品通过hplc在sephadexg25柱(gehealthcare)上脱盐。在装备有triversananomate来源(advion)的maxis4guhr-qtofms系统(brukerdaltonik)上，通过esi-ms测定总质量。使用表面等离振子共振(spr)(biacore)测定多特异性抗体与相应抗原的结合以及结合亲和力使用biacore仪(gehealthcarebiosciencesab,uppsala,sweden)，通过表面等离振子共振来研究所生成的抗体与相应抗原的结合。简言之，为了亲和力测量，将山羊抗人igg，jir109-005-098抗体通过胺偶联固定在cm5芯片上，以显现针对相应抗原的抗体。在25℃(或者37℃)的hbs缓冲液(hbs-p(10mmhepes，150mmnacl，0.005％吐温20，ph7.4))中测量结合。添加不同浓度的抗原(r&dsystems或内部纯化的)溶液。通过80秒至3分钟的抗原注射来测量结合；通过用hbs缓冲液清洗芯片表面3-10分钟来测量解离，并且使用1:1朗格缪尔结合模型估计kd值。从样品曲线中减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)，以便校正系统固有的基线漂移和校正噪声信号降低。使用相应的biacore评估软件进行传感图的分析和亲和力数据的计算。实施例1tnc抗原序列和抗原生成将表3和表4的所有构建物融合至gst的c端并在大肠杆菌bl21(de3)中表达。对于位点特异性生物素化，avi标签添加至生腱蛋白序列的c端，并在分开的质粒上共表达bira生物素连接酶(avidity，colorado，usa)。生长培养基是含100μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素的2yt。添加生物素至50μm的终浓度。用1mmiptg于22℃诱导蛋白质表达过夜。通过离心收获细胞，并通过b-per试剂(pierce78260)存在下的超声波处理和1mg/ml溶菌酶(sigmal6876)实施细胞裂解。将裂解物离心并将澄清后的裂解物加载到谷胱甘肽sepharose柱(gehealthcare；产品号17-0756-01)上。清洗后，于4℃经由凝血酶(sigmaaldrich；产品号10602400001)自gst切割tnc分子过夜。在50mmtris缓冲液ph8.0；200mmnacl，5mmmgcl2，1mmdtt和10％甘油中实施洗脱。最终的纯化步骤是在凝胶过滤柱(superdex7516/60；gehealthcare)上。将样品在液氮中闪冻直至加工。表3：用于交叉物种亲和力测定(参见表26)的tnc抗原的序列表4：用于亲和力测定(参见表5)的tnc抗原的序列实施例2自通用fab文库选择抗tnc抗体自两种不同通用噬菌体展示文库：dp88-4(克隆18d4)和λ-dp47(克隆11c7)选择抗tnc抗体。文库构建dp88-4文库是使用包含轻链cdr3(l3，3种不同长度)和重链cdr3(h3，3种不同长度)中的随机化序列间隙的v域配对vk1_5(κ轻链)和vh1_69(重链)基于人种系基因构建的。文库生成是通过交叠延伸(soe)pcr应用剪接，通过装配3种pcr扩增片段而实施的。片段1包含抗体基因的5’端，包括随机化l3，片段2是中央恒定片段，跨越l3至h3，而片段3包含随机化h3和抗体基因的3’部分。分别使用下面的引物组合来生成用于dp88-4文库的这些文库片段：片段1(正向引物lmb3与反向引物vk1_5_l3r_s或vk1_5_l3r_sy或vk1_5_l3r_spy组合)，片段2(正向引物rjh31与反向引物rjh32组合)和片段3(正向引物dp88-v4-4或dp88-v4-6或dp88-v4-8与反向引物fdseqlong组合)。用于生成文库片段的pcr参数是初始变性5分钟94℃，25个循环的1分钟94℃，1分钟58℃，1分钟72℃和终末延长10分钟72℃。为了装配pcr，使用等摩尔比率的凝胶纯化的单一片段作为模板，参数是初始变性3分钟94℃和5个循环的30秒94℃，1分钟58℃，2分钟72℃。在这个阶段，添加外部引物(lmb3和fdseqlong)并实施另外20个循环，之后是终末延长10分钟72℃。装配足够量的全长随机化fab构建物后，将它们用ncoi/nhei消化并连接入类似处理的受体噬菌粒载体。将经过纯化的连接体系用于约60次电感受态大肠杆菌tg1的转化。挽救展示fab文库的噬菌粒颗粒并通过peg/nacl纯化来纯化，待用于选择。将这些文库构建步骤重复三次以获得最终文库容量4.4×109。通过点印迹中的c端标签检测测定的功能性克隆的百分比分别是轻链的92.6％和重链的93.7％。λ-dp47文库是使用下面的v域配对基于人种系基因构建的：vl3_19λ轻链与vh3_23重链。文库在轻链cdr3(l3)和重链cdr3(h3)中随机化并通过“交叠延伸剪接”(soe)pcr自3种片段装配。片段1包含抗体基因的5’端，包括随机化l3，片段2是中央恒定片段，跨越l3的结束至h3的开始，而片段3包含随机化h3和fab片段的3’部分。分别使用下面的引物组合来生成用于文库的文库片段：片段1(lmb3-vl_3_19_l3r_v/vl_3_19_l3r_hv/vl_3_19_l3r_hlv)，片段2(rjh80–dp47cdr3_ba(mod))和片段3(dp47-v4-4/dp47-v4-6/dp47-v4-8–fdseqlong)。用于生成文库片段的pcr参数是初始变性5分钟94℃，25个循环的60秒94℃，60秒55℃，60秒72℃和终末延长10分钟72℃。为了装配pcr，使用等摩尔比率的3种片段作为模板，参数是初始变性3分钟94℃和5个循环的60秒94℃，60秒55℃，120秒72℃。在这个阶段，添加外部引物并实施另外20个循环，之后是终末延长10分钟72℃。装配足够量的全长随机化fab片段后，将它们用ncoi/nhei消化，伴随类似处理受体噬菌粒载体。连接15μgfab文库插入物与13.3μg噬菌粒载体。将经过纯化的连接体系用于60次转化，产生1.5×109个转化子。挽救展示fab文库的噬菌粒颗粒并通过peg/nacl纯化来纯化，待用于选择。噬菌体展示选择和elisa筛选在大肠杆菌中表达作为抗原用于噬菌体展示选择的人gst融合的tncfn5a1234bcfn6并在位于融合蛋白c端的avi标签识别序列处经由共表达bira生物素连接酶而体内位点特异性生物素化(抗原生成依照实施例1，序列衍生自表4)。此抗原包含位于两个纤连蛋白iii型域5和6之间的人tnc外剪接域a1，a2，a3，a4，b，和c。噬菌体展示选择目标在于选择针对这些外剪接域任一的结合物并在后续步骤中使用包含较少外剪接域的另外的抗原构建物通过表面等离振子共振测定域特异性。依照下面的样式在溶液中实施选择轮次(生物淘选)：1.用也携带与tnc靶细胞抗原相似的avi标签和his6标签的无关gst-融合蛋白预清洁约1012个噬菌粒颗粒以对文库消减识别三种不同标签的抗体，2.在1ml总体积中在无关非生物素化gst-融合蛋白存在下将预清洁后的噬菌粒颗粒在含100nm生物素化人gst融合的tncfn5a1234bcfn6的上清液中温育0.5小时以进一步消减标签结合物，3.通过转移至中性亲合素预包被微量滴定板的4个孔达10分钟来捕捉生物素化人gst融合的tncfn5a1234bcfn6和附着的特异性结合噬菌体(在第1和3轮中)，4.使用5xpbs/tween20和5xpbs清洗相应孔，5.通过添加250μl100mmtea(三乙胺)每孔达10分钟来洗脱噬菌体颗粒并通过对来自4个孔的合并洗出液添加500μl1mtris/hclph7.4来中和，6.用洗脱的噬菌体颗粒的上清液再感染对数期大肠杆菌tg1细胞，用辅助噬菌体vcsm13感染，在摇床上于30℃温育过夜，随后用peg/nacl沉淀噬菌粒颗粒，待用于下一个选择轮次。使用恒定抗原浓度100nm进行3轮选择。在第2轮中，为了避免富集针对中性亲合素的结合物，通过添加5.4×107个链霉亲合素包被的磁珠来实施抗原:噬菌体复合物的捕捉。在第2和3轮后如下通过elisa鉴定特异性结合物：在中性亲合素板上包被100μl100nm生物素化人gst融合的tncfn5a1234bcfn6。添加含有fab的细菌上清液并使用抗flag/hrp二抗经由它们的flag标签检测结合性fab。对人gst融合的tncfn5a1234bcfn6展现信号且对与靶携带相同标签的无关gst融合蛋白呈现阴性的克隆通过初审用于进一步分析。它们在0.5升培养体积中由细菌表达，亲和纯化并使用biorad的proteonxpr36生物传感器通过spr分析进一步表征以测试对鼠tnc的交叉反应性及测定抗体识别哪些外剪接域。使用biorad的proteonxpr36生物传感器的spr分析以通过中性亲合素捕捉在nlc芯片上固定化的生物素化人和鼠tnc抗原，于25℃使用proteonxpr36仪器(biorad)通过表面等离振子共振(spr)测量选定克隆的亲和力(kd)。抗原(配体)的固定化：将重组抗原用pbst(10mm磷酸盐，150mm氯化钠ph7.4，0.005％tween20)稀释至10μg/ml，然后以垂直方向以30μl/min注射。分析物的注射：对于‘一击动力学’测量，注射方向改成水平取向，沿着分开的通道1-5分别同时注射经过纯化的fab的两倍稀释系列，结合时间200秒，解离时间240秒。沿着第六通道注射缓冲液(pbst)以提供“在线”空白用于参照。通过同时拟合结合和解离传感图使用proteonmanagerv3.1软件中的简单一对一朗格缪尔结合模型计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。作为比率koff/kon计算平衡解离常数(kd)。表5列出两个选定克隆18d4和11c7对在物种和外剪接域组成方面不同的数种tnc抗原的平衡解离常数(kd)。表5：克隆18d4和11c7的平衡解离常数(kd)表6：用于pcr的通用噬菌体展示dp88-4文库(vk1_5/vh1_69)模板的dna序列表7：dp88-4文库(vk1_5/vh1_69)种系模板的碱基对序列表8：dp88-4文库(vk1_5/vh1_69)种系模板的氨基酸序列表9：用于生成dp88-4文库(vk1_5/vh1_69)的引物序列下划线碱基：60％给定序列和40％n；斜体碱基：60％给定序列和40％m。1:g/d＝20％，e/v/s＝10％，a/p/r/l/t/y＝5％；2:g/y/s＝15％，a/d/t/r/p/l/v/n/w/f/i/e＝4.6％；3:g/a/y＝20％，p/w/s/d/t＝8％；4:f＝46％，l/m＝15％，g/i/y＝8％。表10：用于pcr的通用噬菌体展示λ-dp47文库(vl3_19/vh3_23)模板的dna序列表11：λ-dp47文库(vl3_19/vh3_23)种系模板的碱基对序列表12：λ-dp47文库(vl3_19/vh3_23)种系模板的氨基酸序列表13：用于生成λ-dp47文库(vl3_19/vh3_23)的引物序列随机化引物中的三核苷酸混合物：1(g/d＝20％，e/v/s＝10％，a/p/r/l/t/y＝5％)；2(g/y/s＝15％，a/d/t/r/p/l/v/n/w/f/i/e＝4.6％)；3(g/a/y＝20，p/w/s/d/t＝8％)；4(f＝46％，l/m＝15％，g/i/y＝8％)；5(k＝70％，r＝30％)实施例3将可变抗体域克隆入表达载体与人igg1的恒定重链或恒定轻链任一同框亚克隆选定抗tnc结合物的重和轻链可变区dna序列(表14至表19)。或是作为野生型人igg1主链或是作为含有pro329gly，leu234ala和leu235ala突变的变体制备抗体，所述突变依照公开号wo2012/130831a1的国际专利申请中描述的方法引入以消除对fcγ受体的结合。抗tnc结合物的cdr序列显示于表16至表19。抗tncigg的碱基对和氨基酸序列在表20和表21中显示。抗tncp319glalaigg的碱基对和氨基酸序列在表22和表23中显示。将所有抗体编码序列克隆入以嵌合mpsv启动子驱动插入物转录且含有位于cds的3’端的合成的polya信号序列的表达载体。另外，载体含有用于质粒的附加体维持的ebvorip序列。通过噬菌体展示选择的克隆11c7的lcdr3(nsinstrnev)含有潜在的n-糖基化位点，即nst，其可潜在地通过氨基酸替代去除以便于生成均质产物。同时，对靶的结合应当保留。n(位置1)可优选通过q，s或t替代。或者，s(位置2)可通过p替换。或者，t(位置3)可优选通过g或n或通过除了s或c以外的任何其它蛋白质原性氨基酸替代。哪种/哪些替代会是最好的可以由本领域技术人员凭经验确定。表14：噬菌体衍生抗tnc抗体的可变区碱基对序列表15：噬菌体衍生抗tnc抗体的可变区多肽序列表16：抗tnc抗体轻链的cdr碱基对序列表17：抗tnc抗体轻链的cdr多肽序列表18：抗tnc抗体重链的cdr碱基对序列表19：抗tnc抗体重链的cdr多肽序列表20：野生型人igg1型式的抗tnc克隆的碱基对序列表21：野生型人igg1型式的抗tnc克隆的多肽序列表22：p329glala人igg1型式的抗tnc克隆的碱基对序列表23：p329glala人igg1型式的抗tnc克隆的多肽序列实施例4抗tncigg的纯化所有基因在由mpsv核心启动子与cmv启动子增强子片段组合组成的嵌合mpsv启动子控制下瞬时表达。表达载体还含有用于含有ebna(埃巴病毒核抗原)的宿主细胞中的附加体复制的orip区。通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染hek293-ebna细胞来生成抗tncigg。以1:1比率(“载体hc”:“载体hlc”)用相应表达载体转染细胞。为了500ml摇瓶中的200ml生成，在转染前24小时在具有补充物的excell培养基中接种250x106个hek293ebna细胞。为了转染，将细胞以210xg离心5分钟，并用预温热的cd-cho培养基替换上清液。在20mlcd-cho培养基中混合表达载体至200μgdna的最终量。添加540μlpei(1mg/ml)后，将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后，将细胞与dna/pei溶液混合，转移至500ml摇瓶并在具有5％co2气氛且以165rpm摇动的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加160ml具有补充物的excell培养基并将细胞培养24小时。此时，丙戊酸浓度为1mm(培养基另外包含g/lpepsoy和6mml-谷氨酰胺)。转染后24小时，以12％最终体积(24ml)和3g/l葡萄糖(来自500g/l储液的1.2ml)对细胞补充氨基酸和葡萄糖补料。培养7天后，通过以2000-3000xg离心45分钟来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v)，并于4℃保持。使用mabselectsure通过亲和层析进行自细胞培养物上清液纯化抗tncigg。浓缩并过滤蛋白质，之后在用ph6.0的20mm组氨酸，140mmnacl，0.01％tween-20溶液平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上加载。为了亲和层析，在用36ml20mm柠檬酸钠，20mm磷酸钠，ph7.5平衡的protamabselectsure柱(cv＝6ml，gehealthcare)上加载上清液。通过用6-10个柱体积的含有20mm柠檬酸钠，20mm磷酸钠，ph7.5的缓冲液清洗来去除未结合的蛋白质。使用15个cv的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，0.01％(v/v)tween-20，ph3.0的氯化钠(20至100％)的线性ph梯度洗脱结合的蛋白质。然后用4个柱体积的含有20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，0.01％(v/v)tween-20，ph3.0的溶液清洗柱，接着是再平衡步骤。通过添加1/10(v/v)0.5mna2hpo4，ph8.0来调节收集的级分的ph。浓缩并过滤蛋白质，之后在用20mm组氨酸，140mm氯化钠，ph6.0，0.01％tween20平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上加载。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过以280nm测量od来测定经过纯化的igg的蛋白质浓度。使用labchipgxii(caliper)通过还原剂(invitrogen，usa)存在和缺失下的ce-sds来分析igg的纯度和分子量。于25℃使用在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mm单盐酸l-精氨酸，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中平衡的tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析经过纯化的蛋白质的聚集体含量(表24)。表24：抗tncigg1的生化分析克隆产率[mg/l]单体[％]a-tnc(18d4)huigg16.898.3a-tnc(18d4)p329glalahuigg126.7100实施例5表面等离振子共振(tnc结合)通过表面等离振子共振(spr)评估抗tncigg18d4，11c7和抗tnc18d4的fab片段对人，鼠和食蟹猴tnc(抗原依照表4)的结合。所有spr实验是用hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4，0.15mnacl，3mmedta，0.005％表面活性剂p20，biacore，freiburg/germany)于25℃在biacoret200上实施的。使用固定化向导功能在sa芯片上注射生物素化人，鼠或食蟹猴tnc的20μg/ml储液，目标是固定化高至100ru。最终的固定化水平介于79-400ru之间。然后以范围为0.02-12.5nm(igg)和0.02-50nm(fab片段)的浓度以30μl/min的流速使抗tncigg18d4(pglala和wtfc)，11c7(rbigg)和18d4fab片段立即通过芯片表面达180秒，接着是180秒的解离步骤。对igg的最高浓度实施另外的1800秒的解离步骤。在每一个步骤之后，遵循两次连续注射10mm甘氨酸ph2.1达60秒来再生表面。通过减去在没有tnc的参照流动室中获得的响应来修正本体折射率差异。使用朗格缪尔1:1动力学模型计算亲和力和亲合力。然而，因为二价相互作用的1:1拟合的kd仅仅是表观值，所以它应当仅仅用于比较。表26：kd值和物种交叉反应性抗tnc结合物18d4以pm范围中的相似亲合力与小鼠和食蟹猴tnc交叉反应。18d4fab片段对tnc的单价结合导致低nm范围中的kd。抗tnc结合物11c7也在pm范围中结合人tnc。由于这个biacore实验中使用的鼠和食蟹猴tnc构建物中c域的缺失，不能对结合物11c7评估物种交叉反应性(表26)。热稳定性通过静态光散射(sls)和通过测量响应所应用的温度应力的内在蛋白质荧光来监测热稳定性。一式两份以1mg/ml的蛋白质浓度将30μg经过过滤的蛋白质样品应用于optim2仪器(avactaanalyticalltd)。以0.1℃/min使温度自25斜升至85℃，收集半径和总散射强度。为了测定内在蛋白质荧光，于266nm激发样品并在275nm和460nm之间收集发射。两种igg均具有62℃的聚集温度(表26)。表26：热稳定性构建物tagg(℃)18d4iggpglala6218d4iggwtfc62实施例6ls174t异种移植物衍生肿瘤组织和人组织阵列中tnc染色的结果用免疫组织化学技术在ls174t异种移植物衍生肿瘤组织和人组织阵列中对作为家兔igg抗体的抗tnc克隆18d4和11c7测试tnc检测。将ls174t结肠直肠癌冷冻肿瘤样品在cryostat中以12μm厚度切片，在superfrost载片(thermoscientific，germany)上封固。包括配对的正常和肿瘤样品的人组织阵列的冷冻样品购自biochain(sanfrancisco，usa)。容许组织切片融化30分钟。将载片在pbs中清洗，在冷丙酮中固定10分钟，并实施水中0.03％过氧化氢酶的温育步骤以阻断内源过氧化物酶。然后将切片与pbs中的5％山羊血清一起温育1小时，接着与0.5μg/ml抗tnc克隆18d4或11c7或同种型对照抗体(serotec，germany)一起于4℃温育过夜。之后，将切片用pbs清洗三次，每次5分钟并使用过氧化物酶家兔vectastainabc试剂盒遵循制造商的用法说明书(pk-6101，vectorlaboratories，california，usa)显影。然后将载片在渐增浓度的乙醇中脱水并在二甲苯中温育2分钟。将一滴permountmountingmedium(fischerchemical，germany)添加至切片和盖片。用olympus扫描仪vs120(olympus，germany)获得图像并分析。ls174t异种移植物肿瘤中的组织学染色样式对应于特定的tnc基质纤维(图1)。克隆18d4和11c7二者的tnc染色以中等强度总体表达。阴性同种型对照信号验证该技术的特异性。染色的特异性得到家兔同种型对照的相应组织学染色中的阴性同种型对照信号验证(图2)。人肿瘤阵列中用抗tnc克隆18d4的组织学染色对应于特定的tnc基质纤维。tnc染色在大多数肿瘤组织中以与对照正常配对组织相比更高的水平表达(图3)。人肿瘤阵列中用抗tnc克隆11c7的组织学染色对应于特定的tnc基质纤维。tnc染色在大多数肿瘤组织中以与对照正常配对组织相比更高的水平表达(图4)。实施例74-1bb的制备，纯化和表征将编码人，小鼠或食蟹猴4-1bb的胞外域的dna序列(表27)与节上的人igg1重链ch2和ch3域框内亚克隆(merchantetal.,1998)。在抗原胞外域和人igg1的fc之间引入actev蛋白酶切割位点。在抗原-fc节的c端引入用于定向生物素化的avi标签。含有s354c/t366w突变的抗原-fc节链与含有y349c/t366s/l368a/y407v突变的fc穴链的组合容许生成异二聚体，其包括单拷贝的含有4-1bb胞外域的链，从而创建单体形式的fc连接的抗原。表28显示了抗原fc融合构建体的cdna和氨基酸序列。表27：抗原胞外域(ecd)的氨基酸编号及其起源seqidno:构建体起源ecdseqidno:85人4-1bbecd依照q07011合成aa24-186seqidno:86食蟹猴4-1bbecd自食蟹猴血液分离aa24-186seqidno:87鼠4-1bbecd依照p20334合成aa24-187表28：单体抗原fc(kih)融合分子的cdna和氨基酸序列将所有4-1bb-fc融合分子编码序列克隆入质粒载体中，所述质粒载体自mpsv启动子驱动插入物的表达且含有位于cds3’端的合成polya信号序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的ebvorip序列。为了制备生物素化的单体抗原/fc融合分子，用编码融合蛋白的两种构件(节和穴链)以及生物素化反应所必需的酶bira的三种载体共转染指数式生长的悬浮hek293ebna细胞。以2:1:0.05比率(“抗原ecd-actev-fc节”:“fc穴”:“bira”)使用相应的载体。为了500ml摇瓶中的蛋白质生成，在转染前24小时接种400x106个hek293ebna细胞。为了转染，将细胞以210g离心5分钟，并将上清液替换为预热的cdcho培养基。将表达载体重悬浮于20ml含有200μg载体dna的的cdcho培养基中。添加540μl聚乙烯亚胺(pei)后，将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后，将细胞与dna/pei溶液混合，转移至500ml摇瓶并在5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加160mlf17培养基并将细胞培养24小时。生产培养基补充5mm几夫碱(kifunensine)。转染后1天，对培养物添加1mm丙戊酸和7％含有补充物的补料1。培养7天后，通过将细胞以210g旋降15分钟来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v)，并保持于4℃。通过使用蛋白a的亲和层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质，接着是大小排阻层析。对于亲和层析，将上清液加载到用40ml20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠缓冲液ph7.5平衡的hitrap蛋白ahp柱(cv＝5ml,gehealthcare)上。通过用至少10个柱体积的含有20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠，0.5m氯化钠的缓冲液(ph7.5)清洗来去除未结合的蛋白质。使用在20个柱体积的20mm柠檬酸钠，0.01％(v/v)吐温20，ph3.0上创建的氯化钠的线性ph梯度(0至500mm)洗脱结合的蛋白质。然后将柱用10个柱体积的20mm柠檬酸钠，500mm氯化钠，0.01％(v/v)吐温20，ph3.0清洗。通过添加1/40(v/v)2mtris，ph8.0来调节收集的级分的ph。浓缩并过滤蛋白质，之后加载到用ph7.4的2mmmops，150mm氯化钠，0.02％(w/v)叠氮化钠溶液平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。为了对人受体的亲和力测定，还将人4-1bb的胞外域与avi(glndifeaqkiewhe)和六组氨酸标签进行框内亚克隆。如上文关于fc融合蛋白所述实施蛋白质生成。通过螯合层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质，接着是大小排阻层析。第一个层析步骤在20mm磷酸钠，500nm氯化钠，ph7.4中平衡的nintasuperflowcartridge(5ml,qiagen)上实施。通过应用洗脱缓冲液(20mm磷酸钠，500nm氯化钠，500mm咪唑，ph7.4)在12个柱体积上的5％到45％梯度来实施洗脱。浓缩并过滤蛋白质，之后加载到用ph7.4的2mmmops，150mm氯化钠，0.02％(w/v)叠氮化钠溶液平衡的hiloadsuperdex75柱(gehealthcare)上(表29)。表29：单体人4-1bbhis分子的序列实施例8tnc靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc融合分子的制备依照uniprot数据库的p41273序列合成编码人4-1bb配体胞外域一部分(氨基酸71-254和71-248)的dna序列。用于靶向三聚体4-1bb配体的tnc结合物是克隆18d4。构建体6.1：具有ch-cl交叉和带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物如图5a中所绘克隆含有由(g4s)2接头分开的4-1bb配体的两个胞外域(71-254)且与人igg1-cl域融合的多肽：人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人cl。如图5b中所绘克隆含有4-1bb配体的一个胞外域(71-254)且与人igg1-ch域融合的多肽：人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人ch。为了改善正确配对，已经在交叉的ch-cl中引入下述突变。在与人cl融合的二聚体4-1bb配体中，e123r和q124k。在与人ch1融合的单体4-1bb配体中，k147e和k213e。将编码对生腱蛋白(tnc)特异性的结合物，克隆18d4的重和轻链可变区dna序列与穴的恒定重链或人igg1的恒定轻链任一框内亚克隆。已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fc伽马受体的结合(如国际专利申请公开文本no.wo2012/130831中描述的)。含有s354c/t366w突变的二聚体配体-fc节链，单体ch1融合物，含有y349c/t366s/l368a/y407v突变的靶向性抗tnc-fc穴链和抗tnc轻链的组合(如例如us5,731,168；us7,695,936中描述的)容许生成异二聚体，其包括组装的三聚体4-1bb配体和tnc结合性fab(图2)。表30和表31分别显示具有ch-cl交叉和带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物(构建体6.1)的cdna和氨基酸序列。表30：含有ch-cl交叉有带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物(构建体6.1)的碱基对序列。*用于带电荷残基表31：含有ch-cl交叉有带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物(构建体6.1)的氨基酸序列。*用于带电荷残基构建体6.2：含有ch-cl交叉无带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物如图7a中所绘克隆含有由(g4s)2接头分开的4-1bb配体的两个胞外域(71-254)且与人igg1-cl域融合的多肽：人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人cl。如图7b中所绘克隆含有4-1bb配体的一个胞外域(71-254)且与人igg1-ch域融合的多肽：人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人ch。将编码对tnc特异性的结合物，克隆18d4的重和轻链可变区dna序列与穴的恒定重链或人igg1的恒定轻链任一框内亚克隆。已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fc伽马受体的结合(专利登录号)。含有s354c/t366w突变的二聚体配体-fc节链，单体ch1融合物，含有y349c/t366s/l368a/y407v突变的靶向性抗tnc-fc穴链和抗tnc轻链的组合容许生成异二聚体，其包括组装的三聚体4-1bb配体和tnc结合性fab(图8)。表32和表33分别显示含有ch-cl交叉无带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物(构建体6.2)的cdna和氨基酸序列。表32：含有ch-cl交叉无带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物的碱基对序列(构建体6.2)。表33：含有ch-cl交叉无带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物(构建体6.2)的氨基酸序列构建体6.3：二价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物如图9a中所绘将含有由(g4s)2接头分开的4-1bb配体的两个胞外域(71-254)的多肽融合至人igg1fc穴链的c端：人igg1fc穴，(g4s)2连接头，人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人4-1bb配体。如图9b中所绘将含有4-1bb配体的一个胞外域(71-254)的多肽融合至人igg1fc节链的c端：人igg1fc节，(g4s)2连接头，人4-1bb配体。将编码对tnc特异性的结合物，克隆18d4的重和轻链可变区dna序列与穴，节的恒定重链或人igg1的恒定轻链任一框内亚克隆。已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fc伽马受体的结合(国际专利申请公开文本no.wo2012/130831中描述的)。含有y349c/t366s/l368a/y407v突变的抗tnchuigg1穴二聚体配体链，含有s354c/t366w突变的抗tnchuigg1节单体配体链和抗tnc轻链的组合容许生成异二聚体，其包括组装的三聚体4-1bb配体和两个tnc结合性fab(图10)。表34和表35分别显示二价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物(构建体6.3)的cdna和氨基酸序列。表34：二价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc(kih)pglala融合物(构建体6.3)的碱基对序列表35：二价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc(kih)pglala融合物(构建体6.3)的氨基酸序列构建体6.4：含有ch-cl交叉有带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物如图11a中所绘克隆含有由(g4s)2接头分开的4-1bb配体的两个胞外域(71-248)且与人igg1-cl域融合的多肽：人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人cl。如图11b中所绘克隆含有4-1bb配体的一个胞外域(71-248)且与人igg1-ch域融合的多肽：人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人ch。为了改善正确配对，已经在交叉的ch-cl中引入下述突变。在与人cl融合的二聚体4-1bb配体中，e123r和q124k。在与人ch1融合的单体4-1bb配体中，k147e和k213e。将编码对tnc特异性的结合物，克隆18d4的重和轻链可变区dna序列与穴，节的恒定重链或人igg1的恒定轻链任一框内亚克隆。已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fc伽马受体的结合(专利登录号)。含有s354c/t366w突变的二聚体配体-fc节链，单体ch1融合物，含有y349c/t366s/l368a/y407v突变的靶向性抗tnc-fc穴链和抗tnc轻链的组合容许生成异二聚体，其包括组装的三聚体4-1bb配体和tnc结合性fab(图12)。表36和表37分别显示含有ch-cl交叉有带电荷残基的单价tnc靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.4)的cdna和氨基酸序列。表36：含有ch-cl交叉有带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.4)的碱基对序列。*带电荷残基表37：含有ch-cl交叉有带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.4)的氨基酸序列。*带电荷残基构建体6.5：含有ch-cl交叉无带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物如图13a中所绘克隆含有由(g4s)2接头分开的4-1bb配体的两个胞外域(71-248)且与人igg1-cl域融合的多肽：人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人cl。如图13b中所绘克隆含有4-1bb配体的一个胞外域(71-248)且与人igg1-ch域融合的多肽：人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人ch。将编码对tnc特异性的结合物，克隆18d4的重和轻链可变区dna序列与穴，节的恒定重链或人igg1的恒定轻链任一框内亚克隆。已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fc伽马受体的结合(专利登录号)。含有s354c/t366w突变的二聚体配体-fc节链，单体ch1融合物，含有y349c/t366s/l368a/y407v突变的靶向性抗tnc-fc穴链和抗tnc轻链的组合容许生成异二聚体，其包括组装的三聚体4-1bb配体和tnc结合性fab(图14)。表38和表39分别显示有ch-cl交叉中的带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.5)的cdna和氨基酸序列。表38：含有ch-cl交叉无带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.5)的碱基对序列表39：含有ch-cl交叉无带电荷残基的单价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.5)的氨基酸序列构建体6.6：二价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物如图15a中所绘将含有由(g4s)2接头分开的4-1bb配体的两个胞外域(71-248)的多肽融合至人igg1fc穴链的c端：人igg1fc穴，(g4s)2连接头，人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人4-1bb配体。如图15b中所绘将含有4-1bb配体的一个胞外域(71-248)的多肽融合至人igg1fc节链的c端：人igg1fc节，(g4s)2连接头，人4-1bb配体。将编码对tnc特异性的结合物，克隆18d4的重和轻链可变区dna序列与穴，节的恒定重链或人igg1的恒定轻链任一框内亚克隆。已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fc伽马受体的结合(专利登录号)。含有y349c/t366s/l368a/y407v突变的抗tnchuigg1穴二聚体配体链，含有s354c/t366w突变的抗tnchuigg1节单体配体链和抗tnc轻链的组合容许生成异二聚体，其包括组装的三聚体4-1bb配体和两个tnc结合性fab(图16)。表40和表41分别显示二价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.6)的cdna和氨基酸序列。表40：二价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.6)的碱基对序列表41：二价tnc(18d4)靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.6)的氨基酸序列构建体6.11和6.12：单价tnc(节)靶向性三聚体c端4-1bb配体fc(kih)融合物如图17a中所绘将含有由(g4s)2接头分开的4-1bb配体的两个胞外域的多肽框内亚克隆至人igg1fc穴或节链的c端(merchant,zhuetal.1998)：人igg1fc，(g4s)2连接头，人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人4-1bb配体。如图17b中所绘将含有4-1bb配体的一个胞外域的多肽框内亚克隆至人igg1fc节或穴链的c端：人igg1fc，(g4s)2连接头，人4-1bb配体。将编码对tnc特异性的结合物，克隆18d4的重和轻链可变区dna序列与节的恒定重链或人igg1的恒定轻链任一框内亚克隆。已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fc伽马受体的结合(国际专利申请公开文本no.wo2012/130831中描述的)。含有y349c/t366s/l368a/y407v突变的huigg1fc穴链，含有s354c/t366w突变的抗tnchuigg1节链和抗tnc轻链的组合容许生成异二聚体，其包括组装的三聚体4-1bb配体和一个tnc结合性fab(图18)。表42和表43分别显示单价靶向性tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.11)的cdna和氨基酸序列。表42：二价tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.11)的碱基对序列表43：二价tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.11)的氨基酸序列表44和表45分别显示单价靶向性tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.12)的cdna和氨基酸序列。表44：单价靶向性tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.12)的碱基对序列表45：单价靶向性tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.12)的氨基酸序列构建体6.13和6.14：单价tnc(穴)靶向性三聚体c端4-1bb配体fc(kih)融合如图17a中所绘将含有由(g4s)2接头分开的4-1bb配体的两个胞外域的多肽框内亚克隆至人igg1fc穴或节链的c端(merchant,zhuetal.1998)：人igg1fc，(g4s)2连接头，人4-1bb配体，(g4s)2连接头，人4-1bb配体。如图17b中所绘将含有4-1bb配体的一个胞外域的多肽框内亚克隆至人igg1fc节或穴链的c端：人igg1fc，(g4s)2连接头，人4-1bb配体。将编码对tnc特异性的结合物，克隆18d4的重和轻链可变区dna序列与穴的恒定重链或人igg1的恒定轻链任一框内亚克隆。已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fc伽马受体的结合(国际专利申请公开文本no.wo2012/130831中描述的)。含有该y349c/t366s/l368a/y407v突变的抗tnchuigg1fc穴链，含有s354c/t366w突变的huigg1节链和抗tnc轻链的组合容许生成异二聚体，其包括组装的三聚体4-1bb配体和一个tnc结合性fab(图19)。表46和表47分别显示单价靶向性tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.13)的cdna和氨基酸序列。表46：单价靶向性tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.13)的碱基对序列表47：单价靶向性tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.13)的氨基酸序列表48和表49分别显示单价靶向性tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.14)的cdna和氨基酸序列。表48：单价靶向性tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.14)的碱基对序列表49：单价靶向性tnc(18d4)分拆三聚体c端4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(构建体6.14)的氨基酸序列作为对照分子的非靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc融合物和人igg的制备如上文关于tnc靶向性构建体6.1(称作对照b)，6.3(称作对照c)，6.4(称作对照d)和6.5(称作对照e)所述制备这些对照分子，区别仅在于抗tnc结合物(vh-vl)替换为不结合该抗原的种系对照，称作dp47。表50分别显示含有交叉的ch-cl有带电荷残基的单价dp47非靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物，对照b的cdna和氨基酸序列。表51分别显示二价dp47非靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物，对照c的cdna和氨基酸序列。表52分别显示含有ch-cl交叉有带电荷残基的单价dp47非靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物，对照d的cdna和氨基酸序列。表53分别显示无ch-cl交叉中的带电荷残基的单价dp47非靶向性分拆三聚体4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合，对照e的cdna和氨基酸序列。表50：具有ch-cl交叉且有带电荷残基的单价dp47非靶向性分拆三聚体人4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物的cdna和氨基酸序列(对照b)。*带电荷残基表51：二价dp47非靶向性分拆三聚体人4-1bb配体(71-254)fc(kih)融合物(对照c)的cdna和氨基酸序列表52：具有ch-cl交叉且有带电荷残基的单价dp47非靶向性分拆三聚体人4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(对照d)的cdna和氨基酸序列。*带电荷残基表53：具有ch-cl交叉且无带电荷残基的单价dp47非靶向性分拆三聚体人4-1bb配体(71-248)fc(kih)融合物(对照e)的cdna和氨基酸序列制备两种含有pglala的对照人igg1分子。表54显示种系对照dp47huigg1pglala(对照f)的cdna和氨基酸序列。表55显示抗tnc(18d4)重链(huigg1pglala，即对照l)的cdna和氨基酸序列。表54：种系对照dp47huigg1pglala(对照f)的cdna和氨基酸序列表55：抗tnc(18d4)重链(huigg1pglala)(对照l)的cdna和氨基酸序列实施例9tnc靶向性分拆三聚体c端4-1bb配体fc融合物及其对照的生成将靶向性和非靶向性三聚体4-1bb配体c端fc(kih)融合物编码序列克隆入质粒载体中，所述质粒载体自mpsv启动子驱动插入物的表达且含有位于cds3’端的合成polya序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的ebvorip序列。通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染hek293-ebna细胞来生成分拆三聚体4-1bb配体fc(kih)融合分子。用相应的表达载体转染细胞。对于构建体6.1，6.2，6.4，6.6及其对照b，d和e，以1:1:1:1比率(“载体fc穴链”:“载体pd1轻链”:“载体fc节链”:“载体4-1bbl轻链”)。对于构建体6.3，6.6，6.11，6.12，6.13，6.14及其对照c，以1:1:1比率(“载体fc穴链”:“载体fc节链”:“载体抗pd1轻链”)。像双特异性构建体那样生成在测定法中用作对照的人igg(对于转染，仅以1:1比率使用轻链载体和重链载体)。为了500ml摇瓶中的生成，在转染前24小时接种300x106个hek293ebna细胞。为了转染，将细胞以210xg离心10分钟，并将上清液替换为20ml预热的cdcho培养基。在20mlcdcho培养基中混合表达载体(200μg总dna)。添加540μlpei后，将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后，将细胞与dna/pei溶液混合，转移至500ml摇瓶并在5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加160ml补充有6mml-谷氨酰胺，5g/lpepsoy和1.2mm丙戊酸的excell培养基并将细胞培养24小时。转染后1天，添加12％补料。培养7天后，通过以至少400xg离心30-40分钟来收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v)，并保持于4℃。通过使用蛋白a的亲和层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质，接着是大小排阻层析。对于亲和层析，将上清液加载到用磷酸钠(20mm)，柠檬酸钠(20mm)缓冲液(ph7.5)平衡的mabselectsure柱(cv＝5-15ml，树脂来自gehealthcare)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液清洗来去除未结合的蛋白质。使用20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸缓冲液(ph2.5)的线性梯度(20cv)或分步洗脱(8cv)任一洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。通过添加1/10(v/v)的0.5m磷酸钠，ph8.0来调节收集级分的ph。浓缩蛋白质，之后加载到用ph6.0的20mm组氨酸，140mm氯化钠，0.01％(v/v)吐温20溶液平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(od)来确定蛋白质浓度。通过还原剂(5mm1,4-二硫苏糖醇)存在和缺失下的sds-page和coomassiesimplebluetmsafestain(invitrogenusa)染色或使用caliperlabchipgxii(perkinelmer)的ce-sds来分析靶向性三聚体4-1bb配体fc(kih)融合物的纯度和分子量。于25℃使用在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mml-精氨酸一氢氯化物，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中平衡的tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析样品的聚集物含量。表56汇总tnc靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc(kih)融合物的产率和最终单体含量。表56：tnc靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc(kih)融合物的生物化学分析实施例10tnc靶向性4-1bb分拆三聚体配体fc融合抗原结合分子的同时结合，通过表面等离振子共振通过表面等离振子共振(spr)评估同时结合人4-1bbfc(kih)和人tnc的能力。所有spr实验均于25℃在biacoret200上实施，以hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4，0.15mnacl，3mmedta，0.005％表面活性剂p20，biacore,freiburg/germany)。将生物素化tnc抗原直接偶联至链霉亲和素(sa)传感器芯片的流动池。使用高达500个共振单位(ru)的固定化水平。以100nm的浓度范围以30μl/min的流使tnc靶向性4-1bb配体fc(kih)融合分子通过流动室90秒并将解离设置为零秒。以1000nm的浓度以30μl/min的流注射人4-1bbavihis作为第二分析物穿过流动室90秒(图20)。监测解离120秒。通过减去在参照流动室中获得的响应来校正本体折射率差异，其中参照流动池没有固定化蛋白质。所有双特异性构建体均能同时结合人4-1bb和人tnc(图20)。实施例11通过表面等离振子共振对单价tnc靶向性4-1bb分拆三聚体配体fc融合抗原结合分子的亲和力测定通过表面等离振子共振(spr)评估tnc靶向性含有4-1bb配体三聚体的fc(kih)融合抗原结合分子对重组tnc的结合。所有spr实验均于25℃在biacoret100上实施，以hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4，0.15mnacl，3mmedta，0.005％表面活性剂p20，biacore,freiburg/germany)。为了亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(gehealthcare)于ph5.0在cm5芯片上实施500个左右共振单位(ru)的重组人，食蟹猴和鼠tnc的直接偶联。使tnc靶向性含有4-1bb配体三聚体的fc(kih)融合抗原结合分子的稀释系列(0.05-50nm)以30μl/min在两个流动池上通过120秒以记录结合相。监测解离相180秒并通过自样品溶液切换至hbs-ep来触发。在每一个循环后，使用10mm甘氨酸-盐酸ph2.1双重注射60秒使芯片表面再生。通过减去在参照流动池1上获得的响应来校正本体(bulk)折射率差异。对于tnc靶向性含有4-1bb配体三聚体的fc(kih)融合抗原结合分子与重组tnc之间的相互作用，通过使用biaeval软件(gehealthcare)拟合至1:1朗格缪尔结合曲线，自速率常数推导亲和常数(表57)。表57：拟合1:1朗格缪尔结合和亲和常数实施例12tnc靶向性4-1bb分拆三聚体配体fc融合抗原结合分子的功能表征a)tnc靶向性分拆三聚体4-1bb配体在新鲜的和激活的人pbmc上的结合自zürich献血中心获得血沉棕黄层。为了分离新鲜的外周血单个核细胞(pbmc)，用相同体积的dpbs(gibcobylifetechnologies，目录号14190326)稀释血沉棕黄层。对50ml聚丙烯离心管(tpp,目录号91050)中供应15mlhistopaque1077(sigmalifescience，目录号10771，聚蔗糖和泛影酸钠，调节至1.077g/ml的密度)并使稀释的血沉棕黄层内容物在histopaque1077上方分层。将管以450xg离心30分钟。然后自界面收集pbmc，用dpbs清洗三次并重悬浮于由rpmi1640培养基(gibcobylifetechnology，目录号42401-042)组成的t细胞培养基中，所述rpmi1640培养基补充有10％(v/v)胎牛血清(fbs，美国来源，panbiotech，p30-2009，批号p150307gi，经伽马照射，无支原体，于56℃热灭活35分钟)，1％(v/v)glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目录号35050038)，1mm丙酮酸钠(sigma，目录号s8636)，1％(v/v)mem非必需氨基酸(sigma，目录号m7145)和50μmβ-巯基乙醇(sigma，m3148)。在分离后直接使用pbmc(在新鲜的人pbmc上的结合)，或者刺激它们以在t细胞的细胞表面上诱导4-1bb表达(在激活的人pbmc上的结合)。为了在人t细胞上诱导4-1bb上调，将pbmc在供应有10％fbs，1mm丙酮酸钠(sigma，目录号s8636)，1％gluta-max-i，1％mem非必需氨基酸溶液(sigma，目录号m7145)，50μmβ-巯基乙醇(sigmam3148)，200u/ml普留净(novartispharmaschweizag)和2μg/mlpha-l(sigma，目录号l2769)的rpmi1640中培养3天至1x106个细胞/ml的终浓度。在预激活后收获细胞并重悬浮于供应有10％fbs，1mm丙酮酸钠(sigma，目录号s8636)，1％gluta-max-i，1％mem非必需氨基酸溶液(sigma，目录号m7145)，50μmβ-巯基乙醇(sigmam3148)的rpmi1640并接种于6孔组织培养板(ttp，目录号92006)，所述板已经用10μg/ml抗人cd3(克隆okt3，小鼠igg2a，biolegend，目录号317315)和2μg/ml抗人cd28(克隆cd28.2，小鼠igg1，biolegend，目录号302923)于4℃包被过夜。将细胞于37℃和5％co2进一步温育3天。为了结合测定法，将0.1x106个新鲜的或激活的pbmc添加至圆底悬浮细胞96孔板(greinerbio-one，cellstar，目录号650185)的每个孔。将板以350xg且于4℃离心5分钟并丢弃上清液。之后，将细胞于4℃在黑暗中在100μl/孔含有1:5000稀释的可固定存活力染料ef660(ebioscience，目录号65-0864-18)的dpbs中染色30分钟。将细胞用200μl冷dpbs缓冲液清洗1次。接着，添加50μl/孔含有滴定浓度的构建体6.5和构建体6.6和作为对照的对照e，对照f和对照l的4℃冷facs缓冲液(dpbs，供应有2％fbs，5mmedtaph8(amresco，目录号e177)和7.5mm叠氮化钠(sigma-aldrich，目录号s2002))并将细胞于4℃温育60分钟并用200μl/孔4℃facs缓冲液清洗3次。将细胞进一步重悬浮于50μl/孔含有0.67μg/ml抗人cd45-af488(克隆hi30，小鼠igg1k，biolegend，目录号304019)，0.33μg/ml抗人cd8a-bv510(克隆sk1，小鼠igg1k，biolegend，目录号344732)，0.23μg/ml抗人cd4-bv421(克隆okt4，小鼠igg2bκ，biolegend，目录号317434)，0.67μg/ml抗人cd3-percp-cy5.5(克隆ucht1，小鼠igg1k，biolegend，目录号300430)，0.67μg/ml抗人cd19-pe/cy7(克隆hib19，小鼠igg1k，biolegend，目录号302216)，5μg/mlpe缀合的affinipure抗人iggf(ab`)2片段特异性山羊f(ab`)2片段(jacksonimmunoresearch，目录号109116098)的4℃冷facs缓冲液并于4℃温育30分钟。将细胞用200μl/孔4℃facs缓冲液清洗2次，然后用供应有1％甲醛(sigma，ht501320-9.5l)的dpbs固定。将细胞重悬浮于100μl/孔facs缓冲液并使用macsquantanalyzer10(miltenyibiotech)获取。使用flowjov10(flowjo，llc)和graphpadprism6.04(graphpadsoftware，inc)分析数据。设门于活的cd45+cd3+cd4+t细胞，cd45+cd3+cd8+t细胞，cd45+cd3+cd4-cd8-γδt细胞和cd45+cd3-cd19+b细胞并将pe缀合的affinipure抗人iggiggfcγ片段特异性山羊f(ab`)2片段的荧光强度的几何均值针对tnc靶向性或dp47非靶向性4-1bb分拆三聚体配体fc融合抗原结合分子及其对照的滴定浓度绘图。如图21中所示，所测试的tnc靶向性分拆三聚体4-1bb配体融合分子或其对照无一结合新鲜分离的pbmc的细胞。如图22中所示，在激活后活的cd45+cd3+cd4+t细胞，cd45+cd3+cd8+t细胞和cd45+cd3+cd4-cd8-γδt细胞表达人4-1bb。抗tnchuigg1p329glala对照l和dp47huigg1p329glala对照f并不结合激活的人pbmc。所有含有4-1bb分拆三聚体配体的分子，如构建体6.5，构建体6.6和对照e，均结合激活的cd8+t细胞，cd4+t细胞和γδt细胞。在表58中汇总对激活的人pbmc的结合曲线的ec50值。表58：对激活的人pbmc的结合曲线的ec50值对照e构建体6.5构建体6.6在激活的cd4t细胞上的ec50[nm]0.231.118.56在激活的cd8t细胞上的ec50[nm]0.261.281.29在激活的γδt细胞上的ec50[nm]0.231.790.80b)表达人tnc的肿瘤细胞的结合为了表达tnc的肿瘤细胞上的结合测定法，使用人成胶质细胞瘤细胞系u87-mg(atcchtb-14)。将重悬浮于冷dpbs(gibcobylifetechnologies，目录号14190326)的0.2x106个肿瘤细胞添加至圆底悬浮细胞96孔板(greinerbio-one，cellstar，目录号650185)的每个孔。将细胞用200μldpbs清洗1次。将细胞重悬浮于100μl/孔含有1:5000稀释的可固定存活力染料efluor660(ebioscience，目录号65-0864-18)的4℃冷dpbs缓冲液并将板于4℃温育30分钟。将细胞用200μl/孔4℃冷dpbs缓冲液清洗1次并重悬浮于50μl/孔以一系列浓度含有tnc靶向性4-1bb分拆三聚体配体fc融合抗原结合分子或其对照的4℃冷facs缓冲液(dpbs，供应有2％fbs，5mmedtaph8(amresco，目录号e177)和7.5mm叠氮化钠(sigma-aldrichs2002))，接着于4℃温育1小时。广泛清洗后，将细胞于4℃用50μl/孔含有5μg/mlpe缀合的affinipure抗人iggf(ab`)2片段特异性山羊f(ab`)2片段(jacksonimmunoresearch，目录号109116098)的4℃冷facs缓冲液进一步染色30分钟。将细胞用200μl/孔4℃facs缓冲液清洗2次并在50μl/孔含有1％甲醛(sigma，ht501320-9.5l)的dpbs中固定细胞。将细胞重悬浮于100μl/孔facs缓冲液并使用macsquantanalyzer10(miltenyibiotech)获取。使用flowjov10(flowjo，llc)和graphpadprism6.04(graphpadsoftware，inc)分析数据。设门于活的肿瘤细胞并将pe缀合的affinipure抗人iggiggfcγ片段特异性山羊f(ab`)2片段的荧光强度的几何均值针对tnc靶向性4-1bb分拆三聚体配体fc融合抗原结合分子或其对照的滴定浓度绘图。如图23中所示，仅tnc靶向性分子构建体6.5，构建体6.6和对照l结合表达tnc的u87-mg，而非tnc靶向性对照对照e和对照f并不结合肿瘤细胞。在表59中列出曲线的ec50值。表59：表达tnc的肿瘤细胞的结合曲线的ec50值构建体6.5构建体6.6对照l在u87mg上的ec50[nm]73.9912.754.24c)表达人4-1bb的hela报告细胞系的生物学活性：nf-κb激活表达人4-1bb和nf-κb-萤光素酶的hela报告细胞的生成用基于表达载体petr10829的质粒转导人乳头瘤病毒18诱导的宫颈癌细胞系hela(atccccl-2)，所述表达载体petr10829含有在cmv启动子和嘌呤霉素抗性基因控制下的人4-1bb的序列(uniprot登录号q07011)。在供应有10％胎牛血清(fbs，gibcobylifetechnologies，目录号16000-044，批号941273，经伽马照射，无支原体，于56℃热灭活35分钟)，1％glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目录号35050-038)和3μg/ml嘌呤霉素(invivogen，目录号ant-pr)的dmem培养基(gibcobylifetechnologies，目录号42430-025)中培养细胞。通过流式细胞术对4-1bb转导的hela细胞测试4-1bb表达：将0.2x106个活细胞重悬浮于100μlfacs缓冲液(dpbs，供应有2％fbs，5mmedtaph8(amresco，目录号e177)和7.5mm叠氮化钠(sigma-aldrich，目录号s2002))中，所述缓冲液含有0.1μgpercp/cy5.5缀合的抗人4-1bb小鼠igg1κ克隆4b4-1(biolegend目录号309814)或其同种型对照(percp/cy5.5缀合的小鼠igg1κ同种型对照抗体克隆mopc21，biolegend目录号400150)并于4℃温育30分钟。将细胞用facs缓冲液清洗两次，重悬浮于300μl含有0.06μg/mldapi(santacruzbiotec，目录号sc-3598)的facs缓冲液并使用5激光lsr-fortessa(bdbioscience，diva软件)进行获取。如下实施有限稀释以生成单克隆：将人4-1bb转导的hela细胞重悬浮于培养基至10，5和2.5个细胞/ml的浓度并将200μl细胞悬浮液转移至组织培养物处理的圆底96孔板(6块板/细胞浓度，tpp目录号92697)。如上所述收获单克隆，扩充并测试4-1bb表达。选择具有最高4-1bb表达的克隆(克隆5)，以备后续用nfκb-萤光素酶表达载体5495ptranlucenthygb转染使用。载体对转染细胞赋予针对潮霉素b的抗性和在nfkb应答元件控制下表达萤光素酶的能力二者(panomics，目录号ll0051)。培养人4-1bbhela克隆5细胞至70％汇合。将50μg(40μl)线性化(限制酶asei和sali)5495ptranlucenthygb表达载体添加至无菌0.4cmgenepulser/micropulsercuvette(biorad，目录号165-2081)。添加400μl无补充物的dmem中的2.5x106个人4-1bbhela克隆5细胞并与质粒溶液小心混合。使用genepulserxcell总系统(biorad，目录号165-2660)在下述设置下实施细胞的转染：指数式脉冲，电容500μf，电压160v，电阻∞。在脉冲后立即将转染细胞转移至装有15ml的37℃温热dmem培养基(gibcobylifetechnologies，目录号42430-025)的75cm2的组织培养瓶(tpp，目录号90075)，所述培养基供应有10％fbs和1％glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目录号35050038)。次日，添加含有3μg/ml嘌呤霉素(invivogen，目录号antpr)和200μg/ml潮霉素b(roche，目录号10843555001)的培养培养基。扩充存活细胞并如上所述实施有限稀释以生成单克隆。如上所述对克隆测试4-1bb表达并如下测试nfκb-萤光素酶活性：在选择培养基中收获克隆并使用cellcountervi-cellxr2.03(beckmancoulter，目录号731050)计数。将细胞设定为0.33x106个细胞/ml的细胞密度并将150μl此细胞悬浮液转移至带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbio-one，目录号655083)的每个孔并转移至正常96孔平底组织培养板(tpp，目录号92096)作为对照，次日测试存活和细胞密度。将细胞于37℃和5％co2温育过夜。次日，将50μl含有不同浓度的重组人肿瘤坏死因子α(rhtnfα,peprotech，目录号30001a)的培养基添加至96孔板的每个孔，得到100，50，25，12.5，6.25和0ng/孔的rhtnfα终浓度。将细胞于37℃和5％co2温育6小时，然后用200μl/孔dpbs清洗3次。将报告物裂解缓冲液(promega，目录号e3971)添加至每个孔(30μl)并将板于-20℃保存过夜。次日将冷冻细胞板和检测缓冲液(luciferase1000assaysystem，promega，目录号e4550)解冻至室温。将100μl检测缓冲液添加至每个孔并使用spectramaxm5/m5e微量板读数仪和softmaxprosoftware(moleculardevices)尽可能快地测量板。采取测量到的高于对照(不添加rhtnf-α)的url作为萤光素酶活性。选择展现最高萤光素酶活性和可观水平的4-1bb表达的nfκb-luc-4-1bb-hela克隆26以备进一步使用。与表达tnc的u87mg和skk-mel5细胞共培养的表达人4-1bb的hela报告细胞的nf-κb激活将贴壁人成胶质细胞瘤细胞系u87mg(atcchtb-14)用dpbs(gibcobylifetechnologies，目录号14190326)清洗并于37℃用无酶，基于pbs的细胞解离缓冲液(gibcobylifetechnologies，目录号13151-014)处理10分钟。之后，收获细胞并使用cellcountervi-cellxr2.03计数。将细胞重悬浮于供应有10％胎牛血清(fbs，美国起源，panbiotech，p30-2009，批号p150307gi，经伽马照射，无支原体，于56℃热灭活35分钟)和1％glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目录号35050038)的dmem培养基(gibcobylifetechnologies，目录号42430025)至1x106个细胞/ml并将100μl/孔添加至带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbio-one，目录号655083)。对于阴性对照，添加100μl培养基。将板于37℃和5％co2温育过夜。次日，添加不同的滴定的含有分拆三聚体4-1bb配体的融合分子及其对照。之后，将nfκb-luc-4-1bb-hela克隆26细胞用dpbs清洗并于37℃用0.05％胰蛋白酶edta(gibcobylifetechnologies，目录号25300054)处理5分钟。收获细胞并重悬浮于供应有10％胎牛血清和1％glutamax-i的dmem培养基。使用cellcountervi-cellxr2.03(beckmancoulter，目录号731050)对细胞计数并设定0.4x106个细胞/ml的细胞密度。将50μl(2x104个细胞)此细胞悬浮液转移至每个孔。将板于37℃和5％co2温育6小时。将白色平底96孔板用200μl/孔dpbs清洗3次。将40μl新鲜制备的报告物裂解缓冲液(promega，目录号e3971)添加至每个孔并将板于-20℃保存过夜。次日将冷冻板和检测缓冲液(luciferase1000assaysystem，promega，目录号e4550)解冻至室温。将100μl检测缓冲液添加至每个孔并以下述设置使用spectramaxm5/m5e微量板读数仪和softmaxprosoftware(moleculardevices)尽可能快地测量板：对于萤光素酶(rlu)，500ms积分时间，无滤光片，收集所有波长和顶部读取。表60：nfκb激活诱导的萤光素酶活性曲线的ec50值构建体6.5构建体6.6u87mgec50[nm]0.330.70d)在表达tnc的肿瘤细胞存在下人pbmc的激活测定法为了tnc结合介导的交联，使用表达tnc的贴壁人成胶质细胞瘤细胞系u87mg(atcchtb-14)。将u87mg细胞用dpbs(gibcobylifetechnologies，目录号14190326)清洗并于37℃用无酶，基于pbs的细胞解离缓冲液(gibcobylifetechnologies，目录号13151-014)处理10分钟。收获细胞并重悬浮于由供应有10％胎牛血清(fbs，美国起源，panbiotech，p30-2009，批次p150307gi，经伽马照射，无支原体，于56℃热灭活35分钟)，1％l-glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目录号35050-038)，1mm丙酮酸钠(sigma-aldrich，目录号s8636)，1％mem非必需氨基酸溶液(sigma-aldrich，目录号m7145)，50μmβ-巯基乙醇(sigma-aldrich，目录号m3148)的rpmi1640(gibcobylifetechnologies，目录号42401-042)组成的t细胞培养基并以50gy照射(x射线辐照器rs2000，radsource)。将50μlt细胞培养基中的2x104个u87mg细胞接种至圆底组织培养96孔板(ttp，目录号92697)的每个孔。添加50μl含有不同滴定浓度的构建体6.5和6.6或拟合对照(对照f，对照l和对照e)的t细胞培养基。于37℃将人pbmc在含有40nmcfda-se(sigma-aldrich，目录号21888-25mg-f)的37℃温热dpbs中标记15分钟。通过添加fbs来终止cfse标记，将pbmc清洗2次并重悬浮于t细胞培养基至1.5x106个细胞/ml的终浓度。将50μl此pbmc细胞溶液接种至每个孔，例如，将7.5x104个cfse标记的pbmc添加至每个孔。最终，制备含有8nm激动性抗人cd3人igg1克隆v9的t细胞培养基的储备溶液并将50μl/孔添加至每个孔，给出2nm抗人cd3人igg1克隆v9的终浓度。将板于37℃温育4天。将细胞用dpbs清洗并于4℃用100μl/孔含有1:1000稀释的活/死可固定aqua死细胞染料试剂盒(molecularprobesbylifetechnology，目录号l34957)的dpbs染色30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗1次并于4℃用50μl含有0.1μg/mlpercp-cy5.5缀合的抗人cd137小鼠igg1κ(克隆4b4-1，biolegend，目录号309814)，0.1μg/mlpe/cy7缀合的抗人pd-1小鼠igg1κ(克隆eh12.2h7，biolegend，目录号329918)，0.03μg/mlapc缀合的抗人cd25小鼠igg1κ(克隆bc96，biolegend，目录号302610)，0.06μg/mlapc/cy7缀合的抗人cd8小鼠igg1κ(克隆rpa-t8，biolegend，目录号3301016)，bv421缀合的抗人cd4小鼠igg1κ(克隆rpa-t4，biolegend，目录号300532)的facs缓冲液(dpbs，供应有2％fbs，5mmedtaph8(amresco，目录号e177)和7.5mm叠氮化钠(sigma-aldrichs2002))染色30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗2次并于4℃与50μl/孔新鲜制备的foxp3透化/固定缓冲液(ebioscience，目录号00-5123)一起温育30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗2次，重悬浮于50μl/孔新鲜制备的供应有1:250稀释的pe缀合的抗人粒酶b小鼠igg1κ(克隆gb11，批次4269803，bdpharmingen，目录号561142)的透化缓冲液(ebioscience，目录号00-8333)并于4℃温育1小时。将板用200μl/孔dpbs清洗2次并将细胞用含有1％甲醛(sigma，ht501320-9.5l)的dpbs固定15分钟。将细胞重悬浮于100μl/孔facs缓冲液并使用macsquantanalyzer10(miltenyibiotech)获取。使用flowjov10(flowjo，llc)和graphpadprism6.04(graphpadsoftware，inc)分析数据。如图27中所示，仅tnc靶向性分拆三聚体4-1bbl融合分子构建体6.6和程度较低的构建体6.5诱导cd8+t细胞上cd25和4-1bb表面表达的浓度依赖性升高。阴性对照分子(对照f，对照l和对照e)并不诱导这种激活标志物上调。相关ec50值在表61中列出。表61：激活的cd8+t细胞上的cd25和4-1bb(cd137)上调的ec50值构建体6.5构建体6.6％cd25+cd8ec50[nm]0.130.29％cd137(4-1bb)+cd8ec50[nm]0.360.13引证文献ascierto,p.a.,e.simeone,m.sznol,y.x.fu,andi.melero(2010),clinicalexperienceswithanti-cd137andanti-pd1therapeuticantibodies.seminoncol37:508-516.aggarwalb.b.(2003),signallingpathwaysofthetnfsuperfamily:adouble-edgedsword.nat.rev.immunol.3(9),745-56.bannerd.etal(1993),crystalstructureofthesolublehuman55kdtnfreceptor-humantnfbetacomplex:implicationsfortnfreceptoractivation.cell73,431-445.bergetal.(2007),enforcedcovalenttrimerizationincreasestheactivityofthetnfligandfamilymemberstrailandcd95l.celldeatchanddifferentiation14(12),2021-2034.bodmerj.,schneiderp.andtschopp,j.(2002),themoleculararchitectureofthetnfsuperfamily.trendsinbiochemicalsciences27(1),19-26.broll,k.,richter,g.,pauly,s.,hofstaedter,f.,andschwarz,h.(2001).cd137expressionintumorvesselwalls.highcorrelationwithmalignanttumors.amjclinpathol115,543-549.buechele,c.,baessler,t.,schmiedel,b.j.,schumacher,c.e.,grosse-hovest,l.,rittig,k.,andsalih,h.r.(2012).4-1bbligandmodulatesdirectandrituximab-inducednk-cellreactivityinchroniclymphocyticleukemia.eurjimmunol42,737-748.choi,b.k.,kim,y.h.,kwon,p.m.,lee,s.c.,kang,s.w.,kim,m.s.,lee,m.j.,andkwon,b.s.(2009).4-1bbfunctionsasasurvivalfactorindendriticcells.jimmunol182,4107-4115.cuadros,c.,dominguez,a.l.,lollini,p.l.,croft,m.,mittler,r.s.,borgstrom,p.,andlustgarten,j.(2005).vaccinationwithdendriticcellspulsedwithapoptotictumorsincombinationwithanti-ox40andanti-4-1bbmonoclonalantibodiesinducestcell-mediatedprotectiveimmunityinher-2/neutransgenicmice.intjcancer116,934-943.curran,m.a.,kim,m.,montalvo,w.,al-shamkhani,a.,andallison,j.p.(2011).combinationctla-4blockadeand4-1bbactivationenhancestumorrejectionbyincreasingt-cellinfiltration,proliferation,andcytokineproduction.plosone6,e19499.diehl,l.,vanmierlo,g.j.,denboer,a.t.,vandervoort,e.,fransen,m.,vanbostelen,l.,krimpenfort,p.,melief,c.j.,mittler,r.,toes,r.e.,andoffringa,r.(2002).invivotriggeringthrough4-1bbenablesth-independentprimingofctlinthepresenceofanintactcd28costimulatorypathway.jimmunol168,3755-3762.dubrot,j.,milheiro,f.,alfaro,c.,palazon,a.,martinez-forero,i.,perez-gracia,j.l.,morales-kastresana,a.,romero-trevejo,j.l.,ochoa,m.c.,hervas-stubbs,s.,etal.(2010).treatmentwithanti-cd137mabscausesintenseaccumulationsoflivertcellswithoutselectiveantitumorimmunotherapeuticeffectsinthisorgan.cancerimmunolimmunother59,1223-1233.futagawa,t.,akiba,h.,kodama,t.,takeda,k.,hosoda,y.,yagita,h.,andokumura,k.(2002).expressionandfunctionof4-1bband4-1bbligandonmurine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