细胞培养室及其使用方法与流程

本申请要求2016年6月29日提交的美国临时申请62/356,504号和2016年7月1日提交的美国临时申请62/357,937号的权益和优先权，两者均通过引用整体并入本文。

政府资助

本发明是在国家科学基金会颁发的拨款号1645205的政府资助下完成的，政府拥有本发明的某些权利。

本发明大体上涉及细胞培养室及其使用方法。

背景技术：

由于基于嵌合抗原受体t细胞(car-t)疗法、t细胞受体(tcr)疗法、树突状细胞疫苗和基于新生抗原的t细胞疗法对于某些癌症是非常有希望的治疗，基于细胞的癌症免疫疗法受到了很多关注。在基于新生抗原的t细胞疗法中，从肿瘤测序数据中预测候选新生抗原和监测患者中新生抗原特异性t细胞响应的能力为设计高度个性化的免疫治疗剂提供了基础。

虽然用于癌症的t细胞疗法具有很大的前景，但是用于分离、制备和扩增癌症抗原特异性t细胞的现有方法是有限的。目前，使用劳动密集型、手动、多步骤方法准备t细胞疗法，这对于制造这种t细胞疗法的规模化提出了严峻挑战。由于与t细胞疗法生产相关的复杂生物过程以及与自体细胞处理相关的生物过程和监管要求，所述方法的自动化是不成功的。还存在另外的挑战，例如细胞制备时间、最佳表型的维持、足够细胞数量的扩增以及细胞产品的品质和安全性。

如图1所示，用于通过自体抗原呈递性树突状细胞(dc)刺激人t细胞的常规现有技术方案包括几个手动步骤，包括上清液在培养板之间的转移，培养基的更换，细胞因子和细胞培养基的添加等。使t细胞与树突状细胞(dc)接触7天，在此期间它们受到刺激并扩增。该过程通常重复四次，每个刺激周期需要提取上清液中的t细胞并用新鲜dc铺板，同时还手动更换培养基和生长因子(细胞因子)，通常在每七天期间更换两次。执行该方案所需的手动步骤数量非常高。例如，使用这种传统的四周方案，总共采取大约4,650个手动步骤，所有这些步骤都增加了污染的风险并且可能损害细胞产品的品质和安全性。

技术实现要素：

本发明认识到需要开发自动化生产抗原特异性t细胞的新技术。本发明的示例性实施方式的细胞培养室包括各种技术特征，所述技术特征允许上述手动过程的自动化，显著减少用户对过程的干预，从而显著降低污染的风险。例如，本实施方式的细胞培养室被制造成包括底表面和至少一个另外的表面，所述底表面由用来附着细胞的材料制成，所述另外的表面例如侧壁和/或顶壁，其由透气性材料制成。以这种方式，与现有技术的培养系统相比，实现了更高水平的气体交换而不必牺牲底表面的附着性质。另外，该实施方式的细胞培养室被配置成允许将培养基和细胞因子灌注到室中，从而使得可以保持更一致的水平。为了确保抗原特异性t细胞和参与培养过程的其他细胞在灌注期间保留在室中，细胞培养室的一个或多个入口和出口被布置成使流体在细胞培养室内在离开室时至少部分地沿着垂直流动路径运动。细胞培养室还被配置成彼此流体连接，使得抗原特异性t细胞可以在室之间自动转移，以允许在新的细胞培养室中进一步培养和扩增t细胞。在一些实施方式中，通过将气流引入第一细胞培养室来实现转移，以使包含第一细胞产物的上清液通过流体连接器转移并进入第二细胞培养室中。

在某些方面，示例性实施方式的细胞培养室使用来自同一患者的抗原呈递细胞提供t细胞的扩增和刺激，以提供可以以选择性地靶向患者的肿瘤的方式动员患者自身免疫系统的治疗性t细胞产物。与常规方案相比，这些细胞培养系统和方法大大地减少了手动步骤的数量。以这种方式，污染的风险大大降低，并且制造技术的稳健性和再现性大大增加，二者都是安全可靠地制造治疗产品的关键考虑因素，所述治疗产品例如能够精确靶向的个性化t细胞疗法。

除了简化并可能缩短产生免疫治疗产品的过程之外，示例性实施方式的细胞培养室显著提高了患者的细胞材料在基于细胞的疗法中的利用以及制造过程的可靠性和稳健性，同时还导致成本降低(例如，劳动力成本)。此外，从处理仅少数患者样品到100个患者样品，方法很容易规模化。本实施方式的细胞培养室的构造允许自动化流体流动控制以使抗原呈递细胞与含有t细胞的细胞接触，以及在必要时更新抗原呈递细胞，以便将抗原呈递t细胞刺激和扩增至能够在患者中产生治疗响应的数量。这种设计也很容易规模化。例如，通过设计具有一系列并行布置的细胞培养室的系统，单个系统可以处理的样品为1-10至100或数百个样品。可以独立地控制每个室，并且可以根据样品的数量按比例增减在任何给定时间使用的室的数量。在其他实施方式中，单个中央控制器(例如plc逻辑控制器)，控制系统中的所有室。

现在描述示例性布置，其中本发明的示例性实施方式的系统和方法利用一个或多个生物反应器，每个生物反应器包括细胞培养室，所述生物反应器被配置成彼此流体连接以执行患者细胞材料的处理，从而生产免疫治疗产品。本领域技术人员将理解，这是本文描述的示例性布置，并且其他布置在本发明的范围内。

在该示例性实施方式中，提供细胞培养室，其包括底表面，所述底表面包含用来附着细胞的第一材料；至少一个另外的表面，其中所述至少一个另外的表面包含透气性的第二材料；一个或多个入口；和一个或多个出口，其中一个或多个入口和一个或多个出口布置成使流体在细胞培养室内至少部分地沿着垂直流动路径运动。在某些方面，流体沿垂直流动路径的运动使得流体流速不足以克服细胞培养室内细胞的沉降速率。

与常规方案相比，提供至少一个另外的透气性表面允许更高水平的气体交换，从而允许在室中处理更多数量的细胞。在某些方面，底表面和至少一个另外的表面在不使用粘合剂的情况下连接在一起。在某些实施方式中，至少一个另外的表面也包含第一材料。

第一材料可包括例如聚苯乙烯。第二材料可以包括一种或多种材料，该材料的氧的渗透性等于或大于350的渗透系数，其二氧化碳的渗透性大于或等于2000的渗透系数，其中渗透系数的单位是[cm³][cm]/[cm²][s][cmhg]。在一个方面，第二材料选自聚硅氧烷和聚甲基戊烯中的一种或两种。

在某些方面，细胞培养室包括至少一个流体连接器，其配置成将细胞培养室流体连接至第二容器，第二容器可以是第二细胞培养室。为了帮助流体流过每个室和流过室之间，细胞培养室可包括一个或多个泵。每个室可以包括其自身的的泵，并且一个或多个泵可以为服务多个室。在其他方面，细胞培养室还包括一个或多个流体贮存器，其可操作地连接到一个或多个泵。流体贮存器被配置成向室供应包括营养物和细胞因子的培养基。

细胞培养室还可以包括一个或多个传感器，其以允许传感器测量细胞培养室内的一个或多个参数的方式可操作地连接到细胞培养室，所述参数例如ph、溶解氧、总生物量、细胞直径、葡萄糖浓度、乳酸盐浓度和细胞培养室内的细胞代谢物浓度。细胞培养室还可以包括中央处理单元，该中央处理单元可通信地连接到一个或多个传感器，并被配置成根据所测量的所述一个或多个参数来调节所述一个或多个泵的操作状态；在采用流动产生机构而不是泵的实施方式中，例如电流体动力学机构，中央处理单元可以改变流动产生机构的操作状态，以根据一个或多个参数调节第一细胞产物的流动速率。

在某些实施方式中，为了帮助维持细胞培养室内和周围的所需环境，将室的大小和构造设计成适合放在培养箱内。在一些实施方式中，一个或多个泵位于培养箱内。在其他实施方式中，一个或多个泵位于培养箱外部并可操作地连接到培养箱内的细胞培养室。

在某些方面，该系统的至少一部分包括一次性组件，其中的一些或全部组件可以容纳在非一次性框架内。在其他方面，系统的所有组件都是一次性的。此外，在一些实施方式中，该系统包括用于跟踪和记录患者材料的样品跟踪组件。

将系统和方法设计成使得可以提供任何数量的另外的反应器或细胞培养室。在一些实施方式中，该系统包括两个以上用于产生t细胞的生物反应器室，如图6a和6b所示。尽管图6a和6b中的系统显示为具有彼此流体连通的两个细胞培养室，应当理解，系统可以使用任何数量的另外的室。

在某些实施方式中，本发明的系统具有在给定各种输入的情况下自动计算和设定灌注流体的所需灌注速率的能力，所述给定各种输入例如是细胞培养室的大小和两种以上细胞类型(包括树突状细胞和外周血单个核细胞)的浓度。在示例性布置中，提供了细胞培养系统，其包括一个或多个细胞培养室和中央处理单元，所述中央处理单元包括含有可由中央处理单元执行的指令的存储器，以使得系统接收包含所述细胞培养室的大小的数据作为第一输入，接收包含将被引入所述细胞培养室中的一种或多种流体中的第一细胞类型的第一浓度和第二细胞类型的第二浓度的数据作为第二输入，并且基于所述第一输入和第二输入，计算将被引入所述细胞培养室中的灌注流体的灌注速率，所述灌注速率使所述第一细胞类型和所述第二细胞类型在所述细胞培养室内彼此接触的概率最大化。在某些方面，第一细胞类型是外周血单个核细胞，并且第二细胞类型是树突状细胞。

中央处理单元可以通过控制可操作地连接到一个或多个灌注流体贮存器和中央处理单元的一个或多个泵(或阀)来控制灌注流体的灌注速率。在某些方面，一个或多个传感器以允许传感器测量细胞培养室内的一个或多个参数的方式可操作地连接到细胞培养室。这些参数包括ph、溶解氧、总生物量、细胞直径、葡萄糖浓度、乳酸盐浓度和细胞代谢物浓度。

在本发明的另一方面，提供了一种用于将细胞从第一细胞培养室转移至第二细胞培养室中的方法。该方法通常包括在第一细胞培养室中以产生包含第一细胞产物的上清液的方式培养细胞，并将气流引入第一细胞培养室以将包含第一细胞产物的上清液通过流体连接器转移并且进入第二细胞培养室。一旦流体进入第二细胞培养室，就进一步培养第一细胞产物。

与将流体从第一细胞培养室转移至第二细胞培养室类似，该方法还可以包括将气流引入第二细胞培养室以使包含进一步培养的第一细胞产物的上清液转移通过流体连接器并进入第三细胞培养室。在一个实施方式中，在至少三个不同时间发生上清液的转移，因此使用至少四个培养室来产生所需量的抗原呈递t细胞。

此外，在某些方面，如上所述，一个或多个细胞培养室被配置成使流体(例如灌注流体)在室中沿垂直流动路径运动(图8c)。流体的运动使得流体流速不足以克服细胞培养室内细胞的沉降速率。

在本发明的另一方面，产生免疫治疗产品的方法包括在第一细胞培养室中培养外周血单个核细胞和树突状细胞以产生包含t细胞的上清液，并将气流引入第一细胞培养室中以使包含t细胞的上清液通过流体连接器转移并进入第二细胞培养室中。在某些方面，新鲜的树突状细胞包含在第二细胞培养室内，并且在第二细胞培养室内进一步培养t细胞。

在第一培养室内的培养可以在第一组一种或多种刺激性抗原的存在下进行，第二培养室内的培养可以在第二组刺激性抗原存在下进行。在某些实施方式中，第一组刺激性抗原和第二组刺激性抗原是相同的。而在其他实施方式中，第一组刺激性抗原和第二组刺激性抗原是不同的。

附图说明

根据如附图中所示的示例性实施方式的以下更具体的描述，前述内容将变得显而易见，在附图中，相同的附图标记在不同视图中指代相同的部件。附图不一定按比例绘制，而是将重点放在说明实施方式上。专利或申请文件包含至少一幅彩色绘制的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将由主管局根据请求并支付必要的费用后提供。

图1显示了用于生产免疫治疗产品的现有手动技术。

图2显示了根据本发明的一个实施方式生产免疫治疗产品的示例性方法。

图3是描绘在一个实施方式中的本发明系统的示意图，其中显示了一个细胞培养室。

图4a-e描绘了根据本发明实施方式的示例性细胞培养室构造。

图5描绘了细胞培养室的表面，其具有将可渗透聚合物引入到另一聚合物的框架内的构造。

图6a-c描绘了用于连接细胞培养室并在它们之间转移流体的过程的示意性代表图。图6a是如图3所示的第一细胞培养室的示意图。图6b示出了第一细胞培养室中的部分扩增的t细胞，和第二细胞培养室移动到连接到第一细胞培养室的位置。图6c示出了将无菌空气注入第一细胞培养室以将含有扩增的t细胞的上清液转移至第二细胞培养室中。

图7描绘了根据一个实施方式流体从一个细胞培养室的出口到两个细胞培养室的入口的流动。

图8a-d描绘了通过各种室构造的流体流动。图8a和b描绘了流体进、出细胞培养室的平面流动。图8c和d描绘了具有对称流入和垂直流出的构造。

图9描绘了t细胞和抗原呈递细胞之间相互作用的基于动力学参数的建模。

图10描绘了根据某些实施方式的本发明的系统。

具体实施方式

本发明的装置、系统和方法使得可以自动化以及远程监测和控制产生足够量的抗原特异性t细胞的方法，以用于涉及培养自体细胞的个体化靶向癌症或传染病疗法。本发明的系统和方法包括允许将上述手动过程自动化的各种技术特征。这些技术特征包括但不限于：1)将细胞室构造成包括由用来附着细胞的材料制成的底表面和由透气性材料制成的至少一个另外的表面，使得实现更高水平的气体交换，2)将细胞培养室的一个或多个入口和出口布置成使流体在离开室时在细胞培养室内沿垂直流动路径运动，以确保细胞培养过程中涉及的抗原特异性t细胞和其他细胞在灌注培养基期间保留在室中；和3)通过将气流引入第一细胞培养室中以将细胞通过流体连接器转移并进入第二细胞培养室，从而将抗原特异性t细胞从一个室自动转移至另一个室。

本发明的方法、装置和系统可以规模化以提供大量基于细胞的免疫治疗产品，并且可以对于单个受试者或对于几个受试者平行操作(由此他们的细胞及其子代保持分离)。与现有技术的方法和装置相比，本发明的方法和系统在其操作中是稳健的，能够提供高产品产量，简单有效，涉及较少的污染风险，并且将劳动力成本降至最低。

图2显示了使用本文描述的系统产生基于细胞的免疫治疗产品的方法的概况。简言之，根据本发明某些实施方式产生细胞治疗产物的步骤包括在含有细胞培养室的生物反应器中共培养受刺激的抗原呈递细胞和含有t细胞的细胞。在培养期间产生含有扩增的治疗性t细胞产物的上清液。在某些方面，为了产生足以在患者中引发治疗响应的量的抗原特异性t细胞，t细胞必须在一个或多个另外的细胞培养室中进行另外的培养。为了实现这种另外的培养，必须发生上清液从其中产生上清液的培养室转移至含有新鲜供应的抗原呈递细胞的后续细胞培养室。细胞培养室之间的上清液的转移可以包括将气流引入第一细胞培养室，这将包含第一细胞产物的上清液通过流体连接器转移至新的细胞培养室中。此外，在每个培养步骤中，可以将含有例如培养基和细胞因子的灌注流体灌注到室中。在某些方面，灌注流体沿垂直流动路径流动通过室，以确保细胞在培养期间保留在室内。使用本发明系统时涉及的唯一手动步骤是向系统提供一个或多个后续生物反应器，每个反应器含有细胞培养室，每个室含有新批次的经抗原肽冲击刺激的自体抗原呈递细胞。

根据本发明实施方式的产生基于细胞的免疫治疗产品的方法比现有技术的方法简单有效得多。图1示出了现有技术的传统方案，其需要至少4,650个手动步骤，如前所述。相反，本发明的系统和方法，如图2-4所示和本文所述，将为产生相同细胞剂量而必须采用的手动步骤的数量降低了25倍，如以下表所示。

表1.抗原特异性t细胞生成的典型步骤

本发明的细胞培养室显著改善了免疫治疗产品的制造，提供了基于流动的免疫治疗剂生产技术，具有无与伦比程度的一致性、品质、安全性、经济性、可扩展性、灵活性和便携性。

现在描述示例性布置，其中本发明的系统和方法利用一个或多个生物反应器，每个反应器包含细胞培养室，其配置成彼此流体连接，以用于进行患者细胞材料的处理从而产生免疫治疗产品。应该理解，在某些实施方式中，生物反应器设置在封闭环境中。通过添加模块(例如，生物反应器)以允许串行和/或并行处理，该示例性实施方式的放大将在本领域技术人员的知识范围内。本领域技术人员还将认识到，基于待生产的产品可能需要不同的或替代性的布置。

在示例性实施方式中，如图3所示，提供生物反应器110，其包括细胞培养室120，细胞培养室120包括底表面122和至少一个另外的表面124。底表面122由用来附着细胞的第一材料组成，其中至少一个另外的表面124由透气性的第二材料组成。细胞培养室还包括一个或多个入口126、136和一个或多个出口128、138。在某些实施方式中，生物反应器还包括至少一个灌注流体贮存器132，至少一个废物流体贮存器134，用于使灌注流体运动通过室120的至少一个泵140，以及用于将流体输送到贮存器132、134和离开贮存器132、134以及通过室120的相关的入口136和出口138。

关于细胞培养室120，第一材料可以是任何生物相容并且抗原呈递细胞(apc)如树突状细胞(dc)将附着于其上的材料。在细胞培养室120中发生的t细胞刺激和扩增过程期间，成熟的apc将发展并优选地附着到底表面122，而t细胞保留在位于底表面上方的上清液中，这使得更容易分开地获得扩增的t细胞。

在一个示例性实施例中，第一材料包括聚苯乙烯。将聚苯乙烯用于将进行培养的底表面的一个益处是该材料在从pbmc产生树突状细胞的过程中起到的有用作用。具体地，聚苯乙烯表面可用于从pbmc的异质悬浮液中富集单核细胞。这是用于通过在含有例如il4和gm-csf的培养基中经由培养而分化单核细胞来产生dc的培养过程的第一步。从生物过程的角度来看，对于全程通过一个循环的t细胞刺激生产树突状细胞而言，使用相同的聚苯乙烯表面非常有价值的，因为它消除了否则将需要的大量转移步骤，从而允许将封闭系统用于dc刺激的治疗性t细胞制造。

底表面可具有与常规孔板相当的表面积，例如6孔板和24孔板(分别为9.5cm²和3.8cm²)。还应理解，表面积可以比常规孔板小或甚至大得多(例如，具有与标准细胞培养皿和瓶相当的表面积)，例如表面积为约2.0cm²至约200cm²，例如约2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9,0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、100.0、125.0、150.0、175.0和200.0cm²，以及介于两者之间的任何表面积。

至少一个另外的表面124可包括任何构造，例如一个或多个侧壁和顶壁。在一个实施方式中，如图3所示，侧壁可以布置成彼此相对成90度角，从而使得盒形状与底表面122结合形成。在另一个实施方式中，至少一个另外的表面124形成弯曲侧壁，从而形成圆柱体、椭圆柱体或圆锥体，如图4a-c中所示。在另一个示例性布置中，至少一个另外的表面可以在底表面上形成圆顶状形状，如图4d所示。在其他实施方式中，侧壁可以形成三角形形状，如图4e所示。应当理解，上述示例性构造是非限制性的，并且至少一个另外的表面可以具有在前述示例性构造中未提供的其他构造。

在另一个实施方式中，至少一个另外的表面124包括透气性的第二材料，以实现在细胞培养室内发生的气体交换。通过将细胞培养室制作成使得底表面由用来附着细胞的材料(例如聚苯乙烯)制成，并且至少一个另外的表面(例如侧壁和/或顶壁)至少部分地由透气性材料制成，在本发明实施方式的系统中实现了高表面积-气体交换。除了底表面之外，具有高渗透性的大表面与现有技术培养系统(其可包含的培养基的量受限和/或缺乏细胞可以附着于其上的培养友好性表面)相比，提供了实现更高水平的气体交换而不必牺牲底表面的附着性质的能力。

在某些实施方式中，第二材料包括一种或多种材料，所述材料对氧的渗透性等于或大于350的渗透系数，对二氧化碳的渗透性大于或等于2000的渗透系数，其中渗透系数的单位是[cm³][cm]/[cm²][s][cmhg]。示例性材料包括含聚硅氧烷的材料和聚甲基戊烯，所述含聚硅氧烷的材料例如聚(二甲基硅氧烷)(pdms)，其以高氧和二氧化碳渗透性(比诸如聚苯乙烯和pmma等材料高出三个数量级)而众所周知。在一个示例性实施方式中，细胞培养室包含聚苯乙烯底板和聚硅氧烷侧壁和顶壁。

在某些方面，除了第二材料之外，至少一个另外的表面124还可以包括第一材料。例如但非限制性的是，另外的表面124，例如一个或多个侧壁和/或顶壁，可以在由第一材料(例如聚苯乙烯)制成的框架内引入第二材料(例如，高渗透性聚合物，例如聚硅氧烷)，如图5所示。还设想底表面也可包括第二材料。然而，在一些实施方式中，第二材料仅间断地分散在整个底表面中，以确保第一材料覆盖足够的表面积，从而使得细胞可附着于表面上。

第一材料和第二材料可以使用本领域已知的任何方法(例如机械紧固、粘合剂和溶剂粘合，以及焊接)连接在一起。然而，考虑到使用本发明实施方式的系统和方法产生的细胞免疫治疗产品将施用于人类患者，监管问题可能妨碍在组装细胞培养室中使用某些或所有粘合剂。因此，在某些实施方式中，第一材料和第二材料在不使用粘合剂的情况下连接。在一个实施方式中，细胞培养室的所有表面，例如底部、侧壁和顶壁，包含第一材料(例如，聚苯乙烯)并使用超声波焊接连接在一起，在侧壁和/或顶壁中切出第一材料的至少一部分以允许插入第二材料(例如，聚硅氧烷材料)，如图5所示。应该理解，孔可以是任何所需的形状，而不仅仅是如图5所示的圆形。在示例性布置中，第二材料可以以与插入容器的顶部开口中以密封容器的塞子相同的方式单独地插入孔中。在另一实例中，第二材料可以被制造成完全涵盖并围绕第一材料框架的外表面，使得第二材料可通过框架内的孔得到接触(accessible)，如图5所示。应当理解，前述构造仅是实例，并且用于连接第一材料和第二材料的其他构造也是本发明的设想实施方式。

一个或多个细胞培养室的高度可以变化。例如但不限于，细胞培养室高度的示例性范围包括0.5mm至100mm的任何高度，例如0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0、85.0、90.0、95.0、100.0mm或更高，或其间的任何高度。在某些实施方式中，室的高度可以与通常在6孔板和24孔板中进行的培养中的液体高度相当，例如在2mm至6mm，体积容量为约0.8ml至6ml。在其他实施方式中，细胞培养室将具有大尺寸，例如10mm至50mm，培养表面为约50cm²。

如上面关于图3简要提及的那样，在某些实施方式中，生物反应器110会还包括一个或多个泵140，其可操作地连接到细胞培养室120，以用于将灌注介质灌注到细胞培养室中。生物反应器110还可以包括一个或多个流体贮存器132。流体贮存器132与细胞培养室110流体连通，并且可以可操作地连接到一个或多个泵140。还提供用于将流体贮存器连接到泵和细胞培养室的一个或多个管。在某些方面，一个或多个泵被配置用于将流体从流体贮存器泵送通过细胞培养室，并进入废物收集贮存器。在图3中所示的示例实施方式中，流体从流体贮存器132运动通过管道152到达泵140并经由入口136进入细胞培养室120，经由出口138从细胞培养室120返回离开，通过管道154，并进入废物收集贮存器134。

在某些实施方式中，流体贮存器和/或废物收集贮存器可以各自提供为一个或多个加盖的瓶，所述瓶包含在细胞培养室内或与所述室流体连接。每个贮存器包含入口和出口，或与一个或多个细胞培养室的入口流体连接的出口和通气口(vent)。在某些方面，例如，可以使用鲁尔连接器和切割成配合鲁尔连接器周围的聚硅氧烷衬垫来防止通过入口和/或出口的泄漏。

在某些实施方式中，一个或多个生物反应器的大小和构造适合放在培养箱内，使得该过程将在培养箱内进行。培养箱内的条件包括37℃的持续温度和95％-100％湿度。因此，所选材料必须具有完整性以承受这些条件，因为材料(包括流体和生物制剂)在这种条件下倾向于膨胀。此外，在某些情况下，培养箱内的条件保持稳定，并且温度的自动记录可以具有温度波动的知识，以与培养箱中进行的反应中的任何畸变相关联。因此，任何电力供应都不应改变培养箱内的环境。例如，某些泵产生热量。因此，在一个实施方式中，泵与生物反应器分开容纳，但仍与反应器进行流体连接和可操作的连通。在另一个实施方式中，泵直接连接到生物反应器并位于培养箱内，但是不具有热或可操作地连接到散热器和/或风扇以散热。无论构造如何，泵都可操作地连接到生物反应器，并进而连接到细胞培养室。关于基于灌注的自动化细胞培养系统的其他细节，例如具有板载试剂储存和由板载一次性蠕动泵实现灌注的用于内皮细胞培养的小规模培养系统，和使用具有聚苯乙烯底表面的室的用于由单核细胞产生树突状细胞的更大规模培养系统，可以见于国际专利申请号pct/us2016/040042和pct/us2016/60701，两者均通过引用整体并入本文。

该系统还可以包括用于控制细胞培养贮存器和可选的流体贮存器的温度的加热器。在这样的构造中，不需要培养箱，并且系统可以仅使用电源自动化操作。如果系统没有加热器，它可以在细胞培养的培养箱内部操作。

在其他方面，细胞培养室包括可操作地连接到细胞培养室的一个或多个传感器(未示出)。传感器可以能够测量细胞培养室内的一个或多个参数，例如ph值、溶解氧、总生物量、细胞直径、葡萄糖浓度、乳酸盐浓度和细胞代谢物浓度。在其中系统包括多个细胞培养室的实施方式中，一个或多个传感器可以连接到一个或多个细胞培养室。在某些实施方式中，一个或多个传感器连接到一个或多个细胞培养室，但不连接到系统中的所有室。在其他实施方式中，一个或多个传感器连接到系统中的所有细胞培养室。在具有可操作地连接到一个或多个传感器的多个室的系统中，传感器在它们所连接的每个室中可以是相同的，它们都可以是不同的，或者一些传感器可以是相同的而一些可以是不同的。在某些方面，一个或多个传感器可操作地连接到计算机系统(图3中未示出)，该计算机系统具有用于执行指令的中央处理单元，使得可以自动化监视和调整参数。下面提供关于使用细胞培养室实施本发明方法的计算机系统的其他细节。

还如图3所示，细胞培养室具有入口126和出口128，两者都可用于通过流体连接器将室与一个或多个另外的容器流体连接。在某些实施方式中，另外的容器包括一个或多个另外的细胞培养室，如下面将更详细描述的。本发明的系统可包括，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或其间任何数量或多于100个的细胞培养室，所述细胞培养室被配置成彼此串联流体连接以产生免疫治疗产品。作为选择或作为补充，一个或多个细胞培养室可以彼此平行布置，以允许一次为多于一个个体生产免疫治疗产品。在优选的实施方式中，生物反应器的细胞培养室通过无菌连接而连接。

多生物反应器系统的示例性构造以见于在图6b和以下提供了关于使用该构造执行的方法的另外细节。如图6b所示，在涉及第二生物反应器210的情况下，第二细胞培养室220移动到位以通过第一室的出口和第二室的入口与第一细胞培养物120室连接。该连接优选地是无菌连接。该连接允许将无菌空气注入第一细胞培养室120，以将含有经扩增t细胞的上清液转移至第二细胞培养室220中。可以采用流体流动领域中已知的替代技术将上清液从第一细胞培养室120转移至第二细胞培养室220。还如所显示的，每个生物反应器包括其自身的流体和废物收集贮存器、泵和相关联的管道。然而，应该理解，储存器和泵可以在生物反应器之间共享。

在某些实施方式中，细胞培养物入口与细胞培养物出口的比例为1：1，例如当一个或多个生物反应器彼此串联布置时，如图6b和c所示。在其他实施方式中，至少一部分生物反应器的出口与入口的比例是1：2。例如，一个细胞培养室120的出口可以流体连接到两个细胞培养室220a和220b的入口，使得流出第一细胞培养室120的流体被分成两个流，将一个流送入第二细胞培养室220a，并将第二流送入第三细胞培养室220b，如图7所示。在该构造中，第二细胞培养室220a和第三细胞培养室220b均可用于进一步刺激和扩增t细胞。作为补充或者作为选择，第二细胞培养室220a和第三细胞培养室220b中的一个可以被配置成允许使用可操作地连接到室的一个或多个传感器监测反应和流动参数。以这种方式，其中一个室保持没有另外的传感器，其中一些传感器可能需要穿透细胞培养室的壁，这可能增加泄漏和/或污染的风险。

在某些实施方式中，一个或多个生物反应器可以设置在包含模块的系统，以用于在生物反应器的细胞培养室内发生的过程之前、同时或之后实现各种其他过程。

系统及其部分或全部组件可以使用cad软件进行设计，然后转移至激光切割机，这允许将塑料切割成指定的尺寸和形状。各种连接(例如入口和出口)，可以通过激光切割通孔来制造，然后可以手动攻丝以提供用于接纳公鲁尔接头的螺纹。随后通过将鲁尔适配器(lueradapter)连接到钝的分配针上，将管推到钝针(bluntneedle)部分上，可以将流体引入系统。关于流体系统组件的构造的其他细节可以发现于在国际专利申请号pct/us2016/040042和pct/us2016/60701，二者的全部内容通过引用并入本文。

以上描述集中于系统组件和各种可能的构造。以下描述集中于使用本发明的示例性实施方式系统执行的过程。为了刺激和扩增抗原特异性t细胞，该过程开始于含有t细胞的细胞与从相同个体获得的apc在细胞培养室中的共培养。在具体实施方式中，含有t细胞的细胞包括外周血单个核细胞(pbmc)，并且apc包括dc。可以向细胞培养室提供含有t细胞的细胞和apc，比例(含有t细胞的细胞：apc)为约1000：1至1：1000，例如但不限于约1000:1、900:1、800:1、700:1、600:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、75:1、50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:50、1:75；1:100、1:200:1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000或其间的任何比例。在一个方面，优选10:1的比例。

为了从apc与含有t细胞的细胞的相互作用开始刺激和扩增t细胞，需要刺激apc。这可以通过使用一种或多种刺激分子来完成。在某些实施方式中，刺激分子是非肿瘤特异性的。在其他实施方式中，刺激分子是肿瘤特异性的。例如，刺激分子可以选自个体肿瘤的一种或多种特征，例如不同的抗原肽。在一些实施方式中，刺激分子优选仅在培养周期开始时加入。刺激分子可以在仅几分钟、一小时、几小时或更长的时间内添加。在一个优选的实施方式中，在约一小时的时间内添加刺激分子。

在培养两种细胞材料期间，形成含有较轻的非附着性t细胞的上清液，而较重的成熟apc(例如树突状细胞)附着于底表面。在其中dc用作apc的那些实施方式中，必须在七天结束时从细胞培养室中提取扩增的t细胞，因为原代dc在培养中不能维持超过七天。因此，如果需要另外扩增t细胞，则需要新供应树突状细胞。还应理解，使用一批树突状细胞培养细胞可以持续少于7天的任何时间。例如，细胞可以培养小于一分钟至七天的任何时间，培养的持续时间取决于所需的刺激程度。

在一个示例性实施方案中，在培养至多七天后，提取扩增的t细胞并转移至含有新鲜dc的新细胞培养室，所述dc用例如在第一细胞培养室中使用的相同抗原肽冲击刺激。刺激过程可以根据需要重复多次，以便为治疗剂量的t细胞产生足够大量的细胞。当使用与典型孔板相当的培养表面积时，刺激过程通常重复四次以产生足够的t细胞供应。

apc与t细胞的共培养在培养基中发生。示例性培养基包括但不限于rpmi培养基和培养基。可以根据本发明的实施方式使用本领域已知的任何其他合适的培养基。还可以向培养基添加诸如il-4和gm-csf等细胞因子。

在一个实施方式中，可以向细胞培养室内的细胞混合物提供培养基和细胞因子的灌注，以帮助形成基于细胞的免疫治疗产品。在用于通过dc刺激t细胞的基于板的方案中，从一开始就保持约2ml的培养体积，其中在每7天刺激周期内进行两次细胞因子输注。灌注的主要优点是能够维持培养基和细胞因子的一致性局部浓度分布，与现有技术的基于板的方案相比，这确保了更高的产率和加速单核细胞分化成dc的过程的潜在能力。然而，附着(dc)和非附着(t细胞)类型的组合，以及dc对机械力的高灵敏度，对抗原特异性t细胞的刺激和扩增提出了挑战，特别是对于通过细胞培养室的流体流动更是如此。因此，在通过灌注提供培养基和细胞因子的那些实施方式中，本发明的系统必须能够向细胞提供营养物和细胞因子而不从生物反应器中除去细胞，同时还考虑某些抗原呈递细胞(例如dc)的剪切敏感性。基本上，本发明的一些实施方式系统和方法旨在优化自分泌/旁分泌信号的保留，有利于t细胞增殖，同时更新生长因子并维持dc的最小物理刺激。为了考虑这一点，必须考虑通过细胞培养室的灌注流动的方向和速率。

在某些方面，流体流速保持低于抗原呈递细胞的沉降速率。因此，抗原呈递细胞由于其质量而将保留在培养室内。换句话说，抗原呈递细胞将向细胞培养室的底部沉降，因此保留在细胞培养室中。

可以根据等式1计算低于沉降速率的流速：

v_max＝〖(ψd_p)〗^2/150μg(ρ_细胞-ρ_液体)∈^3/(1-∈)

其中v_max是超过其则细胞将向上上升的液体速度，ψ是细胞的形状因子(细胞表面积与相等体积的球体表面积之比；注意细胞不是完美的球形，这个因素预期低于1)，d_p是体积等于细胞的球形颗粒的直径，μ是含有细胞的液体的粘度，g是重力常数，ρ_细胞是细胞的密度，ρ_液体是含有细胞的液体的密度，并且ε是未被细胞占据的感兴趣体积的分数。

在其他方面，细胞培养室的一个或多个入口136和一个或多个出口138布置成使液体(例如灌注流体)在细胞培养室内沿着垂直流动路径运动。该构造有助于防止细胞(例如，dc和t细胞)离开室，尤其是当通过室的流速为2-10l/min时更是如此。例如，平面流入/流出，如图8a和b所示，提供了高壁剪切均匀性的区域，但需要防止细胞被从室中除去的措施。相比之下，具有对称流入和垂直流出的配置，如图8c和d所示，可以防止细胞离开室。

尽管在图8c中显示为具有四个入口和一个垂直出口，但是可以提供任何数量的入口和出口，只要流出室的流体在垂直方向上流出室顶部即可。例如，室可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个灌注流体入口中的任何一种，同时还具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个灌注流体出口中的任何一种。另外，虽然入口在图8c中示出为对称的，但是也预期含有两个以上入口的构造是不对称布置的。入口还可以引导流体从任何方向进入室。在优选实施方式中，入口引导流体沿与底表面平行的方向进入室。

在某些方面，在任何一个细胞培养室中培养细胞的时间段内的特定时间点及时进行培养基灌注，例如每天或每周1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在其他方面，在培养期间连续灌注培养基。连续灌注有助于在整个过程中保持接近恒定的培养体积。

在某些方面，细胞因子在培养期间的一个或多个点输注，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。作为选择，细胞因子可以随培养基连续灌注。在那些实施方式中，连续灌注有助于维持细胞因子的一致性局部浓度分布，这有助于与静态细胞培养方法相比确保更高的产率并且具有增加t细胞被刺激和扩增的速度的能力。

灌注参数可在培养周期的任何时间变化。示例性参数包括但不限于中值流速、细胞因子浓度和培养周期的持续时间。这些参数中的每一个都可能对t刺激的功效产生影响。例如，在设计用于单核细胞扩散到dc的培养室的最近的工作中，如国际专利申请号pct/us2016/040042和pct/us2016/60701中所述，我们已经确定对应于0.1dyn/cm²的壁剪切应力水平的中等灌注速率能够产生与使用常规的基于6孔板或24孔板的方案产生的dc表型相同的dc。因此，通过在培养周期期间测量上述一种或多种表型和功能度量，可以监测一个或多个灌注参数对功效的影响，以允许适当的调整。

根据某些方面，可以在培养期间的任何时间点评估刺激功效，优选在7天后评估。表型和功能测量都可用于评估功效。例如，可以使用定向细胞计数方法计算细胞数(倍数扩增)。细胞表型(包括通过四聚体染色评估抗原特异性)可以通过流式细胞术来表征。功能测定也可用于评估扩增的t细胞识别携带抗原的靶细胞以及自体肿瘤细胞的能力。结果可以针对在24孔板中以g-格式进行的基于dc的t细胞刺激进行基准测试。

如上所述，因为某些apc(例如树突状细胞)，在超过7天的培养中不能存活，本发明的某些实施方式涉及在半批量构造中使用多于一个生物反应器进行的多个循环的t细胞刺激。每个周期利用新生成的自体抗原呈递细胞进行。在某些实施方式中，对于每个刺激周期，用相同的抗原组对抗原呈递细胞冲击刺激。在其他实施方式中，对于一个或多个刺激周期使用不同组的抗原。

通常，多循环t细胞刺激包括以产生包含第一细胞产物的上清液的方式在第一细胞培养室中培养细胞，提供第二细胞培养室，以及通过将气流引入第一细胞培养室而将上清液从第一细胞培养室随后转移至第二细胞培养室，如图2所示。

多反应器系统的示例性构造可以发现在图6a-6b。如所显示的，该过程开始于一个含有成熟的附着dc的反应器，所述dc将与pbmc一起加载并在灌注培养基和细胞因子的情况下进行7天的初始刺激循环。在第一个刺激循环结束后，将含有新鲜dc的第二个(可选较大)的反应器连接到第一反应器，如图6b和6c所示。然后无菌空气的注入会将上清液从第一反应器转移至第二反应器。该第二生物反应器将在其中包含其自身的培养基和细胞因子供应以及一次性蠕动泵。在上清液转移后，第一反应器可以脱开并丢弃。对于逐渐变大的生物反应器，该过程可以根据需要重复多次，以达到所需的刺激水平和t细胞增殖。例如，在一个实施方式中，进行四个刺激循环，其包括将上清液转移至三个不同时间的新细胞培养室。应当理解，虽然第二腔室220显示为大于第一细胞培养腔室110，但是第二细胞培养室和任何后续细胞培养室可以是任何尺寸，例如大于、尺寸等于或者小于第一细胞培养室。在某些实施方式中，每个后续细胞培养室的尺寸大于上清液从其转移的前一细胞培养室。

模块化设计在循环次数和抗原呈递细胞类型方面提供了灵活性，其可以使用对于每个循环相同组的抗原、对于每个循环不同组的抗原或者前者和后者的组合来制备。在某些方面，在一个自动化过程中产生对与疾病相关的多种不同抗原具有特异性的t细胞的能力在疾病的治疗中是有利的，因为它允许多方向攻击。

在某些方面，使用计算建模方法来优化t细胞与抗原呈递细胞(例如dc)的相互作用。根据本发明的计算模型考虑了灌注的影响和刺激所需的最佳时间，并且结合了基于颗粒相互作用以及基于动力学参数的方法。示例性的基于颗粒相互作用和基于动力学参数的方法是本领域已知的，其中一些在本文中描述。例如，关于基于颗粒相互作用的方法，day和lythe描述了使用以下方程得知t细胞发现在淋巴结表面上的apc所需的时间，其中d是t细胞的扩散性，并且b是位于半径为r的球形淋巴结中心的apc的半径。参见day等，mathematicalmodelsandimmunecellbiology；2011。

关于基于动力学参数的方法，valitutti已经开发了t细胞和抗原呈递细胞之间相互作用的模型，如图9所示。valitutti等，febslett.2010。然而，这种相互作用尚未在培养室或生物反应器的范围内建模。

通过将基于颗粒相互作用以及基于动力学参数的两种方法引入本发明的计算模型中，可以实现为了使两种细胞类型在细胞培养室内彼此接触的概率最大化而自动确定和监测灌注流体(例如，输注细胞因子的培养基)的最佳灌注速率。

例如，在某些实施方式中，提供了细胞培养系统，其包括细胞培养室和中央处理单元，所述中央处理单元包括含有由中央处理单元可执行的指令的存储器。在某些方面，所述指令使所述系统接收包含细胞培养室大小的数据作为第一输入，接收包含在将被引入细胞培养室的一个或多个流体中第一细胞类型的第一浓度和第二细胞类型的第二浓度的数据作为第二输入，并基于第一输入和第二输入计算将被引入细胞培养室的灌注流体的灌注速率，所述灌注速率使第一细胞类型和第二细胞类型在细胞培养室内彼此接触的概率最大化。下面提供关于用于在细胞培养系统内实施本发明方法的计算机系统的其他细节。

在一些方面，该系统还包括一个或多个泵，其可操作地连接到一个或多个灌注流体贮存器并可操作地连接到中央处理单元，从而使得中央处理单元还通过控制一个或多个泵来控制灌注流体的灌注速率。

如上所述，本发明的系统和方法利用彼此流体连接以用于处理个体的细胞材料的模块(例如，包含细胞培养室等的生物反应器)来产生免疫治疗产品。

本发明的系统或装置是模块化的并且能够与其他类似装置串联(即，流体从一个装置流入另一个装置)和/或并联地流体连接，并且还可以构造成彼此物理堆叠，或者能够在诸如培养箱等相关装置内物理布置。系统的模块化设计特别允许模块根据要包括在系统内的所需过程而灵活地接通和断开。

本发明的流体装置(包括包含细胞培养室的生物反应器)可以以微流体实施方式(即，其中一个或多个通道或室具有约1μm至约999μm的尺寸)和/或宏观流体实施方式(其中所有通道或室具有约1mm以上的尺寸)提供。

流体装置还可包括另外的流体通道或隔室、衬垫或密封件、混合区、阀、泵、通风口、用于加压气体的通道、电导体、试剂、端口和特定设计所需的管。它们还可以包含一个或多个控制模块、发射器、接收器、处理器、存储器芯片、电池、显示器、按钮、控制器、电动机、气动致动器、天线和电连接器等。所述装置优选仅含有对哺乳动物细胞无毒并且通过使用酒精和/或热或其他方式(例如暴露于γ辐射或环氧乙烷气体)而与灭菌相容的材料。

在每种方法特定的不同温度和压力等级下，选择具有适当化学相容性的设备材料。此外，根据不同功能的流动和压力要求，在设备中实施的泵的选择，如注射泵，蠕动泵，压力泵和旋转泵，流速范围从nl至ml，压力范围从10psi至10,000psi。

本发明的系统还可在模块的各入口包括一个或多个样品溶液贮存器或孔或用于将样品引入装置的其他设备，所述入口与入口通道流体连通。用于将一个或多个样品加载到本发明的流体装置上的贮存器和孔包括但不限于注射器、盒(cartridge)、小瓶(vials)、eppendorf管和细胞培养材料(例如，96孔板)。

在有用的情况下，可以例如通过暴露于等离子体而使装置的表面更亲水，或者可以包被一种或多种凝胶、化学官能化涂层、蛋白质、抗体、蛋白聚糖、糖胺聚糖、细胞因子或细胞。本发明的流体装置优选在操作条件下没有流体泄漏并且能够在数天至数周的时间内进行无菌操作。本发明的流体装置还包括采样机构，该采样机构允许从系统中去除流体以在不会向系统引入新材料或污染物的情况下进行测试。

在某些方面，细胞培养系统的至少一部分包括一次性部件，其中一些或全部可以容纳在非一次性框架内。在其他方面，系统的所有组件都是一次性的。此外，在一些实施方式中，细胞培养系统包括用于跟踪和记录患者材料的样品追踪组件。

使用各种在线过程分析工具(pat)或小型化微-全分析系统(micro-tas)监测制造过程中的至少一个步骤并且有时是多个或所有步骤的产品特性(例如，纯度和多晶型)。

如上所述，本发明的细胞培养系统能够控制系统内流体和实体的方向和流动。本发明的系统可以使用压力驱动流体控制(例如利用阀门和泵)，以在一个或多个方向上操纵细胞、试剂等的流动和/或操纵细胞、试剂等流动进入流体装置的一个或多个通道中。然而，也可以单独使用或与泵和阀组合使用其他方法，例如电渗流控制，电泳和介电电泳(fulwyer,science156,910(1974)；liandharrison,analyticalchemistry69,1564(1997)；fiedler等，analyticalchemistry70,1909-1915(1998)；美国专利号5,656,155)。

本发明的系统还可以包括一个或多个控制系统或可操作地连接到一个或多个控制系统，所述控制系统用于控制流体通过系统的运动的；监视和控制系统内的各种参数，如温度；以及检测基于细胞的免疫治疗产品的存在、产品的品质(直接或间接)，转换率等。该系统还可以配备多种类型的软件，例如允许反馈控制的高级实时过程监测和控制过程，以及允许使用该系统获得的反应和纯化结果的整合和规模化的过程。

在某些实施方式中，该系统包括微流体、毫流体或宏观流体模块和管道的组合，它们在通道尺寸，流动几何形状和装置的不同模块之间的互连方面是可互换的。每个模块和管道可以针对特定功能进行设计。在一个实施方式中，系统内的所有模块都针对细胞培养和t细胞刺激进行设计。在其他实施方式中，具有该系统的模块针对不同功能进行设计，例如组织加工、树突状细胞产生、细胞培养、浓缩和/或纯化，所有这些功能都集成以用于连续制造免疫治疗产品。考虑适用于流动应用的均相和非均相方法。这些过程针对起始材料和操作条件(例如温度，压力和流速)进行设计和优化，以在流动过程中不容易堵塞系统。

通过并行添加模块反应器或扩大模块通道来执行装置规模化的方法，同时保持一组无量纲参数，其特征在于每个过程常数和尺寸参数在上限和下限内。在过程集成和优化过程中，过程决策变量(包括温度，压力，流速和通道尺寸)会变化以实现产率、纯度和通量之间的期望权衡。在整个优化过程中，上述组无量纲参数经历了具有操作约束的代数优化。操作约束是决策变量的下限和上限。目标函数考虑纯度、产率和通量操作变量的组合。虽然无量纲参数决定了装置的稳态品质，但装置的启动品质也很有用，因为它确定了达到稳定状态所需的时间，反过来又以滞后的形式确定了设备的生产率和废物。使用模拟和实验分析启动动态，其结果用于通过实施实时反馈控制来执行启动优化。

如上所述的本公开内容的各方面，例如控制流体运动通过系统，以及各种参数的监测和控制，可以使用任何类型的计算装置(例如计算机或可编程逻辑控制器(plc)，其包括处理器，例如中央处理单元)或计算装置的任何组合(其中每个装置执行该过程或方法的至少一部分)来执行。在一些实施方式中，本文描述的系统和方法可以使用手持设备执行，例如智能平板电脑、智能电话或为系统生产的专用装置。

可以使用软件、硬件、固件、硬连线或这些中的任何组合来执行本公开内容的方法。实现功能的特征也可以物理地位于各种位置，包括被分布使得功能的各部分在不同的物理位置处实现(例如，一个房间中的成像设备和另一个房间中的主机工作站，或者在单独的建筑物中，例如，其利用无线的或有线连接)。

举例而言，适合于执行计算机程序的处理器包括通用微处理器和专用微处理器，以及任何类型的数字计算机的任何一种或多种处理器。通常，处理器将从只读存储器和/或随机存取存储器接收指令和数据。计算机的元件是用于执行指令的处理器和用于存储指令和数据的一个或多个存储器装置。通常，计算机还将包括或可操作地耦合以从一个或多个非暂时性大容量存储设备接收数据和/或将数据传输到一个或多个非暂时性大容量存储设备，以存储数据，例如磁盘、磁光盘或光盘。适用于体现计算机程序指令和数据的信息载体包括所有形式的非易失性存储器，包括例如半导体存储器件(例如，eprom、eeprom、固态驱动器(ssd)和闪存器件)；磁盘(例如，内部硬盘或可移动磁盘)；磁光盘；和光盘(例如，cd和dvd盘)。处理器和存储器可以补充以专用逻辑电路补充或并入专用逻辑电路中。

为了提供与用户的交互，本文描述的主题可以在具有i/o装置的计算机上实现，例如，用于向用户显示信息的crt、lcd、led或投影设备以及输入或输出装置。例如键盘和指示装置(例如，鼠标或轨迹球)，用户可以通过它们向计算机提供输入。其他类型的装置也可用于提供与用户的交互。例如，提供给用户的反馈可以是任何形式的感觉反馈(例如，视觉反馈、听觉反馈或触觉反馈)，并且可以以任何形式接收来自用户的输入，包括声学、语音或触觉输入。

本文描述的主题可以在包括后端组件(例如，数据服务器)、中间件组件(例如，应用服务器)或前端组件(例如，具有图形用户界面或网页浏览器的客户端计算机，用户可以通过其与本文描述的主题的实施进行交互)，或者这种后端、中间件和前端组件的任何组合。系统的组件可经由网络通过任何形式或介质的数字数据通信(例如，通信网络)互连。通信网络的实例包括蜂窝网络(例如，3g或4g)、局域网(lan)和广域网(wan)，例如因特网。

本文描述的主题可以实现为一个或多个计算机程序产品，例如有形地体现在信息载体中(例如，在非暂时性计算机可读介质中)的一个或多个计算机程序，以用于由数据处理设备(例如，可编程处理器、计算机或多个计算机)的操作执行或用于控制数据处理设备(例如，可编程处理器、计算机或多个计算机)的操作。计算机程序(也称为程序、软件、软件应用程序、应用程序、宏或代码)可以用任何形式的编程语言编写，包括编译或解释语言(例如，c、c++，perl)，并且其可以以以任何形式部署，包括作为独立程序或作为模块、组件、子例程或适用于计算环境的其他单元。本发明的系统和方法可以包括用本领域已知的任何合适的编程语言编写的指令，所述编程语言包括但不限于c、c++、perl、java、activex、html5、visualbasic或javascript。

计算机程序不一定对应于文件。程序可以存储在文件或保存其他程序或数据的文件的一部分中，存储在专用于所讨论的程序的单个文件中，或存储在多个协调文件(例如，存储一个或多个模块、子程序或代码的一部分的文件)中。可以部署计算机程序以在一个计算机上或在一个站点的多个计算机上执行，或者分布在多个站点上并通过通信网络互连。

文件可以是数字文件，例如，存储在硬盘驱动器、固态硬盘、cd或其他有形的非暂时性介质上的数字文件。文件可以通过网络从一个设备发送到另一个设备(例如，作为例如通过网络接口卡、调制解调器、无线卡等从服务器发送到客户端的数据包)。

根据本发明的实施方式编写文件涉及例如，通过添加、移除或重新排列颗粒(例如，其中，静电荷或偶极矩进入由读/写头进行的磁化模式)转换有形的、非暂时性计算机可读介质，然后这些模式表示关于用户期望并且对用户有用的客观物理现象的信息的新配置。在一些实施方式中，写入涉及有形的、非暂时性计算机可读介质中的材料的物理转换(例如，其中，某些光学性质使得光学读/写装置然后可以读取新的有用的信息配置，例如，刻录cd-rom)。在一些实施方式中，写入文件包括转换诸如nand闪存装置等物理闪存设备并通过变换由浮栅晶体管制成的存储单元阵列中的物理元件来存储信息。写入文件的方法在本领域中是公知的，并且例如，可以由程序或通过软件的保存命令或来自编程语言的写入命令手动或自动调用。

合适的计算装置通常包括大容量存储器、至少一个图形用户界面、至少一个显示装置，并且通常包括装置之间的通信。大容量存储器说明了一种计算机可读介质，即计算机存储介质。计算机存储介质可以包括以用于存储信息的任何方法或技术实现的易失性、非易失性、可移动和不可移动介质，例如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据。计算机存储介质的示例包括ram、rom、eeprom、闪存或其他存储器技术、cd-rom、数字通用光盘(dvd)或其他光学存储器、盒式磁带、磁带、磁盘存储器或其他磁存储装置、射频识别标签或芯片，或者可以用于存储所需信息并且可以由计算装置访问的任何其他介质。

在必须或最适合于执行本发明的方法时如本领域技术人员将认识到的，本发明的实施方式中采用的计算机系统或机器可包括一个或多个处理器(例如，中央处理单元(cpu)和/或图形处理单元(gpu))，主存储器和静态存储器，它们通过总线相互通信。

在图10中所示的示例性实施方式中，系统600可包括计算机649(例如，膝上型计算机、台式计算机或平板计算机)。计算机649可以被配置为通过网络609进行通信。计算机649包括一个或多个处理器659和存储器663以及输入/输出机构654。当本发明的方法采用客户端/服务器架构时，本发明方法的操作可以使用服务器613来执行，服务器613包括一个或多个处理器621和存储器629，其能够获得数据，指令等，或者通过接口模块625提供结果或者提供作为文件617的结果。服务器613可以是通过计算机649或终端667接入网络609，或者服务器613可以直接连接到终端667，包括一个或多个处理器675和存储器679，以及输入/输出机构671。

根据本发明的示例性实施方式的系统600或机器还可以包括用于i/o649、637或671中的任何一个的视频显示单元(例如，液晶显示器(lcd)或阴极射线管(crt))。根据一些实施方式的计算机系统或机器还可以包括字母数字输入装置(例如，键盘)、光标控制设备(例如，鼠标)、磁盘驱动单元、信号生成设备(例如，扬声器)、触摸屏、加速度计、麦克风、蜂窝射频天线和网络接口装置，其可以是例如网络接口卡(nic)、无线网络卡或蜂窝调制解调器。

根据本发明的示例实施例的存储器663、679或629可以包括机器可读介质，在该机器可读介质上存储有体现本文描述的任何一个或多个方法或功能的一组或多组指令(例如，软件)。在由计算机系统执行期间，软件还可以完全或至少部分地驻留在主存储器内和/或处理器内，主存储器和处理器也构成机器可读介质。还可以经由网络接口装置在网络上发送或接收软件。

参考文件的引入

在整个本公开内容中已经对其他文献(例如专利、专利申请、专利公布、期刊，书籍、论文、网页内容)进行了参考和引用。所有这些文献整体作为参考并入本文以用于所有目的。

等同方案

虽然已经结合某些实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员在阅读前述说明书之后，将能够对本文所提出的组合物和方法进行各种改变、等同替换和其他改变。