本发明涉及一种丝状菌变异株及使用其的c4二羧酸的制造方法。
背景技术：
：c4二羧酸作为酸味料或抗菌剂、ph调节剂在食品工业中被利用于各种各样的用途，此外，也用作合成树脂或生物分解性聚合物的原料使用等，为工业的价值高的物质。c4二羧酸通过工业上源自石化原料的化学合成、或微生物发酵的任一种来制造。从前，为了更低成本，化学合成法为主流，但近年来，从原料的昂贵、或环境负荷等的观点出发，通过以循环再生资源为原料的微生物发酵的制造方法备受关注。已知有作为c4二羧酸之一的富马酸可以使用根霉属菌(rhizopus)等发酵菌而制造。根霉属菌以葡萄糖为碳源生产富马酸，排出至菌体外。迄今为止，关于用于根霉属菌的富马酸高生产化的方法，已知有利用培养法的改良或变异育种的高生产率菌株的制作等。但是，根霉属菌的遗传学的背景还没有充分地研究，因此，利用基因重组的根霉属菌的富马酸高生产化技术的开发不容易，报道也少。仅报道有将编码源自酿酒酵母的丙酮酸羧化酶的基因导入至戴尔根霉(专利文献1)、及将编码源自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因导入至米根霉(非专利文献1)导致的富马酸生产率提高。专利文献1：中国专利申请公开第103013843号说明书非专利文献1：metabolicengineering,2012,14:512-520技术实现要素：本发明涉及以下的[1]～[4]。[1]一种c4二羧酸的制造方法，其中，包括：将丝状菌变异株进行培养，所述丝状菌变异株由序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有过氧化氢酶活性的多肽的表达被强化。[2]一种丝状菌变异株，其中，过氧化氢酶的表达被强化。[3]一种丝状菌变异株的制造方法，其中，包括：在宿主丝状菌中，将选自以下的1)～4)中的多核苷酸以可表达的方式导入、或强化该多核苷酸的表达，1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，2)由与序列号2具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸，3)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，4)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸。[4]一种c4二羧酸生产能力的提高方法，其中，包括：在宿主丝状菌中，将选自以下的1)～4)中的多核苷酸以可表达的方式导入、或强化该多核苷酸的表达，1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，2)由与序列号2具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸，3)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，4)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸。具体实施方式本发明涉及提供一种具有c4二羧酸生产能力提高效果的丝状菌变异株、及使用有该丝状菌变异株的c4二羧酸的制造方法。本发明人对使用有丝状菌的c4二羧酸的制造进行了深入研究的结果发现：增强了过氧化氢酶的表达的丝状菌株使其c4二羧酸生产能力提高。本发明的丝状菌变异株可以提高c4二羧酸的生产能力，更快地生产c4二羧酸。因此，本发明的丝状菌变异株是为了c4二羧酸的生物学的生产而有用的。本发明的上述及其它特征及优点由以下的本说明书的记载进一步明确。(1.定义)本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列的同一性利用lipman-pearson法(science,1985,227:1435-1441)来计算。具体而言，通过使用遗传信息处理软件genetycsver.12的同源性分析(searchhomology)程序、将unitsizetocompare(ktup)作为2进行分析来算出。本说明书中，与氨基酸序列或核苷酸序列有关的“至少90％的同一性”是指：90％以上、优选95％以上、更优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步更优选98％以上、另外优选99％以上的同一性。本说明书中的“1个或多个氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列”是指：1个以上10个以下、优选1个以上8个以下、更优选1个以上5个以下、进一步优选1个以上3个以下的氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。另外，本说明书中的“1个或多个核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列”是指：1个以上30个以下、优选1个以上24个以下、更优选1个以上15个以下、进一步更优选1个以上9个以下的核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。本说明书中，在氨基酸或核苷酸的“附加”中，包含对序列的一个末端及两个末端的氨基酸或核苷酸的附加。本说明书中，与基因有关的“上游”及“下游”是指该基因的转录方向的上游及下游。例如，“配置于启动子的下游的基因”意指在dna有义链中基因存在于启动子的3’侧，基因的上游意指dna有义链中的该基因的5’侧的区域。本说明书中，控制区域和基因的“可操作的连结”是指：基因和控制区域以该基因在该控制区域的控制下可表达的方式进行连结。基因和控制区域的“可操作的连结”的步骤是本领域技术人员所公知的。本说明书中，对于微生物的功能或性状、特性所使用的用语“本来”是为了表示该功能或性状、特性存在于该微生物的野生型而使用。对照而言，用语“外来”是原来不存在于该微生物、为了表示从外部所导入的功能或性状、特性而使用。例如，“外来”基因或多核苷酸是从外部导入至微生物的基因或多核苷酸。外来基因或多核苷酸可以源自与导入其的细胞同种的生物，也可以源自异种的生物(即，异种基因或多核苷酸)。。本说明书中，微生物的“c4二羧酸生产能力”是作为该微生物的培养培养基中的c4二羧酸的生产速度表示，更详细而言，将该微生物的培养开始后至经过一定时间时通过该细胞所生产的c4二羧酸的培养基每体积的质量用培养时间除所得的值(g/l/h)表示。微生物的c4二羧酸的生产量可以作为从该微生物的培养物中除去了微生物的培养上清液中的c4二羧酸的量算出。培养上清液中的c4二羧酸的量可以利用高效液相色谱法(hplc)等进行测定。更具体的测定步骤例示于后述的参考例1。本说明书中，丝状菌变异株中的“c4二羧酸生产能力的提高”是指：该变异株的c4二羧酸生产能力与宿主或对照相比提高。丝状菌变异株中的c4二羧酸生产能力的提高率用以下的式子计算。提高率(％)＝(变异株的c4二羧酸生产能力/宿主或对照的c4二羧酸生产能力)×100－100在此，变异株是指相对于宿主微生物加入了所给予的特性变化的改变的微生物，宿主是指成为该变异的导入对象的微生物(亲微生物株)。作为对照，可举出：与加入了与该变异株相同的改变的宿主不同种的微生物、或不加入该改变的宿主(例如导入有空载体或对照序列的宿主)。优选丝状菌变异株中的c4二羧酸生产能力的提高率基于该丝状菌变异株引起的c4二羧酸的生产速度成为最大的时点的、各丝状菌株的c4二羧酸生产能力进行计算。本说明书中，“c4二羧酸生产能力提高x％以上的变异株”是指用上述式计算的c4二羧酸生产能力的提高率为x％以上的变异株，另外，丝状菌中的“c4二羧酸生产能力的x％以上的提高”意指用上述式计算的该丝状菌的c4二羧酸生产能力的提高率为x％以上。作为由本发明制造的c4二羧酸的实例，可举出富马酸、苹果酸、及琥珀酸，优选为富马酸及苹果酸、更优选富马酸。本说明书中，“过氧化氢酶(catalase)”意指催化对过氧化氢(h2o2)的氧(o2)和水(h2o)的歧化反应的酶(ec1.11.1.6)。另外，“过氧化氢酶活性”是指过氧化氢酶显示的催化剂活性，例如可以通过实施例2所示的方法来测定。(2.丝状菌变异株及其制造方法)(2.1.丝状菌变异株)本发明的丝状菌变异株为过氧化氢酶的表达被强化的丝状菌株。即，在宿主丝状菌(亲丝状菌株)中以过氧化氢酶进行强表达的方式进行了基因构建的丝状菌变异体。在本发明中，作为过氧化氢酶，优选源自根霉(rhizopus)属菌的过氧化氢酶，进一步优选为源自戴尔根霉(rhizopusdelemar)jcm(japancollectionofmicroorganisms/理研)5557株的过氧化氢酶。该过氧化氢酶为由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽。因此，在优选的实施方式中，本发明的过氧化氢酶为由序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有过氧化氢酶活性的多肽。作为与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列的实例，可举出相对于序列号2所示的氨基酸序列，1个或多个氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。作为相对于氨基酸序列，导入氨基酸的缺失、取代、附加、或插入等变异的方法，可举出例如相对于编码该氨基酸序列的核苷酸序列，导入核苷酸的缺失、取代、附加、或插入等变异的方法。作为向核苷酸序列的变异导入的方法，可举出例如：甲磺酸乙酯、n-甲基-n-亚硝基胍、亚硝酸等化学诱变剂或紫外线、x射线、γ射线、离子束等物理诱变剂导致的突变诱发、部位特异性变异导入法、dieffenbach等(coldspringharbarlaboratorypress,newyork,581-621,1995)中记载的方法等。作为部位特异性变异导入的方法，可举出利用了splicingoverlapextension(soe)pcr(hortonetal.,gene77,61-68,1989)的方法、oda法(hashimoto-gotohetal.,gene,152,271-276,1995)、kunkel法(kunkel,t.a.,proc.natl.acad.sci.usa,1985,82,488)等。或者，也可以利用site-directedmutagenesissystemmutan-superexpresskm试剂盒(takarabio公司)、transformertmsite-directedmutagenesis试剂盒(clonetech公司)、kod-plus-mutagenesiskit(东洋纺公司)等市售的部位特异性变异导入用试剂盒。(2.2.丝状菌变异株的制造)本发明的丝状菌变异株是在宿主丝状菌(亲丝状菌株)中以过氧化氢酶强表达的方式进行了基因构建，具体而言，可以通过在宿主丝状菌(亲丝状菌株)中将编码过氧化氢酶的多核苷酸以可表达的方式导入、或强化该多核苷酸的表达来制造。作为上述宿主丝状菌，包含属于细区分真菌类(eumycota)及卵菌(oomycota)的全部的丝状形的菌(以根据hawksworthetal.,in,ainsworthandbisby'sdictionaryofthefungi,8thedition,1995,cabinternational,university,press,cambridge,uk进行定义的方式)。丝状菌一般而言利用由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖及其它复合多糖构成的菌丝体壁来赋予特征。营养生长是利用菌丝扩张，而且碳代谢为绝对有氧。在本发明中，作为宿主丝状菌的优选的实例，可举出：枝顶孢(acremonium)属、曲霉(aspergillus)属、短梗霉(aureobasidium)属、烟管霉(bjerkandera)属、拟蜡菌(ceriporiopsis)属、金孢子菌(chrysosporium)属、鬼伞(coprinus)属、云芝(coriolus)属、隐球菌(cryptococcus)属、线黑粉酵母(filibasidium)属、镰刀菌(fusarium)属、腐质霉(humicola)属、梨孢菌(magnaporthe)属、毛霉(mucor)属、毁丝霉(myceliophthora)属、新美鞭菌(neocallimastix)属、脉孢菌(neurospora)属、拟青霉(paecilomyces)属、寄生霉(parasitella)属、青霉菌(penicillium)属、平革菌(phanerochaete)属、脉射菌(phlebia)属、瘤胃壶菌(piromyces)属、侧耳(pleurotus)属、根霉(rhizopus)属、裂褶菌(schizophyllum)属、踝节菌(talaromyces)属、嗜热子囊菌(thermoascus)属、梭孢壳霉(thielavia)属、弯颈霉(tolypocladium)属、栓菌(trametes)属、及木霉(trichoderma)属的丝状菌。其中，从c4二羧酸的生产率的观点出发，优选戴尔根霉(rhizopusdelemar)、少根根霉(rhizopusarrhizus)、华根霉(rhizopuschinensis)、黑根霉(rhizopusnigricans)、东京根霉(rhizopustonkinensis)、小麦曲根霉(rhizopustritici)、米根霉(rhizopusoryzae)等rhizopus属菌，更优选戴尔根霉(rhizopusdelemar)及米根霉(rhizopusoryzae)，进一步优选戴尔根霉(rhizopusdelemar)。在本发明中，作为编码过氧化氢酶的多核苷酸，可举出以下。1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，2)由与序列号2具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸，3)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，4)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸。作为与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列的实例，可举出相对于序列号1所示的核苷酸序列，1个或多个核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。在此，在核苷酸序列中导入核苷酸的缺失、取代、附加、或插入等变异的方法如上所述。本发明的多核苷酸可以为1条链或2条链的形态，或可以为dna，也可以为rna。该dna可以为cdna、化学合成dna等人工dna。作为将本发明的上述多核苷酸以可表达的方式导入的手段，可举出例如将含有上述的多核苷酸的载体或dna片段导入至宿主丝状菌。在此，含有本发明的多核苷酸的载体为表达载体，优选为可以将该多核苷酸导入至宿主丝状菌、且可以在宿主内表达该多核苷酸的表达载体。另外，该载体优选包含本发明的多核苷酸、及与其可操作地连结的控制区域。该载体可以为能够在质粒等染色体外独立增殖及复制的载体，或也可以为重组至染色体内的载体。作为具体的载体的实例，可举出例如：pbluescriptiisk(-)(stratagene)、puc18/19、puc118/119等puc系载体(takarabio)、pet系载体(takarabio)、pgex系载体(gehealthcare)、pcold系载体(takarabio)、phy300plk(takarabio)、pub110(mckenzie,t.etal.,1986,plasmid15(2):93-103)、pbr322(takarabio)、prs403(stratagene)、pmw218/219(nippongene)、pri909/910等pri系载体(takarabio)、pbi系载体(clontech)、in3系载体(inplantainnovations)、pptr1/2(takarabio)、pdjb2(d.j.balanceetal.,gene,36,321-331,1985)、pab4-1(vanhartingsveldtwetal.,molgengenet,206,71-75,1987)、pleu4(m.i.g.ronceroetal.,gene,84,335-343,1989)、ppyr225(c.d.skoryetal.,molgenetgenomics,268,397-406,2002)、pfg1(gruber,f.etal.,currgenet,18,447-451,1990)等。作为含有本发明的多核苷酸的dna片段的实例，可举出例如pcr扩增dna片段及限制性内切酶切断dna片段。优选该dna片段可以为含有本发明的多核苷酸、及与其可操作地连结的控制区域的表达盒。上述载体或dna片段中所含的控制区域为在导入有该载体或dna片段的宿主内用于表达本发明的多核苷酸的序列，可举出例如启动子或终止子等的表达调节区域、复制起始点等。该控制区域的种类可以根据导入载体或dna片段的宿主细胞的种类适当选择。根据需要该载体或dna片段可以进一步具有抗生素抗性基因、氨基酸合成相关基因等选择标记。优选上述载体或dna片段中所含的控制区域与在宿主基因组中编码过氧化氢酶的多核苷酸的控制区域相比，为具有更高的转录活性的控制区域(所谓的强控制区域)。作为关于根霉属菌的该强控制区域的实例，并不限定于这些，可举出：ldha启动子(美国专利第6268189号)、pgk1启动子(国际公开第2001/73083号)、pgk2启动子(国际公开第2001/72967号)、pdca启动子及amya启动子(archivesofmicrobiology,2006,186:41-50)、tef及18srrna启动子(美国专利申请公开第2010/112651号)、adh1启动子(日本特愿2015-155759)等。作为强控制区域的其它实例，并不限定于这些，可举出rrna操纵子的控制区域、编码核糖体蛋白质的基因的控制区域等。上述载体或dna片段中所含的目标多核苷酸及控制区域可以导入至宿主的核，也可以导入至宿主基因组。或者，也可以将上述载体或dna片段中所含的目标多核苷酸直接导入至宿主基因组，与该基因组上的高表达启动子可操作地连结。作为将多核苷酸导入至基因组的手段，可举出重组法。在对上述宿主细胞的载体或dna片段的导入中，可以使用一般的转化法，例如电穿孔法、转化法、转染法、接合法、原生质体法、颗粒枪法、农杆菌注射法等。导入有目标载体或dna片段的丝状菌变异株可以利用选择标记而选择。例如，选择标记为抗生素抗性基因时，通过在该抗生素添加培养基中培养细胞，可以选择导入有目标载体或dna片段的转化细胞。另外，例如选择标记为氨基酸合成相关基因时，在该氨基酸要求性的丝状菌株中导入基因之后，可以将该氨基酸要求性的有无作为指标，选择导入有目标载体或dna片段的丝状菌株。或者，通过利用pcr等研究变异株的dna序列，也可以确认目标载体或dna片段的导入。作为强化本发明的上述多核苷酸的表达的手段，可举出使宿主内的该多核苷酸的转录量提高的手段，可举出例如相对于宿主基因组上的目标多核苷酸的控制区域，取代或插入上述的强控制区域，使该强控制区域与目标多核苷酸可操作地连结。作为基因组区域的取代或插入的手段，可举出将含有强控制区域和选择标记的多核苷酸序列的dna片段导入至宿主，选择通过同源重组或非同源重组等进行转化的株的方法等。以上的步骤中得到的本发明的丝状菌变异株与其宿主丝状菌(亲丝状菌株)相比，细胞内过氧化氢酶活性提高。优选是该过氧化氢酶活性相对于宿主为1.2倍以上、进一步1.5倍以上、进一步2倍以上、进一步3倍以上、进一步4倍以上。(2.3.c4二羧酸生产能力的提高)就上述本发明的丝状菌变异株而言，c4二羧酸生产能力提高。例如含有包含多核苷酸的载体或dna片段的变异株与其宿主丝状菌(亲丝状菌株)相比，c4二羧酸生产能力提高优选10％以上、更优选20％以上、进一步优选30％以上。(3.c4二羧酸的制造)就本发明的丝状菌变异株而言，c4二羧酸生产能力提高。因此，本发明还提供一种c4二羧酸的制造方法，其包括将上述本发明的丝状菌变异株进行培养。作为通过该本发明的制造方法制造的c4二羧酸，可举出富马酸、苹果酸、及琥珀酸，优选为富马酸及苹果酸，更优选为富马酸。用于培养丝状菌变异株的培养基及培养条件可以根据该变丝状菌变异株的宿主的种类而适当选择。一般而言，相对于该丝状菌变异株的宿主，可以采用通常所使用的培养基及培养条件。例如，培养温度为10℃～50℃、优选25℃～45℃即可。培养期间只要是充分地产生目标c4二羧酸的期间，就没有特别限定，例如可以为1～240小时、优选12～120小时、优选24～72小时。优选在搅拌或通气下进行培养。作为用于丝状菌培养的培养基，只要使用通常所使用的培养基即可。优选该培养基为液体培养基，另外也可以为合成培养基、天然培养基、及在合成培养基中添加有天然成分的半合成培养基的任一种。也可以使用市售的pdb培养基(马铃薯葡萄糖培养基；becton,dickinsonandcompany制等)、pda培养基(becton,dickinsonandcompany制等)、lb培养基(luria-bertani培养基；日本制药社制(商标名“daigo”)等)、nb培养基(nutrientbroth；becton,dickinsonandcompany制等)、sb培养基(sabouraud培养基；oxoid社制等)、sd培养基(syntheticdropoutbroth；例如clontech)等。通常在该培养基中含有碳源、氮源、无机盐等，但各成分组成可以适当选择。以下，对用于丝状菌培养的优选的培养基组成进行详述。以下所记载的培养基中的各成分的浓度表示初始(培养基制备时或培养开始时)的浓度。作为上述培养基中的碳源的实例，可举出葡萄糖、麦芽糖、淀粉水解物、果糖、木糖、蔗糖等，其中，优选葡萄糖及果糖。这些糖类可以单独使用或2种以上组合而使用。该培养基中的碳源的浓度优选为1％(w/v)以上、更优选为5％(w/v)以上、进一步更优选为7.5％(w/v)以上，且优选为40％(w/v)以下、更优选为30％(w/v)以下。或者，上述培养基中的碳源的浓度优选为1～40％(w/v)、更优选为5～30％(w/v)、进一步更优选为7.5～30％(w/v)。作为上述培养基中的氮源的实例，可举出：硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等含氮化合物。该培养基中的氮源的浓度优选为0.001～0.5％(w/v)，更优选为0.001～0.2％(w/v)。在上述培养基中可以含有硫酸盐、镁盐、锌盐等。作为硫酸盐的实例，可举出硫酸镁、硫酸锌、硫酸钾、硫酸钠、硫酸铵等。作为镁盐的实例，可举出硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等。作为锌盐的实例，可举出硫酸锌、硝酸锌、氯化锌等。该培养基中的硫酸盐的浓度优选为0.001～0.5％(w/v)，更优选为0.001～0.2％(w/v)。该培养基中的镁盐的浓度优选为0.001～0.5％(w/v)，更优选为0.01～0.1％(w/v)。该培养基中的锌盐的浓度优选为0.001～0.05％(w/v)，更优选为0.005～0.05％(w/v)。上述培养基的ph(25℃)优选为3～7，更优选为3.5～6。培养基的ph可以使用氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钙、氨等碱、或硫酸、盐酸等酸而进行调节。作为上述培养基的优选的实例，可举出含有7.5～30％碳源、0.001～0.2％硫酸铵、0.01～0.6％磷酸二氢钾、0.01～0.1％硫酸镁·七水合物、0.005～0.05％硫酸锌·七水合物、及3.75～20％碳酸钙(浓度均为％(w/v))的液体培养基。为了使用丝状菌而更有效地生产c4二羧酸，可以在以下所示的工序中进行生产。即，利用以下工序，可以有效地制造c4二羧酸，所述工序为：制备丝状菌的孢子悬浮液(工序a)；将其在培养液中进行培养而使孢子发芽而制备菌丝体(工序b1)；优选进一步使该菌丝体增殖(工序b2)；接着将制备的菌丝体进行培养而生产c4二羧酸(工序c)。但是，本发明中的变异丝状菌的培养工序并不限定于以下的工序。＜工序a：孢子悬浮液的制备＞将变异丝状菌的孢子接种于例如无机琼脂培养基(组成例：2％葡萄糖、0.1％硫酸铵、0.06％磷酸二氢钾、0.025％硫酸镁·七水合物、0.009％硫酸锌·七水合物、1.5％琼脂、浓度均为％(w/v))、pda培养基等培养基，通过在10～40℃、优选27～30℃下进行7～10天静置培养而形成孢子，接着悬浮于生理食盐水等，由此可以制备孢子悬浮液。可以在孢子悬浮液中含有菌丝体，也可以不含有。＜工序b1：菌丝体的制备＞将工序a中得到的孢子悬浮液接种于培养液而进行培养，使孢子发芽而得到菌丝体。接种于培养液的丝状菌的孢子数为1×102～1×108个-孢子/ml-培养液，优选为1×102～5×104个-孢子/ml-培养液，更优选为5×102～1×104个-孢子/ml-培养液、进一步优选1×103～1×104个-孢子/ml-培养液。在培养液中，可以利用市售的培养基、例如pdb培养基、lb培养基、nb培养基、sb培养基、sd培养基等。从发芽率和菌体生长的观点出发，可以在该培养液中适当添加作为碳源的葡萄糖、木糖等单糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等低聚糖、或淀粉等多糖；甘油、柠檬酸等生物体成分；作为氮源的硫酸铵、尿素、氨基酸等；作为其它无机物的钠、钾、镁、锌、铁、磷酸等各种盐类。单糖、低聚糖、多糖及甘油的优选的浓度为0.1～30％(w/v)，柠檬酸的优选的浓度为0.01～10％(w/v)，硫酸铵、尿素及氨基酸的优选的浓度为0.01～1％(w/v)，无机物的优选的浓度为0.0001～0.5％(w/v)。在上述培养液中接种孢子悬浮液，一边以优选80～250rpm、更优选100～170rpm进行搅拌，一边在25～42.5℃的培养温度控制下培养优选24～120小时、更优选48～72小时。供于培养的培养液的量只要与培养容器相符而适当调节即可，例如，200ml容积带挡板的烧瓶的情况下，50～100ml左右、500ml容积带挡板的烧瓶的情况下，为100～300ml左右即可。通过该培养，接种的孢子进行发芽，成长为菌丝体。＜工序b2：菌丝体的增殖＞从c4二羧酸生产能力提高的观点出发，优选进行将工序b1中得到的菌丝体进一步进行培养而使其增殖的工序(工序b2)。工序b2中使用的增殖用的培养液没有特别限定，只要是含有通常所使用的葡萄糖的无机培养液即可，可举出例如含有7.5～30％葡萄糖、0.001～0.2％硫酸铵、0.01～0.6％磷酸二氢钾、0.01～0.1％硫酸镁·七水合物、0.005～0.05％硫酸锌·七水合物、及3.75～20％碳酸钙(浓度均为％(w/v))的培养液等。该培养液的量只要与培养容器相符而适当调节即可，例如，500ml容积三角烧瓶的情况下，为50～300ml、优选100～200ml即可。在该培养液中将工序b1中培养的菌体作为湿重量以成为1～30g-菌体/100ml-培养液、优选3～25g-菌体/100ml-培养液的方式接种，一边以100～300rpm、优选170～230rpm进行搅拌，一边在25～42.5℃的培养温度控制下培养12～120小时、优选24～72小时。＜工序c：c4二羧酸生产＞将上述的步骤(工序b1或b2)中得到的丝状菌的菌丝体进行培养，在该菌中生产c4二羧酸。该培养的条件按照上述的通常的丝状菌的培养条件即可。就培养基的量而言，200ml容积三角烧瓶的情况下，可设为20～80ml左右，500ml容积三角烧瓶的情况下，可以设为50～200ml左右，30l发酵缸(jarfermenter)的情况下，可以设为10l～15l左右，只要与培养容器相符适当调节即可。相对于培养基的工序b1或b2中得到的菌体的接种量优选作为湿重量，可以为5g～90g-菌体/100ml-培养基、更优选5g～50g-菌体/100ml-培养基。优选一边以100～300rpm、优选150～230rpm进行搅拌、一边在25～45℃的温度下进行2小时～240小时、优选12小时～120小时培养。使用发酵缸的情况下，以优选0.05～2vvm、更优选0.1～1.5vvm进行通气。通过以上的步骤将本发明的丝状菌变异株进行培养，生产c4二羧酸。培养后，从培养物中回收c4二羧酸。根据需要，可以将回收的c4二羧酸进一步精制。从培养物中回收或精制c4二羧酸的方法没有特别限定，按照公知的回收或精制方法进行即可。例如，利用倾斜法、过滤、离心分离等从培养物中除去细胞等，将残留的培养物根据需要进行浓缩之后，通过晶析法、离子交换法、溶剂提取法等方法、或这些方法的组合，可以将该培养物中的c4二羧酸进行回收或精制。从培养物中分离的本发明的丝状菌变异株可以在c4二羧酸生产中再利用。例如，可以在从培养物中分离的本发明的丝状菌变异株中重新加入上述的培养基，再在上述条件下进行培养而生产c4二羧酸，接着从培养基中回收所生产的c4二羧酸。可以进一步重复该过程。在本发明的制造方法中，丝状菌变异株的培养及c4二羧酸的回收可以通过间歇式、半间歇式及连续式的任一种的方法进行。(4.例示的实施方式)作为本发明的例示的实施方式，将以下的物质、制造方法、用途、方法等进一步公开于本说明书。但是，本发明并不限定于这些实施方式。＜1＞一种c4二羧酸的制造方法，其中，包括：将由序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有过氧化氢酶活性的多肽的表达被强化的丝状菌变异株进行培养。＜2＞根据＜1＞所述的制造方法，其中，还包括：从所述培养物中回收c4二羧酸。＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的制造方法，其中，所述c4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸。＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的制造方法，其中，丝状菌变异株是在宿主丝状菌中，将选自以下的1)～4)中的多核苷酸以可表达的方式导入、或强化该多核苷酸的表达而成的丝状菌变异株。1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，2)由与序列号2具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸，3)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，4)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸。＜5＞根据＜4＞所述的制造方法，其中，宿主丝状菌为根霉属菌。＜6＞一种丝状菌变异株，其中，过氧化氢酶的表达被强化。＜7＞根据＜6＞所述的丝状菌变异株，其中，过氧化氢酶为源自根霉属菌的过氧化氢酶。＜8＞根据＜6＞所述的丝状菌变异株，其中，过氧化氢酶为由序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有过氧化氢酶活性的多肽。＜9＞根据＜8＞所述的丝状菌变异株，其中，是在宿主丝状菌中将选自以下的1)～4)中的多核苷酸以可表达的方式导入、或强化该多核苷酸的表达而成的，1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，2)由与序列号2具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸，3)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，4)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸。＜10＞根据＜6＞～＜9＞中任一项所述的丝状菌变异株，其中，所述丝状菌为根霉属菌。＜11＞根据＜9＞或＜10＞所述的丝状菌变异株，其中，宿主丝状菌中的多核苷酸的可表达的导入是通过将含有该多核苷酸的载体或dna片段导入至宿主丝状菌而进行的。＜12＞根据＜11＞所述的丝状菌变异株，其中，上述载体或dna片段还含有与上述多核苷酸可操作地连结的控制区域。＜13＞根据＜11＞或＜12＞所述的丝状菌变异株，其中，上述载体或dna片段被导入至核内或基因组。＜14＞根据＜11＞所述的丝状菌变异株，其中，宿主丝状菌中的多核苷酸的表达强化是通过将宿主基因组上的该多核苷酸的控制区域与强控制区域进行取代或插入而进行。＜15＞根据＜6＞～＜14＞中任一项所述的变异丝状菌，其中，上述丝状菌为根霉(rhizopus)属菌。＜16＞根据＜15＞所述的变异丝状菌，其中，上述根霉(rhizopus)属优选为戴尔根霉(rhizopusdelemar)或米根霉(rhizopusoryzae)，更优选为戴尔根霉(rhizopusdelemar)。＜17＞一种丝状菌变异株的制造方法，其中，包括：在宿主丝状菌中，将选自以下的1)～4)中的多核苷酸以可表达的方式导入，或强化该多核苷酸的表达，1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，2)由与序列号2具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸，3)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，4)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸。＜18＞一种c4二羧酸生产能力的提高方法，其中，包括：在宿主丝状菌中，强化过氧化氢酶的表达。＜19＞根据＜18＞所述的方法，其中，过氧化氢酶为源自根霉属菌的过氧化氢酶。＜20＞根据＜18＞所述的方法，其中，过氧化氢酶为由序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有过氧化氢酶活性的多肽。＜21＞根据＜18＞～＜20＞中任一项所述的方法，其中，包括：强化过氧化氢酶的表达是在宿主丝状菌中，将选自以下的1)～4)中的多核苷酸以可表达的方式导入、或强化该多核苷酸的表达，1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，2)由与序列号2具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸，3)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，4)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸。实施例以下，基于实施例，进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。实施例1变异丝状菌的制作将本实施例中使用的pcr引物示于表1。[表1](1)基因组提取在pda培养基中植菌戴尔根霉(rhizopusdelemar)jcm(japancollectionofmicroorganisms/理研)5557株(以下，记为5557株)的孢子之后，在30℃下进行5天培养。培养后，将菌体与3ml用金属锥(metalcone)(安井器械)一起放入于3ml破碎管，立即在液氮中使其冻结10分钟以上。其后，使用多珠振荡器(安井器械)，以1700rpm进行10秒菌体的破碎。在破碎后的容器中加入te缓冲液(tebuffer)(ph8.0)(nippongene)400μl并颠倒混合，将250μl移至1.5ml管。从该菌体溶液，使用“gentle(酵母用)”(takarabio)，按照操作说明进行基因组提取。相对于得到的基因组溶液50μl，添加rnasea(roche)1μl，在37℃下反应1小时。反应后，加入等量的苯酚/氯仿，通过轻敲进行混合之后，在4℃下以14500rpm离心5分钟，将上清液移至新的1.5ml管。再次重复苯酚/氯仿处理，接着进行乙醇沉淀，得到5557株的精制基因组溶液。(2)cdna的制作(i)总rna提取将5557株的菌体6g-湿重量植菌于液体培养基40ml(0.1g/l(nh4)2so4、0.6g/lkh2po4、0.25g/lmgso4·7h2o、0.09g/lznso4·7h2o、50g/l碳酸钙、100g/l葡萄糖)，在35℃下以170rpm培养8小时。从培养液中将菌体进行过滤、回收，用0.85％生理食盐水100ml进行2次清洗。清洗后，通过抽滤除去多余的水分之后，量取0.3g，与3ml用金属锥(安井器械)一起放入于3ml破碎管，立即投入于液氮并进行冻结。将得到的冻结菌体使用多珠振荡器(安井器械)以1700rpm破碎10秒。在破碎后的菌体中添加rlt缓冲液(rltbuffer)500μl，颠倒混合后，将450μl供至rneasyplantminikit(qiagen)，进行总rna提取。在得到的rna溶液40μl中添加1μl的dnasei(takara)及5μl的10×dnasei缓冲液(dnaseibuffer)(usbcorporation)，用无rna酶水(rnasefreewater)补充到50μl之后，在37℃下使其反应30分钟以上而除去溶液中的残存dna。进一步追加1μldnasei，在37℃下反应30分钟之后，进行苯酚/氯仿提取，接着进行乙醇沉淀。将沉淀溶解于50μl的灭菌水，使用qubit(lifetechnologies)测定rna溶液的浓度及纯度。另外，适当稀释该rna溶液，进行使用agilent2100bioanalyzer(agilent)及rna6000picokit(agilent)而提取的rna的检测。确认作为rna的分解度指标的“rna完整性数(rnaintegritynumber)(rin值)”为6.0以上，将得到的rna溶液作为总rna取得。(ii)cdna合成cdna合成使用superscriptiiifirst-strandsynthesissupermixforqrt-pcr(invitrogen)而进行。即，将(i)中得到的rna溶液1μg用depc水补充到8μl之后，添加10μl的2×rtreactionmix和2μl的rtenzymemix，平稳地混合，在25℃下反应10分钟，在50℃下反应30分钟，在85℃下反应5分钟。在反应后的溶液中加入1μl的rnaseh，在37℃下反应20分钟，将其设为cdna溶液。(3)质粒载体的制作(i)向puc18的trpc基因区域的导入以上述(1)中得到的5557株的基因组dna为模板，通过使用有引物ojk162(序列号8)及ojk163(序列号9)的pcr来合成含有trpc基因(序列号3)的dna片段。接着，以质粒puc18为模板，通过使用有引物ojk164(序列号10)及ojk165(序列号11)的pcr将dna片段进行扩增。将以上的2片段使用in-fusionhdcloningkit(clontech)进行连结，构建质粒puc18-trpc。(ii)启动子及终止子的克隆以上述(1)中得到的5557株的基因组dna为模板，将含有adh1启动子序列(序列号4)的dna片段和含有adh1终止子序列(序列号5)的dna片段分别通过使用有引物ojk202(序列号12)及ojk204(序列号13)、以及ojk205(序列号14)及ojk216(序列号15)的pcr进行扩增，将含有cipc启动子序列(序列号6)的dna片段和含有cipc终止子序列(序列号7)的dna片段分别通过使用有引物nk-411(序列号16)及nk-412(序列号17)、以及nk-413(序列号18)及nk-414(序列号19)的pcr进行扩增。接着，以(i)中得到的质粒puc18-trpc为模板，通过使用有引物ojk210(序列号20)及ojk211(序列号21)的pcr将dna片段进行扩增。将以上的片段以与(i)同样的步骤连结而构建质粒puc18-trpc-padh-tadh及puc18-trpc-pcipc-tcipc。在得到的质粒中，在trpc基因区域的下游依次配置有adh1启动子及adh1终止子或cipc启动子及cipc终止子。(iii)基因导入用质粒的制作将含有序列号1所示的基因(以下，称为rdcat1)的dna片段从(2)中得到的cdna溶液通过使用有引物nk-052(序列号22)及nk-064(序列号23)的pcr进行扩增。接着，以(ii)中得到的质粒puc18-trpc-padh-tadh为模板，通过使用有引物nk-011(序列号24)及nk-012(序列号25)的pcr将dna片段进行扩增。将上述2片段以与(i)同样的步骤连结而构建质粒puc18-trpc-padh-rdcat1-tadh。将其作为模板，通过使用有引物nk-274(序列号26)及nk-278(序列号27)的pcr将含有rdcat1的dna片段进行扩增，以(ii)中得到的质粒puc18-trpc-pcipc-tcipc为模板，通过使用有引物nk-269(序列号28)及nk-270(序列号29)的pcr将dna片段进行扩增。将上述2片段以与(i)同样的步骤连结而构建质粒puc18-trpc-pcipc-rdcat1-tcipc。在得到的质粒中、在cipc启动子和cipc终止子之间插入序列号1所示的rdcat1基因。(4)向宿主细胞的基因导入(i)色氨酸营养缺陷型株的制作用作基因导入的宿主细胞的色氨酸营养缺陷型株是从向5557株的离子束照射形成的变异导入株中选拔而取得。离子束照射在独立行政法人日本原子力研究开发机构·高崎量子应用研究所的离子照射设施(tiara)中进行。就照射而言，使用avf回旋加速器将12c5+进行加速，以220mev的能量进行100～1250gray照射。从照射过的菌体中回收孢子，从其中取得显示色氨酸营养缺陷型的戴尔根霉(rhizopusdelemar)02t6株(以下，记为02t6株)。02t6株的trpc基因编码区域(序列号3)全长2298bp中的第2093号缺损一个碱基。(ii)质粒载体的扩增使用上述(3)中制作的质粒载体puc18-trpc-padh-tadh及puc18-trpc-pcipc-rdcat1-tcipc，将大肠杆菌dh5α株(nippongene)通过感受态细胞转化法进行转化。将得到的转化细胞在37℃下静置一夜，将得到的菌落接种于lbamp液体培养基(bactotrypton1％、酵母提取物(yeastextract)0.5％、nacl1％，氨苄西林钠50μg/ml)2ml，在37℃下培养一夜。从该培养液使用高纯度质粒分离试剂盒(rochelifescience)进行各质粒载体的精制。(iii)质粒载体向宿主细胞的导入将(ii)中得到的质粒载体puc18-trpc-padh-tadh及puc18-trpc-pcipc-rdcat1-tcipc的各dna溶液(1μg/μl)10μl加入于金颗粒溶液(60mg/ml)100μl并混合之后，加入0.1m亚精胺40μl，以涡旋振荡器(vortex)充分搅拌。进一步加入2.5mcacl2100μl，以涡旋振荡器搅拌1分钟，接着以6000rpm离心30秒，除去上清液。在得到的沉淀中加入70％etoh200μl，以涡旋振荡器搅拌30秒后，以6000rpm离心30秒，除去上清液。将得到的沉淀用100μl的100％etoh再悬浮。接着，对(i)中制作的02t6株的孢子，使用上述的dna-金颗粒溶液，用gds-80(nepagene)进行基因导入。基因导入后的孢子在无机琼脂培养基(20g/l葡萄糖、1g/l硫酸铵、0.6g/l磷酸二氢钾、0.25g/l硫酸镁·七水合物、0.09g/l硫酸锌·七水合物、15g/l琼脂)上、在30℃的条件下静置培养1周左右。用植菌环搔取生长的菌体的一部分，悬浮于te(ph8.0)(nippongene)。将悬浮溶液在95℃下处理15分钟，由转化株提取核酸。以该核酸为模板，进行使用有引物ojk438(序列号30)及nk-299(序列号31)的pcr反应，将确认有目的dna片段的导入的菌株作为转化株进行选拔。将在cipc启动子下游导入有含有连结了rdcat1基因的dna的puc18-trpc-pcipc-rdcat1-tcipc的株设为cat1株，另一方面，将导入有含有没有插入rdcat1基因的dna的质粒载体puc18-trpc-padh-tadh的株作为阴性对照株(以下，nc株)来取得。用植菌环搔取剩余的菌体，在孢子回收溶液(8.5g/l氯化钠、0.5g/l聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)中激烈地进行混合。将混合后的孢子悬浮液用3gp100圆筒漏斗型玻璃过滤器(柴田化学)进行过滤，将其制成孢子液。孢子液中的孢子数使用tc20automatedcellcounter(bio-rad)进行测定。实施例2cat1株的细胞内过氧化氢酶活性测定(1)菌株的培养(i)菌丝体的制备在200ml用带挡板的三角烧瓶(旭硝子)中，供给以最终浓度0.5％(v/v)添加有山梨糖醇酐单月桂酸酯(rheodolsp-l10(花王))的100ml的sd/-trp培养基(clontech)，将实施例1中制备的cat1株及nc株的孢子液以成为1×103个-孢子/ml-培养基的方式分别接种后，在27℃下以170rpm搅拌培养3天。将得到的培养物使用预先进行过灭菌处理的网眼筛目250μm的不锈钢筛(asone)进行过滤，将菌体在过滤器上进行回收。(ii)菌丝体的增殖在供给至500ml容积三角烧瓶的无机培养液100ml(0.1g/l(nh4)2so4、0.6g/lkh2po4、0.25g/lmgso4·7h2o、0.09g/lznso4·7h2o、50g/l碳酸钙、100g/l葡萄糖)中接种(i)中回收的湿菌体5.0～8.0g，在27℃下以220rpm进行搅拌培养约40小时。将得到的培养物使用预先进行过灭菌处理的不锈钢丝网过滤器架(millipore)进行过滤，在过滤器上回收菌体。进一步在该过滤器架上用200ml的生理食盐水清洗菌体。用于清洗的生理食盐水进行吸滤而除去。(2)菌体破碎液的制备将上述(1)中得到的cat1株及nc株的湿菌体6.0g植菌于供给至200ml容积三角烧瓶的无机培养液40ml(0.0175g/l(nh4)2so4、0.06g/lkh2po4、0.375g/lmgso4·7h2o、0.135g/lznso4·7h2o、50g/l碳酸钙、100g/l葡萄糖)，在35℃下以170rpm进行搅拌培养24小时。将得到的培养物使用预先进行过灭菌处理的不锈钢丝网过滤器架(millipore)进行过滤，在过滤器上回收菌体。进一步在该过滤器架上用200ml的生理食盐水清洗菌体，将生理食盐水进行吸滤而除去，将菌体每0.3g在-80℃下冻结。将冻结菌体使用多珠振荡器及金属锥(安井器械)进行破碎。在此加入50mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)1ml再次破碎，在15000rpm·4℃下离心分离5分钟后，将上清液使用amiconultra-0.5(10kda、millipore)进行浓缩、清洗，制成菌体破碎液。(3)过氧化氢酶活性测定在添加有上述(2)中得到的cat1株及nc株的菌体破碎液0.1μl的96孔检测板(uv-star)上加入20mm磷酸缓冲液(ph7.4)180μl，通过添加0.75％过氧化氢水20μl而开始反应。由27℃下的240nm的吸光度(吸光系数＝43.6m-1·cm-1)的倾斜度、以每1分钟的过氧化氢减少量(u＝μmol/min)为基准算出活性值(u/菌体湿重量mg)。将分析结果示于表2。与作为对照株的nc株相比，cat1株的过氧化氢酶活性提高了约4倍。[表2]实施例3cat1株的c4二羧酸生产能力(1)菌株的培养(i)菌丝体的制备在与实施例2(1)(i)同样的条件下使菌丝体增殖。(ii)菌丝体的增殖在与实施例2(1)(ii)同样的条件下使菌丝体增殖。(2)转化株的c4二羧酸生产率评价将上述(1)中得到的cat1株及nc株的湿菌体6.0g植菌于供给至200ml容积三角烧瓶的无机培养液40ml(0.0175g/l(nh4)2so4、0.06g/lkh2po4、0.375g/lmgso4·7h2o、0.135g/lznso4·7h2o、50g/l碳酸钙、100g/l葡萄糖)，在35℃下以170rpm进行搅拌培养。培养8小时后，回收不含有菌体的培养上清液，通过后述的参考例1中记载的步骤进行c4二羧酸(富马酸)的定量。基于求出的各c4二羧酸的量，按照下述式算出cat1株中的各c4二羧酸的生产能力提高率。提高率(％)＝(cat1株中的生产速度/nc株中的生产速度)×100-100将结果示于表3。与未导入rdcat1基因的nc株相比，在cat1株中，观察到41％的富马酸生产能力的提高。[表3]株名c4二羧酸生产速度(g/l/h)生产能力提高率(％)cat1株1.4041nc株0.99-参考例1c4二羧酸的定量培养上清液中的c4二羧酸的定量利用hplc进行。就供给至hplc分析的培养上清液而言，预先用37mm硫酸适当稀释之后，使用dismic-13cp(0.20μm醋酸纤维素膜、advantec)或acroprep96孔过滤板(0.2μmghp膜、日本pall)进行不溶物的除去。hplc的装置使用lachromelite(hitachihigh-technologiescorporation)。分析柱使用连接有icsepice-ion-300guardcolumncartridge(4.0mmi.d.×2.0cm、transgenomic)的有机酸分析用聚合物柱icsepice-ion-300(7.8mmi.d.×30cm、transgenomic)，洗提液在10mm硫酸、流速0.5ml/分钟、柱温度50℃的条件下进行溶出。在各c4二羧酸的检测中使用uv检测器(检测波长210nm)。浓度标准曲线使用标准试样[富马酸(销售代理商代码063-00655、和光纯药工业)]而制作。基于各自的浓度标准曲线，进行各成分的定量。将由定量的培养基中的c4二羧酸量减去该培养基的初始c4二羧酸量所得的值设为c4二羧酸生产量。将用培养开始后8小时的时点下的每培养基的各c4二羧酸量除以培养时间所得的值作为该细胞的各c4二羧酸的生产速度算出。序列表<110>花王株式会社<120>丝状菌变异株及使用其的c4二羧酸的制造方法<130>ks1531<150>jp2016-234380<151>2016-12-1<160>31<170>patentinversion3.5<210>1<211>1455<212>dna<213>戴尔根霉(rhizopusdelemar)<220><221>cds<222>(1)..(1455)<400>1atgaccaagaacgttcttactacatccaatggtaatcctgtcgaaaac48metthrlysasnvalleuthrthrserasnglyasnprovalgluasn151015aaccaaacatctcaaactgctggtgcctggggacctgtccttattcaa96asnglnthrserglnthralaglyalatrpglyprovalleuilegln202530gattttcatttagttgataaacttgctcactttgacagagaacgtatt144aspphehisleuvalasplysleualahispheasparggluargile354045cctgagcgtgtggttcatgcaaaaggtgctggtgcacacggtgttttt192progluargvalvalhisalalysglyalaglyalahisglyvalphe505560gaggttactaatgacatcactcatctcaccaaggccaagtttttgagt240gluvalthrasnaspilethrhisleuthrlysalalyspheleuser65707580catgttggtaaaacaactccagtctttcttcgattctcaactgttggt288hisvalglylysthrthrprovalpheleuargpheserthrvalgly859095ggtgaaaaaggtagtgctgatactgctcgtgatcctcgcggttttgct336glyglulysglyseralaaspthralaargaspproargglypheala100105110ttaaaattttatactgaagaaggcaattgggatatggttggcaataat384leulysphetyrthrglugluglyasntrpaspmetvalglyasnasn115120125accccagtcttctttattcgtgatccttccaagttcccagactttatt432thrprovalphepheileargaspproserlyspheproasppheile130135140cacactcaaaaaagaaaccctagaaccaactatgctgatccagatgcc480histhrglnlysargasnproargthrasntyralaaspproaspala145150155160ttttgggatttcctttcccttgttcccgagtcaattcatcaagtcacc528phetrpasppheleuserleuvalprogluserilehisglnvalthr165170175attcttttctccaacagaggtacacctgatggttaccgccatctcaat576ileleupheserasnargglythrproaspglytyrarghisleuasn180185190ggctactcctctcacactctcaagttggtcaacgataagggcgagttc624glytyrserserhisthrleulysleuvalasnasplysglygluphe195200205aagtacgttaaatggcacttcaagaccgatcaaggcatcaagaatctc672lystyrvallystrphisphelysthraspglnglyilelysasnleu210215220acagcccaaaaggctggtgaacttgctggctctgatccagactacgcc720thralaglnlysalaglygluleualaglyseraspproasptyrala225230235240acacgcgaccttttcaatgccattgaacgcggtgattatccttcttgg768thrargaspleupheasnalailegluargglyasptyrprosertrp245250255tctgtttatatccaagtcatgaaccctgaagatgccaaaaagtatcgc816servaltyrileglnvalmetasnprogluaspalalyslystyrarg260265270ttcaatcctttcgacgttaccaaagtttggtcacacaaggattatcct864pheasnpropheaspvalthrlysvaltrpserhislysasptyrpro275280285cttcaacctgtgggcaaacttacattgaaccgtaaccctgaaaactac912leuglnprovalglylysleuthrleuasnargasnprogluasntyr290295300tttgctgagactgagcaagctgccttctctccttctcatattgtacct960phealagluthrgluglnalaalapheserproserhisilevalpro305310315320ggtattgatgtttctcctgatcgtatgttgcaaggccgtctcttttct1008glyileaspvalserproaspargmetleuglnglyargleupheser325330335taccctgatactcaccgtcatcgtcttggtgtgaactatgcacagatt1056tyrproaspthrhisarghisargleuglyvalasntyralaglnile340345350cctattaaccaaccccagtgccgtgtctctaatcatcagcgtgatggt1104proileasnglnproglncysargvalserasnhisglnargaspgly355360365caaatggctgttttgggcaatggtggatctgctcctaattatgaaccc1152glnmetalavalleuglyasnglyglyseralaproasntyrglupro370375380aactcattcagtggacctcaacaaaccaatattgccgctactactttt1200asnserpheserglyproglnglnthrasnilealaalathrthrphe385390395400accgctgaagaacttgaaggcgtcactggccgtcatagttttaccttg1248thralaglugluleugluglyvalthrglyarghisserphethrleu405410415accgacgatgactttgtacaagctggtgacttgtatcgtctcatgtct1296thraspaspaspphevalglnalaglyaspleutyrargleumetser420425430gctgaagaaaagactgatttgatcaacaatatcgccaggcacttgaag1344alagluglulysthraspleuileasnasnilealaarghisleulys435440445aatgccaagaagcatatccaagagcgccaaattggtcactttaagcgt1392asnalalyslyshisileglngluargglnileglyhisphelysarg450455460gctgatccagaatatggtcaaagaattgagcagactattttggctttg1440alaaspproglutyrglyglnargilegluglnthrileleualaleu465470475480agctcaaaagcttaa1455serserlysala<210>2<211>484<212>prt<213>戴尔根霉(rhizopusdelemar)<400>2metthrlysasnvalleuthrthrserasnglyasnprovalgluasn151015asnglnthrserglnthralaglyalatrpglyprovalleuilegln202530aspphehisleuvalasplysleualahispheasparggluargile354045progluargvalvalhisalalysglyalaglyalahisglyvalphe505560gluvalthrasnaspilethrhisleuthrlysalalyspheleuser65707580hisvalglylysthrthrprovalpheleuargpheserthrvalgly859095glyglulysglyseralaaspthralaargaspproargglypheala100105110leulysphetyrthrglugluglyasntrpaspmetvalglyasnasn115120125thrprovalphepheileargaspproserlyspheproasppheile130135140histhrglnlysargasnproargthrasntyralaaspproaspala145150155160phetrpasppheleuserleuvalprogluserilehisglnvalthr165170175ileleupheserasnargglythrproaspglytyrarghisleuasn180185190glytyrserserhisthrleulysleuvalasnasplysglygluphe195200205lystyrvallystrphisphelysthraspglnglyilelysasnleu210215220thralaglnlysalaglygluleualaglyseraspproasptyrala225230235240thrargaspleupheasnalailegluargglyasptyrprosertrp245250255servaltyrileglnvalmetasnprogluaspalalyslystyrarg260265270pheasnpropheaspvalthrlysvaltrpserhislysasptyrpro275280285leuglnprovalglylysleuthrleuasnargasnprogluasntyr290295300phealagluthrgluglnalaalapheserproserhisilevalpro305310315320glyileaspvalserproaspargmetleuglnglyargleupheser325330335tyrproaspthrhisarghisargleuglyvalasntyralaglnile340345350proileasnglnproglncysargvalserasnhisglnargaspgly355360365glnmetalavalleuglyasnglyglyseralaproasntyrglupro370375380asnserpheserglyproglnglnthrasnilealaalathrthrphe385390395400thralaglugluleugluglyvalthrglyarghisserphethrleu405410415thraspaspaspphevalglnalaglyaspleutyrargleumetser420425430alagluglulysthraspleuileasnasnilealaarghisleulys435440445asnalalyslyshisileglngluargglnileglyhisphelysarg450455460alaaspproglutyrglyglnargilegluglnthrileleualaleu465470475480serserlysala<210>3<211>2298<212>dna<213>戴尔根霉(rhizopusdelemar)<400>3atgaccactttacttattgacaactacgacagttttacttataatgtctatcaatacttg60agctgccaaggcgccaatgtagttgtctacagaaacgacaaaatcaccatttccgaaatt120gagcaattggctcctcgcaatattgtcatctcacctggccctggccacccttccaccgat180gccggtgtctctcgagaggccattcgagcttttgcaggaaagattcccatcttgggtatt240tgtatgggtcagcaatgtatgtatgaagtgtacggtggtaaagtgtcatatgcaggtgat300attgtgcatggcaaggcatccagcatcaagcatgacagtcgaggtatcttcaagggcgtt360cctcaaaacaacatggtcactcgttaccattcccttgctggcatgccttctactttacct420gaaacattagaagtcactgcgactaccgacgatggtatcatcatgggcattcgacacaag480gaatacactgtcgaaggtgttcagttccatcctgaaagtatcctttgtgaacacggacat540acgatgatcaacaacttcttaagcttgcgtggtggcacctgggaagagaatcctgcagcc600ggtgttgtctttaagaaagctcgttccgaaacacccaaaatcagtgctagtgaatcccaa660ctcgatctctctcagcaacaacctgccgcagcaccttccatcttgacccgcatttactct720caacgactcaaggatgttcaggcagccaaggagattcccggccagacatttgaagattta780gaaaaacttttaaagttgcacgtcgccccacctcttcaagacgtcgtcgctcgcgtgcgt840caaagcaagcccgccttgatggccgaagtcaagcgtgcctctccctcgaaaggaaacatt900gatgtttcggccaacgcggctgagcaggcacttcaatatgctttagcaggtgcaagcgtc960gtctctgttctgactgaacccaaatggttccgcggtacgattcatgatatgcatcaggtc1020cgagaggccttgagccatctgcccaaccgtccttgtgtgttgagaaaggattttattgtc1080gatcgctatcaaatcttggaaggttgtctgtacggtgctgatactatcttgttgatcgtg1140gccatgctgaatgatgaacaactgcacgaattgtatcactatgcgaaatcattaggtatg1200gaacccttggtcgaagtcaataatacggaagagatggcccgtgccaatgctttgggcgca1260cgtctggtgggtgttaataatcgcaacttgcacagctttgatgttgatatggaaaccacg1320agtcgattggtagagatggtgcctgaaggaacgatcttgtgtgcactttctggtattact1380ggacgagctgatgttgaaatgtacgtcaaacagggtgtgcacgctgtcttggtgggtgaa1440gccctgatgcgtgcttggaatttgaaggagtttgtgtctgatttgttgggtcatgaaaag1500aaggatcctgtgcctgtgtccaaggaatcaaaatcttcactagtcaaggtatgtggtatc1560tctagtgtggatgcagcagttgaagcagccaagtcaggggctgacttgattggtcttatc1620tttgctgaaaagtccaaacgaaaagtgtctttggaaagagctcaagaaatcgtgtcctca1680gtgcgtgcgttggatattcaagtcaaacgaacgttatcaaatgatgattctcaactggat1740tggttccagatgcacaagcgtctcttggaaaagcgagcaagaaaacctttggtagttggc1800gtgtttgtgaatcaatcgattgaatacatgactgaggtggcaacgacagtcggactggac1860cttattcagctgcatggaaccgaatcaacggagcttgcacgctatttacccgtgcctgtc1920atcaaagctttccatatcgacagtggtgagttcaatgaagctcagataccaaacctaaat1980caaccaggctcttatcattatgtcttactggacgctaaagtgcccagcttaccatcggat2040caacaaggtggacgtggtgtcaagtttgattggtcaattgctaccaaaatcgtgaaacat2100aggcactttgagtttttgggtaatcaagatttccctgtcatcttggctggtgggttggat2160cctaccaatgtggcatctgccattcaacaggtgaaaccctggattgtggatgtgtcgagt2220ggtgttgaaacagatggagtgaaggatttagaaaagattcgtgcctttgttaaaactgtc2280cagtcaacacaattttaa2298<210>4<211>1000<212>dna<213>戴尔根霉(rhizopusdelemar)<400>4tagagggaaaaagagagaattgaaataggagaggatgagtcaaaatatagtttacataaa60atttctcttttttgtgttaaatataatctaatagcaggggttttcttagtttacgtttat120atcaaagttatcaagcatacacttttttatgatttttcatactttaatcccttttagtat180tctattgtttgaaaggagagaaaaaacagctgagggtacggtgcacacgagatcttacga240taattttcctgcccaacaggaaagaagtaattgatcttgattgacgctcggagtttgcac300gttcggagtttgcacttcacattgagttatactcttacttattttgaaggaagggacgag360aaaagatgtaaatataataataacagtagtaaatagtatgcgcatcaagaacagctacca420acaaaagagagaaatatgagcttaataatgaacaatgtaaatggcagaatgaaatttaat480tatcaaagcggcatctttcagaccttccgttacttccgatagagttttttatgcaaagta540ataacaactgtatatataaaaaaaagaaggttatcaagcaaaagccacaatgtcatatct600ggaataatcaagagtaactattgaatgttggtagccaaaagaggcacgtaattttatgac660gaaatatcacacaaaaagattattttgacaattcatgaataggacagagatacaccctaa720acatgaaatgtaagctatatttaaacacctcaagttaattttgaagcttcatttgtatta780ttgtaaccatttagacaagctaaatcctttttattattgtccttattgattttatccaga840ttaccgtatctaaagagcgatcaacagaaaaacggctgattttagaccaaagtttcacaa900actacatttgcatgaacgtcatatatatataaaccttgacttttcttttttttttttttt960tttttttttcattatcaattaatacaattaaataacaaaa1000<210>5<211>634<212>dna<213>戴尔根霉(rhizopusdelemar)<400>5tcattttaattacgcattttcatttactaatttgttacattttgataacgtcaataaatc60ttctaatttcttttgttctcaaacagtttacagttctatctttttttttaccacaatcaa120ttctcaatatacaacatagcaaatgtgcttcagtaaattcattaaattcttttaaaaaaa180ggtaatttgtagcataaaattcgactttattgacgttttttttatgatcatatacaaata240aaatagttgcgaatgagaactaaatttttcattgtttttagtcatatcatctggctgttg300cacgatgatcgcagcatatttttcttcacaacactcatcctataagcacctttcaggact360ttcgtctgcactttccatatttgatttcatcaattgatttgaatttttatccagtacaat420ggtttgaatctatacaataaattagtcacagtataaaattatgtctcatcttgaacacac480acctgcttaacaaagaaatgaagcactctatcaatagtaaatacaatatatgcatcgatg540ccaaatatatatcgtacattctcttcaaacgtagcttgatctaaatcgccatcaataaac600ctttcaatcatcctcactagtgcattataatggc634<210>6<211>729<212>dna<213>戴尔根霉(rhizopusdelemar)<400>6ggttactgaaactggtgtagaaattttaacatagaagcaataaaacttacattcttccct60ctctttacatctacgcatgtttgccaagaataaaatgcctcatttcgggtatatcttttt120tagataggagttgtaacttgtaatattaagcaatgtaacggacttgtatatttttaatca180aatacgtgtcgtgttttattaaacgagcagaatcacttttctatactgaataaaagtaaa240aagaaccgaatgcgttggtaataaattattttatcttttttttttgttttttcacttgta300aaaaaccttaaatgtttaggtttcatccgttttcggcttagtaaaataagctaaaagggc360ttgtggcgttacacggctattaaactttacataaagtaaaacatcatttgtccctttata420acaaaacgaatgggaaaataaccctccatctttttaaacaaaatgagaaaggtaacaata480acaaaaactggaatgtgcttgggaaacttgaaaaaaagataagcgcgtcactcttgtttt540cttttttgtttggttatgcataatattatttgtacctcgaaaaaaaatcttcggaatttg600tattttttatatatacggatgatagatgaaaaaaggaaaaagctgatggggcgtatgtat660ttgtcaaaaaagctataaaagagcacaagttttcacatttcgttttttttttttcttcat720actctaacc729<210>7<211>955<212>dna<213>戴尔根霉(rhizopusdelemar)<400>7ataacataatctcgtaaataacctttttcgctccctgtgaaattatataaataaaaaaaa60atcttgtttgtacaaactacttttatgtttcatctttttttttttaaaaaaaaaacgcgt120tttgattataagcagagatggatttcatccaaaaggaaaattagaaaaatagtctggtca180ttttgaaaggaaaagaatgcttccaagtaagggttgtttcaacgaagggtataaatcctt240tcacacgctttcatactttatacatcaaatagtaaggagacttgataaatgccctgtctc300aaatgcttttttactttcatgtaaaataagcttgtcttacgcgcaattttactaacctta360agaaggcgattctttgacgatgtttcccgggtattgaacaatcgtttttatttttcgaga420acccctgaatctccaaaaaaaggaaggtagttttgaaaaagtatgccgtcatttttactg480taccagtaaaaaaaaatattcttaaacggcatctttgttttacagaaaagcaagaaagct540tctcgactccatttttttatagcaccaaatgtcgattacacaagaaagcttaaaataatc600atgacaatttccttgaaaataaactttattatagttgaatatagagagctataaaatagc660tttgcatttccttcttttttttttcttacgattgaaatggtttatttcaaaaggtccata720caccaaataaaaagccatgtataaaagaaaacgtttagggccatcaacaaatataggtat780tacgcactcaagaaagaacagacggggaaagaccgatatgagtttaacgtccgaaagaaa840agaaagggaaaagcccaagactcgaagggcgagaaatagtgcgtttgttaaataaagagt900gagaggatactgctaaaaagcttaaagaaatagggcagtgagtagagtgaaaagg955<210>8<211>46<212>dna<213>人工<220><223>引物ojk162<400>8cgagctcgaattatttaaatgaacagcaagttaataatctagaggg46<210>9<211>39<212>dna<213>人工<220><223>引物ojk163<400>9tatgaccatgattacgatgagaggcaaaatgaagcgtac39<210>10<211>30<212>dna<213>人工<220><223>引物ojk164<400>10atttaaataattcgagctcggtacccgggg30<210>11<211>20<212>dna<213>人工<220><223>引物ojk165<400>11cgtaatcatggtcatagctg20<210>12<211>29<212>dna<213>人工<220><223>引物ojk202<400>12tagagggaaaaagagagaattgaaatagg29<210>13<211>31<212>dna<213>人工<220><223>引物ojk204<400>13ttttgttatttaattgtattaattgataatg31<210>14<211>36<212>dna<213>人工<220><223>引物ojk205<400>14aattaaataacaaaatcattttaattacgcattttc36<210>15<211>37<212>dna<213>人工<220><223>引物ojk216<400>15catgattacgcggccgcgccattataatgcactagtg37<210>16<211>35<212>dna<213>人工<220><223>nk-411<400>16cattttgcctctcatggttactgaaactggtgtag35<210>17<211>30<212>dna<213>人工<220><223>nk-412<400>17acgagattatgttatggttagagtatgaag30<210>18<211>30<212>dna<213>人工<220><223>nk-413<400>18ataacataatctcgtaaataacctttttcg30<210>19<211>35<212>dna<213>人工<220><223>nk-414<400>19tatgaccatgattacccttttcactctactcactg35<210>20<211>38<212>dna<213>人工<220><223>引物ojk210<400>20ctctttttccctctaatgagaggcaaaatgaagcgtac38<210>21<211>44<212>dna<213>人工<220><223>引物ojk211<400>21aattaaataacaaaaatgtcttctatcgaaacctccaaaatctc44<210>22<211>35<212>dna<213>人工<220><223>引物nk-052<400>22aattaaataacaaaaatgaccaagaacgttcttac35<210>23<211>35<212>dna<213>人工<220><223>引物nk-064<400>23gcgtaattaaaatgattaagcttttgagctcaaag35<210>24<211>25<212>dna<213>人工<220><223>引物nk-011<400>24ttttgttatttaattgtattaattg25<210>25<211>21<212>dna<213>人工<220><223>引物nk-012<400>25tcattttaattacgcattttc21<210>26<211>35<212>dna<213>人工<220><223>引物nk-274<400>26cttcatactctaaccatgaccaagaacgttcttac35<210>27<211>35<212>dna<213>人工<220><223>引物nk-278<400>27acgagattatgttatttaagcttttgagctcaaag35<210>28<211>15<212>dna<213>人工<220><223>引物nk-269<400>28ggttagagtatgaag15<210>29<211>23<212>dna<213>人工<220><223>引物nk-270<400>29ataacataatctcgtaaataacc23<210>30<211>21<212>dna<213>人工<220><223>引物ojk438<400>30gttccttgctgtggatttgtg21<210>31<211>21<212>dna<213>人工<220><223>引物nk-299<400>31gaaatgtgaaaacttgtgctc21当前第1页12