提供治疗活性细胞产物的制作方法

本发明涉及包含非造血干细胞和祖细胞的治疗活性细胞产物，并且其涉及提供细胞产物的方法。

背景技术：

人类和动物有机体的成体组织包含成体干细胞，已知其自我更新并分化成组织细胞，从而在生理上提供组织修复和组织再生。这使得成体干细胞的使用对临床应用具有吸引力。

成体干细胞分离自多种组织来源，比如脐带、骨髓和脂肪组织。分离自骨髓的造血干细胞已用于治疗恶性血液病患者多年，并且现今成体干细胞手术程序的临床应用仍主要与造血干细胞相关。

然而，骨髓不仅含有异质的造血干细胞群，而且含有非造血干细胞群。骨髓的非造血干细胞包括例如间充质干细胞、组织特异性祖干细胞和具有分化成各种不同组织能力的多效能或多潜能干细胞。对于一些间充质干细胞，已知其具有多效能分化潜能。

同时，实施了数百项基于干细胞治疗的临床研究，以便测试和证实可行性和功效，如可例如源自互联网上的出版物，比如(http://www.clinicaltrial.gov/)或其他网站比如http://neuro.cellthera.org/for-specialists可得到的美国国立卫生研究院官方数据库。许多使用非造血干细胞的临床试验仍在进行中。

使用非造血干细胞治疗或者特别是使用间充质干细胞建立常规临床应用的主要困难为由于难以获得[间充质]干细胞产物。仍然没有建立提供非造血干细胞的标准方法，这使得评估治疗效果和比较临床研究困难。

必须克服关于提供用于移植的间充质干细胞的几个困难：首先，间充质干细胞罕见，例如在骨髓中其仅占细胞的0.001-0.05%部分。此外，缺乏一致表达的表面抗原用于基于阳性标记物鉴定和分离间充质干细胞，这例如对于造血干细胞是可能的。国际细胞治疗学会(isct)于2006年公开了一份用于建立msc特征性最低标准的意见书，比如塑料粘附、体外多效能分化潜能和超过95%的细胞存在cd105、cd73和cd90和少于2%的细胞基本缺乏即cd45、cd34和cd14或cd11b或cd79α或cd19组合的表达。然而，这些标准存在缺点，比如cd105、cd73和cd90不仅在间充质干细胞msc上表达而且在许多其他细胞类型上表达，并且在体外和体内观察到的间充质干细胞分化潜能不一定相同且可例如随着细胞来源或培养条件进一步变化。事实上，许多障碍，包括间充质干细胞通常不能通过其表面标记物(表面抗原)来定义，msc由于体外培养而产生非同源细胞群，以及得自鼠间充质干细胞分离和培养的结果不能转移至人间充质干细胞，仍然阻碍提供包含间充质和其他干细胞的治疗活性细胞产物用于治疗疾病比如自身免疫性疾病和/或涉及组织变性的神经系统疾病。

发明公开

因此，本发明的一般目的为提供治疗活性非造血干细胞产物的方法。细胞产物和提供它的方法试图单独或以任何组合克服、减轻或消除上述不利条件。

本发明的特别目的包括提供细胞产物的方法，细胞产物包含非造血器官特异性祖干细胞、多潜能干细胞和多效能干细胞，并且特别是间充质干细胞。

本发明的目的进一步包括在由于各种原因(包括由于例如毒素、感染或创伤引起的自身免疫性和神经系统疾病或组织坏死)引起的组织损伤或组织缺失之后根据需要提供用于医疗用途的细胞产物。一个特别目的为提供细胞产物，其在其中迄今为止组织损伤的治疗处理不令人满意的情况下促进、改善或使组织再生。这种目的包括提供改进的细胞产物，用于治疗自身免疫性疾病和/或神经系统疾病，比如多发性硬化和伴有一些细胞和组织类型进行性缺失的其他疾病。

这种目的通过提供独立权利要求以及从属权利要求的其他实施方案的细胞产物和制备它的方法得到解决。为了实现本发明的这些和更进一步目的(其随着描述的进行将变得更加明显)，本发明的以下方面显示如下所述。

本发明的第一方面涉及提供治疗活性细胞产物的方法，细胞产物由组织捐献离体制备，形成原始细胞群。可从原始群制备洗涤和/或挑选的细胞悬浮液。方法包括体外免疫耗尽造血干细胞和造血谱系细胞。免疫耗尽包括表达一组所选表面抗原的至少一种所选表面抗原的细胞耗尽。所选表面抗原组包括cd45表面抗原家族的至少一个成员(特别是cd45)和至少3种选自cd14、cd19、cd34、cd45表面抗原家族的其他成员和icam-1的表面抗原。通过该方法获得的治疗活性细胞产物包含一部分非造血干细胞，其包含非造血祖[干]细胞、多效能干细胞和/或多潜能干细胞。

用于捐献的组织可为包含非造血干细胞的任何组织。优选的组织为骨髓。

免疫耗尽包括其中表达一种或多种所选表面抗原的细胞用特异性抗体标记的免疫标记程序和用于从原始细胞群去除免疫标记的细胞比如特别是造血细胞的分离程序。

根据本发明的方法，细胞产物从自体或异源供体组织比如骨髓或另一组织离体制备。用于从人类或动物个体获得供体组织比如用于从脐带、脂肪组织(比如腹部脂肪或皮肤或沃顿氏胶)获得例如骨髓、外周或月经血或组织探针的医学方法被很好地建立并且不是本发明方法的主题。类似地，将细胞产物给予人或动物的身体行为不是提供本发明细胞产物的方法部分。

用于制备细胞产物的供体组织中含有的细胞称为原始细胞群。原始细胞群可悬浮产生原始细胞悬浮液。

在一些实施方案中，得自捐献组织的原始细胞群可在免疫耗尽之前分级或部分纯化。这种先前步骤可有效去除作为组织部分的特定细胞类型，例如来自高度供血组织(比如骨髓)的一些血细胞。例如，洗涤和过滤步骤可例如去除红细胞、大于滤器所选孔径的细胞、细胞碎片和与组织探针一起获得的其他组分。过滤步骤也可用于挑选组织探针的细胞和去除组织块。

术语“细胞悬浮液”适用于体外方法步骤序列期间的任何细胞悬浮液，如从上下文显而易见的那样。因此，除原始细胞悬浮液的细胞组成以外，所有后续细胞悬浮液的组成都不同于原始细胞群的细胞组成。

术语造血细胞是指造血系统的细胞，包括造血干细胞和分化期间各阶段的造血谱系细胞，包括例如淋巴或髓系祖细胞、成红血细胞和完全分化的造血细胞，比如红细胞、血小板、巨噬细胞、粒细胞或淋巴细胞比如b细胞和t细胞。

出人意外地，已发现本发明方法的细胞产物具有治疗活性。其包含非造血干细胞和由于去除造血细胞而富含一些非造血干细胞，特别是表达间充质干细胞特征性表面抗原的一些细胞类型。

依一些实施方案的细胞用途而定，可能期望从原始细胞群完全或基本上完全去除某些细胞类型，因此耗尽特定所选细胞类型的例如超过90%，或者特别是超过95%或99%。在一些实施方案中，这可以追求，例如对于造血细胞的子集(例如淋巴细胞(特别是b细胞和t细胞)以及分化成介导适应性免疫系统的细胞的相应祖干细胞)，或对于已知引起或助于由于自身免疫活性造成的组织损伤或用于从细胞产物去除癌症或癌前细胞的任何细胞类型。

然而，细胞产物的治疗活性通常不需要完全或基本上完全耗尽表达一种或多种所选表面抗原的所有细胞，或者特别是所有造血细胞。事实上，表达至少一种所选表面抗原的细胞或简称“所选细胞”的耗尽可依特定所选表面抗原和包括原始组织捐献来源在内的其他因素而定变化。在一些实施方案中，对各种所选细胞类型耗尽可在例如从原始悬浮液去除约15%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%或90%至几乎所有所选细胞的范围内，因此耗尽可在低或显著去除所选细胞至基本上完全或完全耗尽所选细胞的范围内。因此，在一些实施方案中，细胞产物可仍然包含表达特定所选表面抗原的一部分造血细胞，然而，优选地少于50%或者特别是少于30%或少于10%。

通过对几种所选表面抗原应用免疫耗尽，实现同时表达两种或多种所选表面抗原的靶细胞的特别有效去除。本发明方法中的免疫耗尽得益于该效果，因为其需要一组至少4种所选抗体用于免疫耗尽。

包含非造血祖[干]细胞、非造血多效能干细胞和非造血多潜能干细胞的细胞部分(其在细胞产物中含有或在细胞产物中富含，与原始细胞群相比较，由于特别是造血细胞的去除)，本文简称为非造血祖和干细胞，或者甚至更简称为非造血干细胞。其被定义为细胞的一部分，其能够自我更新并且不会固定于和/或不会不可逆地固定于造血谱系或其内的细胞类型。因此，非造血干细胞部分包括例如具有非常广泛分化潜能的非造血干细胞，甚至是多潜能干细胞、极幼稚干细胞、称为极小胚胎样干细胞(vsel)的细胞、多效能干细胞，并且特别是还有已知在组织再生中提供治疗益处的间充质干细胞。非造血干细胞部分还包括非造血祖[干]细胞。祖细胞通常呈现出比其他干细胞更有限的自我更新能力，并且通常其为单能性的，即确定分化成一种特定体细胞类型。祖细胞有时也称为确定的干细胞。然而，祖细胞不一定不可逆地固定于确定的细胞类型，并且依细胞环境和/或营养因素的影响而定，祖细胞可转分化成另一种细胞类型。非造血干细胞部分还包括多效能成体祖细胞(mapc)。干细胞生物学中对于某些细胞类型的术语仍在不断发展，并且有时具有基本相同干性水平和/或分化潜能的细胞称呼不同，并且反之亦然，一些分化潜能和/或干性水平不同的细胞称为同名。如上所示，在本发明的范围内，术语干细胞包括祖细胞(其可用符号“祖[干]细胞”表示)。

如本领域已知的那样，细胞在其表面表达许多抗原，这些抗原特征性地存在或不存在，这取决于特定的(干)细胞类型。因此，表面抗原(其也仅称为抗原或标记物)的分析使得能够根据其表面抗原谱来表征不同细胞类型。原始和随后的细胞悬浮液及细胞产物的细胞组成可通过计数表达特定细胞表面抗原的细胞数量来描述，特别是与总细胞数相比较。许多表面抗原属于cd(分化簇)表面抗原。

如本领域常规的那样，本文中细胞类型根据其生理作用指定，比如造血细胞、淋巴细胞、间充质干细胞和/或根据其抗原谱指定，表明表面存在还是不存在一种或多种表面抗原，比如cd34阳性(cd34⁺)或cd14阴性(cd14^-)。

本领域众所周知，表面抗原表达为动态细胞过程，取决于例如发育阶段、细胞健康、组织环境、年龄和其他因素。因此，特定细胞其表面抗原谱例如沿着其分化途径而变化，并取决于例如环境因素比如基于其健康或年龄阶段的组织或细胞因素。因此，在这种情况下，必须考虑选择用作所选表面抗原的表面抗原用于该方法的免疫耗尽。

例如，在造血系统的分化过程中，当造血干细胞和祖细胞从骨髓迁移至外周血系统时，其表面抗原谱作为时间并且特别还是其环境的函数而变化(更多信息，例如zydowicz.b.mazur.“cellsimmunophenotypeinnormalhematopoiesis”.postepybiologiikomorikitom35.2008.suplementnr.2435-44http://pbkom.eu/sites/default/files/artykulydo2012/35_s24_35.pdf)或者例如attara..“changesinthecellsurfacemarkersduringnormalhematopoiesis:aguidetocellisolation.”globaljournalofhematologyandbloodtransfusion.1.20-28.2014或者例如vanlocheme.g..“immunophenotypicdifferentiationpatternsofnormalhematopoiesisinhumanbonemarrow:referencepatternsforage-relatedchangesanddisease-inducedshifts.”cytometrypartb(clinicalcytometry)60b:1-13.2004)。

当选择表面抗原用于获得用于不同治疗应用的细胞产物方法的免疫耗尽程序时，考虑这种可变性可为有用的。例如，对于表面抗原谱与特定细胞类型的相关性，除本领域一般知识之外，有利地考虑关于组织捐献来源的特定情况。通常根据当前可得到的信息，包括以下表面标记物作为非造血干细胞和祖细胞的特征性表面抗原：cd105、ssea-4、cd166、cd146、cd44、cd71、cd90、cd73、cd106、cd117、cd133，cd34和cd133两者共表达。

特别是对于多潜能干细胞，包括cd133、ssea4和cd90作为相关抗原。

通常在非造血细胞上表达的这些非造血表面抗原中的一些也在一些造血干细胞或前体细胞类型上表达，特别是：cd34、cd117、cd133。

cd14、cd19、cd34、cd45家族和icam-1属于在造血系统细胞上表达的表面抗原。

cd14表面抗原(脂多糖受体)主要在造血细胞(比如单核细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞)以及在先天免疫系统的嗜中性粒细胞上表达。cd14也在一些癌细胞的表面，比如在髓单核细胞白血病和组织细胞肉瘤及其他形式的癌症表达，如可源自互联网例如http://www.cancerindex.org/geneweb/cd14.htm的那样。cd14通常不在间充质干细胞上表达。

cd19表面抗原与b淋巴细胞的抗原受体缔合，并且在成熟期间直至b细胞和浆细胞的成熟阶段存在于b谱系中非常早期细胞的b细胞上。

已知cd34在存在于成体组织中并可分化成造血和内皮细胞两者的成血管细胞上表达。

cd34表面抗原(糖基化跨膜蛋白)主要在造血干细胞上表达。特别是其在早期造血细胞和血管相关组织细胞上表达。其通常存在于早期造血和血管相关组织、脐带和骨髓中，作为造血干细胞的标记物。然而，cd34也在间充质干细胞的子集、内皮祖细胞、血管但不是淋巴管(除胸膜淋巴管以外)内皮细胞上表达。

认为有利的一些本发明实施方案从细胞产物去除部分但不是全部cd34表达细胞。

所选表面抗原cd14、cd19、cd45家族和icam-1通常在造血细胞上表达。

icam-1表面抗原，也称为cd54，通常在巨噬细胞和淋巴细胞及其干细胞和前体细胞以及内皮细胞上表达。

cd45表面抗原家族(各种形式的蛋白酪氨酸磷酸酶受体c-ptprc，以前称为lca-白细胞共同抗原)在除红细胞以外的几乎所有造血细胞上表达。单克隆抗cd45抗体已常规用于鉴定白细胞。

依细胞类型而定，cd45的各种剪接和糖基化变体例如cd45ra、cd45rb、cd45rc、cd45rab、cd45rac、cd45rbc、cd45ro、cd45r(abc)在细胞表面表达。例如，cd45ra存在于幼稚t细胞上，cd45ro在活化的t细胞和记忆性t-细胞上表达。cd45r在b细胞及其前体、树突状细胞和其他抗原呈递细胞的子群上表达。cd45表面抗原家族通常不在间充质干细胞上表达。

所选表面抗原组包括cd45家族的至少一种表面抗原，特别是其包括cd45。在其他特定的实施方案中，所选表面抗原组包括cd45家族的至少两种表面抗原。在特定的实施方案中，其包括cd45和cd45抗原家族的一种或多种其他表面抗原，比如cd45和cd45ra或者cd45和cd45ro，或者cd45、cd45ra和cd45ro或者cd45抗原家族成员的其他组合。

在一些实施方案中，所选表面抗原组包括cd14、cd34和cd45家族的至少一个成员。

在一些实施方案中，所选表面抗原组包括cd14、cd34、cd45和cd45家族的至少一个其他成员，特别是cd45和例如cd45ra或cd45ro。该方法中使用这组所选表面抗原导致共表达cd45ra或cd45ro的cd34细胞的特别有效耗尽。

所选抗原组还可包含除上述那些之外的指示造血干细胞的其他另外抗原。

例如，这种另外的表面抗原包括为各种细胞类型比如老细胞、高分化细胞、癌细胞或易于恶变的癌前细胞特征性的抗原。所选抗原组特别是可包括不在非造血干细胞上表达和/或不在已知对组织再生有益的细胞(例如分泌因子像分化因子、生长因子或促进干细胞在组织损伤部位分化和替换缺失细胞的因子的细胞)上表达的其他抗原。

为了选择)包括在所选表面抗原组中的其他表面抗原，技术人员可考虑组织来源和/或细胞产物的特定用途，并且特别是可应用以下一个或多个标准：

-另外的表面抗原，其为一种或多种细胞类型的造血干细胞和/或造血谱系细胞的特征，包括例如cd2、cd3、cd10、cd11b、cd15(ssea-1)、cd16、cd44、cd56、cd123、cd235a、cd326、cd49f中的至少一种；

-另外的表面抗原，其在间充质干细胞或据报道促进组织再生的细胞上不存在或基本上不存在，例如cd11a/lfa-1、cd31、cd80、cd86、cd40和cd144中的至少一种；

-表面抗原，其存在于癌细胞或癌前细胞或促进干细胞转化的细胞上，特别是cd9、cd15、cd20、cd24、cd31、cd38、cd44、cd117、cd146、cd166、cd171、cd184、cd324、cd325、cd326、cd338、erb2或her2/neu中的至少一种。

除依例如细胞的状态和来源而定考虑细胞表面抗原表达的动力学之外，技术人员也意识到干细胞生物学为活跃的研究领域，并将在适用时考虑例如互联网或印刷文献中相关的当前信息来源。

以下列出一小部分示例性参考文献集：

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在本发明方法的一个实施方案中，免疫耗尽包括用包含标签的特异性抗体标记表达一种或多种所选表面抗原的细胞的免疫标记程序，

其中标签可在抗体与表面抗原特异性结合之前与抗体缀合，或者标签可在免疫标记程序期间抗体与表面抗原特异性结合之后与抗体缀合，

其中标签特别地为磁珠或荧光标签；

和其中免疫耗尽包括用于以与标记程序分开的步骤或以步骤组合从悬浮液去除用包含标签的抗体标记的细胞的分离程序。

用于从细胞群体外去除特定细胞的耗尽方法(并且特别是免疫耗尽方法)为本领域众所周知的，并且包括标记程序(其中待去除的细胞被特异性标记)和用于以步骤组合或单独步骤从未标记细胞去除标记细胞的分离程序。标记和分离程序可组合或以单独步骤实施，特别是在其中使标记细胞与未标记细胞分离的分离程序之前去除过量的标记试剂比如抗体、标签缀合的试剂比如标签缀合的二抗等。在耗尽标记细胞之后保留在生成细胞群中的未标记细胞为期望的本发明产物。在一些实施方案中，标记和分离程序可以组合，例如在分离之前不分离未反应的标记试剂。

免疫耗尽方法包括免疫标记程序，其中抗体包含在相应的抗原结合位点与细胞表面抗原特异性结合的标签。标签(例如荧光化合物或磁珠)，可在抗体与表面抗原特异性结合之前或在作为免疫标记程序一部分的特异性结合之后附着于抗体。在分离程序中去除免疫标记的细胞。免疫耗尽、免疫标记和分离技术比如macs(磁性细胞分选或分离)和facs(荧光细胞分选或分离)等方法为本领域熟知的。有利地，这些方法的细胞产物由先前未结合并随后从抗体或标记抗体或柱洗脱的细胞组成。

在该方法的一些实施方案中，免疫标记为免疫磁性标记程序，其中磁性粒子作为标签并使用磁分离装置进行分离程序以耗尽免疫磁性标记的细胞。

在该方法的一些实施方案中，免疫标记为用表面抗原特异性抗体的直接免疫标记程序，抗体在标记程序之前与标签缀合。对于这种直接免疫标记，将细胞悬浮液与一种或与几种标签缀合的表面抗原特异性抗体一起温育。标签缀合的抗体比如与磁性粒子或荧光标签缀合的抗体可市售得到，或者可根据本领域熟知的方法获得。用标签缀合的抗体对细胞进行这种直接免疫标记可包括一个或多于一个温育步骤，其中在细胞悬浮液温育期间存在一种或几种标签缀合的抗体。

在一些实施方案中，该方法包括间接免疫标记程序，其中在标记程序期间使用与标签缀合的表面抗原特异性抗体。在间接标记的示例性实施方案中，在第一步，使细胞群与一种或者特别是与几种表面抗原特异性一抗一起温育。过量未结合的一抗优选地通过在第一个温育步骤之后离心和重悬浮细胞来去除。随后在第二步，使细胞群与标签缀合的二抗或与另一种特异性结合于一抗的标签缀合的试剂一起温育。在第一步例如可使用生物素化一抗，和在第二步例如可使用链霉亲和素包被的标签。在一些实施方案中，例如使用标签缀合的抗生物素抗体。与二抗或与另一种试剂缀合的标签可为例如磁性粒子比如右旋糖酐铁珠或荧光标签。过量未结合的二抗优选地通过在第二步之后离心和重悬浮细胞来去除。免疫标记任选地包括在第一和第二步之前和/或之后的另外步骤。在一些实施方案中，第一和第二步组合中的温育次数限于细胞悬浮液与一抗和/或二抗一起温育总计最多2次或最多3次或最多4次或最多5次。

本发明的方法可包括多于一个直接和/或间接免疫标记步骤，比如最多2个、最多3个或最多4个步骤。在这些和其他实施方案的一些中，该方法还可包括混合免疫标记，即直接标记和间接标记组合的一个步骤，比如通过使用除一种或多种标签缀合的抗体之外还包含一种或多种未缀合的一抗和/或标签缀合的二抗的抗体混合物。

出人意外地，通过限制表达所选表面抗原的一些所选细胞的耗尽程度，甚至可增加细胞产物中期望的非造血干细胞和祖细胞部分。

本文中的限制耗尽程度也称为限制条件下的耗尽。在该方法的相应实施方案中，选择限制条件使得与每个细胞表达相对大的所选表面抗原数目的细胞相比较(其耗尽程度较高或者完全或基本上完全耗尽)，每个细胞表达相对低的一种或多种所选表面抗原总数的细胞基本上不耗尽或耗尽程度较低。例如在小细胞的表面每个细胞可存在相对小数目的表面抗原，因为与较大细胞相比较，小细胞由于其尺寸小而通常每个细胞表达较低数目的表面抗原。而且，表面抗原表达不仅在质量上(即关于表面抗原的类型)变化，而且数量上(即每个细胞表达的表面抗原数目)可随着细胞类型而变化，特别是沿着其分化途径。此外，与表达中等水平的其中两种或多种所选表面抗原的细胞相比较，表达中等数目的其中仅一种所选表面抗原的细胞上可存在相对低数目的所选表面抗原。通过在限制条件下耗尽获得的特别是得益于所述干细胞和早期祖细胞(其通常比进一步沿着分化途径向下的细胞更小和/或每个细胞表达更少的表面抗原)的有利效果的细胞产物耗尽效率低下。

与具有较低数目的每个细胞结合的这种所选抗体的细胞相比较，有利于从具有较高数目的每个细胞结合的所选表面抗原特异性抗体的原始细胞群耗尽细胞的限制条件下的耗尽，特别是可通过选择其中一个以下条件或通过选择多于一个以下条件的组合来实现：

-在直接免疫标记程序中，限制性温育条件仅使得细胞上所选表面抗原的抗原结合位点被标签缀合的抗体部分饱和；

-在间接免疫标记程序的第一步，限制性温育条件仅使得细胞上所选表面抗原的抗原结合位点被一抗部分饱和；

-在间接免疫标记程序的第二步，限制性温育条件仅使得一抗的抗原结合位点被标签缀合的二抗部分饱和；

-在间接免疫标记的第一步应用标准温育条件，特别是调整温育条件以使得所选表面抗原结合位点达最大饱和度，同时最小化一抗与细胞的非特异性结合，其中在第二步限制性温育条件仅使得一抗上的抗原结合位点被标签缀合的二抗部分饱和；

-在间接免疫标记的第一步，限制性温育条件仅使得细胞上的所选表面抗原结合位点部分饱和，其中在第二步应用标准温育条件，特别是调整温育条件以使得一抗(特别是生物素化一抗)上的抗原结合位点被缀合标签(比如特别是标签缀合的二抗或者特别是抗生物素二抗或者特别是链霉亲和素缀合的标签像链霉亲和素包被的磁性粒子)达最大饱和度，同时最小化缀合标签与一抗或与细胞表面的非特异性结合；

-在分离程序，从原始细胞群去除用两个或更多个标签(特别是用至少3或4个或多于4个标签)标记的细胞，而包含较少标签的细胞保留在原始细胞群中，并且其中特别是标签为磁性粒子。

标准温育条件可指符合抗体制造商规格要求的条件，或者其可被确定，其中结合概率和/或接触效率和/或结合强度针对特异性结合的抗体对所选表面抗原的相应抗原结合位点达最大饱和度，同时保持抗体与缺乏特定所选表面抗原的细胞以相当低的水平非特异性结合进行优化。

可定量表达可变程度的耗尽以及富集程度。对于耗尽程度本文包括以下定量术语和定义：

相对耗尽程度定义为细胞产物中细胞总数的特定细胞类型部分与原始细胞群中细胞总数的特定细胞类型部分的比率。相对耗尽由小于1的数值表示。例如如果细胞产物中特定细胞类型部分为20%和原始细胞群中该特定细胞类型部分为80%，那么相对耗尽为0.25。耗尽的相对因子定义为相对耗尽的倒数，即在以上实例中因子为4。

耗尽程度可指特定细胞类型，其特别是通过生理作用(例如造血细胞)或通过其标记物(表面抗原)谱指定，如细胞表面存在或不存在特征性表面抗原所示。

相对富集和相对富集因子与以上对比率的定义相同，然而得到大于1的数值，表明细胞产物中的特定细胞类型部分与原始细胞群中的部分相比较得到增加。

绝对耗尽通常表示为从原始细胞群去除的细胞部分百分比，即如果去除100%则耗尽完全。

绝对耗尽程度定义为细胞产物中的特定类型细胞数量与原始细胞群中的该细胞类型细胞数量的比率。

绝对耗尽程度值必须始终小于1。作为实例，耗尽80%的细胞表明原始细胞群中存在的特定细胞类型的80%细胞被去除和20%在细胞产物中被回收，导致绝对耗尽程度值为0.2。绝对耗尽因子为绝对耗尽的倒数，并且在以上实例中表示5倍绝对耗尽这种特定细胞类型。

与原始细胞群相比较，耗尽程序不能增加产物中的绝对细胞数量。因此，绝对富集是不可行的。

耗尽程度受标记程序的效率和分离程序的效率两者影响。标记程序的效率定义为表达至少一种被标记的所选表面抗原的细胞数量部分，相对于表达可在最佳条件(即如通过滴定或根据制造商的规格要求确定的避免显著非特异性标记的条件)下标记的所选表面抗原的最大细胞数量的百分比。分离程序的效率定义为去除的标记细胞部分相对于存在的最大标记细胞数量的百分比。

本领域已知的免疫耗尽程序可使得从混合细胞群完全耗尽特定细胞类型，其可超过90%或95%和在标记程序中的抗原结合位点饱和条件下接近100%，并根据标准实验室技术优化用于去除标记细胞的条件。还有市售可得到的耗尽设备组、试剂和方案，使得能够基本上完全耗尽表达一种所选表面抗原或几种所选表面抗原的细胞。

出人意外地发现，细胞产物中细胞群的特别有利组成可通过有意调整方法条件来限制耗尽程度，使得弱标记细胞保留在细胞产物中而强标记细胞被去除来得到。

如上所述，标记弱细胞的生理原因包括特别是例如由于其尺寸小或由于所选表面抗原的表达低而在细胞产物中仅呈现出少量一种或多种所选表面抗原的细胞。

如通过facs分析特别是在限制耗尽程度的条件下获得的细胞产物所示，甚至在使用cd45和cd45抗原家族的至少一个其他成员的实施方案中，细胞产物也可出人意外地呈现出大部分表达cd45家族标记物的细胞。对细胞产物中cd45阳性细胞部分的进一步分析揭示其包含大量粒细胞。细胞产物相对于本发明方法(包括在免疫耗尽的限制条件下实施的实施方案)的原始群中表达所示表面抗原的细胞部分百分比率的示例性范围如以下表a所示。

表a

有利地，该方法产生具有干细胞部分的细胞产物，其足以提供足够大数量的干细胞用于直接给予患者，例如通过静脉注射全身给予，以实现治疗活性并使接受它的患者受益。因此，本发明的方法仅伴随非实质性操纵，并且特别是在给予之前没有体外培养用于扩增细胞数量而产生一种直接源自原始细胞群，准备用于转移至患者的细胞产物。在没有体外扩增情况下的这种给予细胞产物避免了已知在体外培养期间发生的非生理性细胞发育。鉴于已知与通过现有技术程序中使用的体外培养对例如阳性所选间充质干细胞治疗质量的负面影响相关的问题，这是相关的有利条件。相比之下，本发明第二方面细胞产物中的非造血干细胞和祖细胞部分(特别是间充质干细胞)，具有改善的、更自然的生理学品质。关于例如非造血干细胞部分的分化阶段和细胞环境，治疗活性细胞产物更类似于组织来源。此外，其以现有技术中用干细胞产物特别是现有技术间充质干细胞产物的其他制备方法无法实现的方式呈现出极好的细胞活力。

然而，如果认为对特定患者有益，则细胞产物还可经受体外培养以增加用于特定治疗应用的细胞数量，特别是最小化细胞分化的培养条件下的特定实施方案。

因此，在本发明方法的实施方案中，在优选地接受自体组织捐献和获得准备用于治疗性给予的最终治疗活性细胞产物之间仅需要几小时的短时间来实施所有离体方法操纵，其优选地不超过10或8或6或5小时。特别是，在该方法的实施方案中，除免疫耗尽之前的任选洗涤和过滤步骤之外，不实施进一步的并且特别是不实施实质性的离体操纵，比如梯度离心和/或特别是体外培养。这导致提供治疗活性细胞产物的方法其比本领域的标准程序快得多，其除了洗涤和阳性或阴性选择表达特定表面抗原的细胞之外，通常还包括耗时和/或实质性的离体操纵比如通过梯度离心纯化并且特别是用于扩增期望干细胞的体外培养。

用于实施所有或离体操纵的上述时间不包括对最终细胞产物样品的无菌测试，这种无菌测试在使得将细胞产物给予患者之前可能需要取决于临床规定。

因此，该方法提供一种提供包含非造血干细胞并且特别是间充质干细胞的改进的治疗活性细胞产物的方法。

提供治疗活性细胞产物的方法的上述和其他实施方案在详述和实施例部分得到进一步描述。

本发明的第二方面涉及可通过体外耗尽造血细胞获得的细胞产物，并且特别是其涉及可根据本发明第一方面的方法通过体外耗尽造血细胞获得的细胞产物。细胞产物其特征尤其为包含非造血干细胞的治疗活性细胞产物细胞群中存在的多样性细胞类型，所述干细胞包括多潜能和多效能干细胞、祖[干]细胞并且特别是间充质干细胞，特征为高细胞活力和其治疗活性。

因此，细胞产物不是纯化的非造血干细胞和祖细胞的产物。相反，细胞产物为包含许多不同细胞类型的异质细胞群。其具有特别有利的组成和细胞环境-除耗尽造血干细胞和谱系细胞之外，其与捐献组织中原始群的生理组成和细胞环境非常相似。与通过本领域常用方法获得的细胞产物相比较，基于例如物理分离技术比如塑料粘附或梯度离心或阳性免疫选择用于提供用于治疗应用的高度所选例如间充质干细胞群，随后进行体外培养，细胞产物具有改善的组织再生治疗活性。

通过在耗尽造血细胞期间仅对细胞群施加非实质性离体操纵，并且特别是不存在体内培养的情况下维持细胞组成、细胞环境和细胞的生理状态，似乎赋予本发明第二方面的产物不同品质和治疗效果的特征性有利条件：确实，根据当前的理解，组织再生受到处于不同分化阶段和不同类型的其他分化细胞(例如还包括分泌生长或分化因子的分化细胞)的干细胞和祖细胞之间重要信号传导的刺激。比阳性所选干细胞产物大得多的细胞产物群中细胞类型的多样性，被认为是其令人惊讶的治疗活性的原因。在一些实施方案中，细胞产物包含穿过血脑屏障的细胞或分泌穿过血脑屏障的因子的细胞或促进接受细胞产物患者的生理干细胞经分泌因子间接穿过血脑屏障或经细胞产物的转移细胞与患者细胞之间的直接细胞相互作用并从而细胞产物实现脑中受损组织修复的细胞。

在这些和其他实施方案的一些中，耗尽造血细胞的细胞产物特别有效地耗尽介导适应性免疫系统的细胞，特别是b细胞和t细胞及其相应的前体干细胞和祖[干]细胞。

耗尽方法为阴性选择程序，已知其为对经受耗尽试剂和操纵的细胞特别温和的程序。因此，可通过如例如通过本发明方法的免疫耗尽方法实施的非造血细胞阴性选择获得的细胞产物的进一步有利条件为，在耗尽造血细胞之后，作为用于治疗性给予的细胞产物保留和收集的那些细胞没有或没有显著地受到分离试剂比如抗体、磁性标签或荧光标签或物理处理比如塑料粘附的应激。至少大部分通过与免疫标记试剂比如抗体和其他试剂结合而显著触及的细胞从细胞悬浮液去除，而未显著触及或未触及的细胞保留在细胞产物中，并且期望的祖细胞和干细胞呈现出非常好的活力和健康生理活动。

根据第二方面并且特别是可根据本发明第一方面的方法获得的细胞产物保留至少显著部分的非造血多潜能和多效能干细胞和器官特异性祖[干]细胞，并且特别是间充质干细胞，其最初存在于捐献组织探针的原始细胞群中并且具有治疗活性。

已知例如在骨髓中这些干细胞和祖细胞仅以非常低的数量存在。例如间充质干细胞作为一部分以细胞总数的约0.001-0.05%的范围存在于骨髓中。本发明第二方面的耗尽造血细胞的细胞产物的重要特性为其包含处于活的和治疗活性状态的显著部分的非造血干细胞。

事实上，在本发明第二方面细胞产物的实施方案中，表达一些指示期望干细胞的表面抗原的细胞，即非造血多潜能和多效能干细胞和祖[干]细胞，特别是如通过血细胞计数分析测量的间充质细胞，构成细胞产物中与原始群中的部分相似或在细胞产物中增加的部分。非造血干细胞的增加部分对应于如上定义的期望干细胞的富集。因此，这种细胞产物中期望干细胞的数量构成细胞产物中总细胞数的更大部分(与该产物来源的原始细胞群中这些干细胞构成的部分相比较)。

例如，在可根据本发明第二方面通过从组织探针体外耗尽造血细胞获得的细胞产物的一些实施方案中，并且特别是在可根据本发明方法获得的一些实施方案中，表达一种或多种指示多潜能干细胞的表面抗原的细胞部分，比如表达ssea-4或cd90或cd133的细胞或共表达cd34/cd133的细胞，共计总细胞数量的至少0.01%-1%，特别是至少0.03%或至少0.1%或至少0.3%或至少1%，如通过血细胞计数分析测量的那样。

在可根据第二方面通过体外耗尽造血细胞获得的并且特别是可根据本发明方法获得的细胞产物的这些和其他实施方案的进一步中，表达一种或多种上述表面抗原和或一种或多种以下指示多潜能和祖干细胞的表面抗原比如cd90、cd133的细胞、共表达cd34/cd133、cd44、cd71、cd73、cd105、cd106、cd117、cd146、cd166或cd34的细胞部分共计至少0.01%-1%，特别是至少0.03%或至少0.1%或至少0.3%或至少1%，如通过血细胞计数分析测量的那样。

此外，在本发明第二方面特别是可根据第一方面的方法获得的细胞产物的这些和其他实施方案的一些中，表达cd34或者cd45表面抗原家族的表面抗原的细胞部分不超过20%，或者特别是不超过15%、10%或6%或4%或2%。

此外，在通过体外耗尽造血细胞，特别是可根据第一方面的方法获得的本发明第二方面细胞产物的这些和其他实施方案的一些中，表达表面抗原cd14、cd19、icam-1之一或共表达cd45/cd34的细胞部分不超过5%，特别是不超过2%或1%或0.5%。

此外，在通过体外耗尽造血细胞，特别是可根据第一方面的方法获得的本发明第二方面细胞产物的这些和其他实施方案的一些中，共表达cd45抗原家族的两种表面抗原，特别是共表达cd45/cd45ra或cd45/cd45ro的细胞部分不超过5%，特别是不超过2%或1%或0.5%。

显然，在本发明第二方面的细胞产物中获得的非造血干细胞和祖[干]细胞部分，如通过细胞血细胞计数对表达指示细胞产物的细胞总数中非造血干细胞类型的特定表面抗原的细胞数量测量的那样，取决于原始细胞群中表达特定表面抗原的细胞数量。

细胞产物的其他特征性参数为细胞产物中表达特定表面抗原的细胞部分(也称为“细胞产物中的阳性部分”)与耗尽造血细胞之前原始细胞群中表达特定表面抗原的细胞部分(也称为“原始群中的阳性部分”)的比率或百分比率。在本发明第二方面细胞产物的示例性实施方案中(其在以下实施例8中进一步描述，其中根据本发明第一方面方法的示例性实施方案实施耗尽造血细胞)，细胞产物中阳性部分与原始细胞群中阳性部分的该比率称为c/a(或%c/a比率)。

细胞产物的facs血细胞计数证实有效消除b细胞前体和b细胞、t细胞前体、nk细胞前体和单核细胞前体(表达或共表达特别是cd34/cd45、cd45/cd45ra、cd45、cd45ra、cd45ro、cd73/45、cd19、cd14及其他表面标记物)。

然而，如上所述，通过免疫耗尽去除靶细胞的效率取决于选择用于免疫标记的表面抗原的表达水平。表面抗原的表达水平范围可在表达很强、表达适度、表达弱、表达很弱至无表达，取决于多个参数比如年龄、疾病、组织类型、分化阶段等。因此，耗尽之后获得的细胞产物组成通常取决于原始细胞群中待通过耗尽去除的靶细胞的表面抗原表达。

因此，例如通过经facs分析表达任何特定表面抗原的细胞级分测量的细胞产物组成，例如从患者到患者或组织到组织等通常也呈现出大的变化。相比之下，当应用于相同细胞群时，本发明的方法高度可再现。类似地，细胞表面抗原的%c/a比率可能因患者而异，即使对原始细胞群捐献了相同组织比如骨髓。%c/a比率受原始细胞群的品质影响，比如受特定细胞类型或表达特定表面抗原的细胞绝对数量，或者例如受原始群的所有细胞中特定细胞类型的相对部分影响。原始细胞群的这种品质可能特别是受组织来源或健康阶段或原始细胞群来源的个体遗传背景的影响。已知例如受疾病特别是某些自身免疫性疾病影响的患者骨髓，在全骨髓细胞群表达特定表面抗原的细胞数量和细胞类型相对部分方面呈现出差异。

通过facs分析测量的细胞组成的广泛变化也反映在表a和b中，其中表示原始细胞群相对于细胞产物中表达特定表面抗原的阳性细胞部分的一般和优选百分比率(%c/a比率)范围。特别地并且如上所述，细胞产物可出人意外地呈现出大部分表达cd45家族标记物的细胞，其尤其是在粒细胞和粒细胞前体上表达。cd11b和cd15也为由粒细胞生成细胞和粒细胞表达的标记物。最终产物相对于原始细胞群中表达cd11b和cd15的粒细胞部分优选地降低。然而，粒细胞为造血系统的细胞，其不会干扰所述方法细胞产物的治疗效果。其甚至可增强治疗效果，因为已知它们促进组织损伤的修复(参见例如gustafsonetal.amethodforidentificationandanalysisofnon-overlappingmyeloidimmunophenotypesinhumansplosone|doi:10.1371/journal.pone.0121546march23.2015或allan.davids.andstrunk.dirk.2004.“regenerativetherapyusingblood-derivedstemcells(stemcellbiologyandregenerativemedicine)。

cd44为另一种表面标记物，其在粒细胞以及许多类型的造血和非造血干细胞和祖细胞上表达。本发明方法的有意目的为通过耗尽造血细胞和造血谱系细胞来获得富含非造血干细胞的细胞产物。然而，细胞产物中存在包括粒细胞在内的cd44阳性细胞，比如特别是造血系统的髓细胞、晚幼粒细胞和杆状核细胞，为可耐受甚至有利的。

确实，本发明的方法可呈现出细胞产物相对于原始细胞群中的cd44阳性细胞部分的百分比率(%c/a比率)为至少7%或至少30%，或者特别是至少7%-至多30%，或者更特别地为7%-25%。

细胞产物的facs血细胞计数分析包括每种单独使用抗cd45和抗cd14的单染分析、一起用于双染分析以及对照门分析，用于鉴定粒细胞(比如髓细胞、晚幼粒细胞和杆状核细胞)(cd14阴性)类型。

观察到在从不同健康对照组和患者获得的最终产物中，表达cd11b、cd15和cd44的细胞部分与表达cd45的细胞部分高度相关。

这与这些表面标记物在髓细胞、晚幼粒细胞和杆状核细胞上的已知共表达一致，所述髓细胞、晚幼粒细胞和杆状核细胞为例如由attarattara..globaljournalofhematologyandbloodtransfusion.1.20-28.2014公开的粒细胞前体。

进一步注意到ms患者和通常为患有自身免疫性疾病的患者具有升高的粒细胞水平。在ms患者的情况下，已知其在血液及骨髓中具有升高的ige水平。尽管ms患者的标准浓度小于100iu/ml，但在实施例8的临床实验中ms患者平均为约125iu/ml，并且测量值高达223iu/ml。已知ige刺激骨髓产生粒细胞生成细胞。此外，自身免疫性疾病患者通常呈现出升高的粒细胞水平，特别是嗜酸性粒细胞。这另外解释了源自ms患者并根据本发明方法制备的自体细胞产物中粒细胞的存在。

以下表b列出了与表达它们的至少一些相关细胞类型相关的几种细胞表面抗原，并且其此外列出了细胞产物中的阳性部分相对于原始细胞群(特别是涉及源自骨髓的原始细胞群)中的阳性部分通常观察到和优选的百分比率(%c/a比率)，如通过耗尽造血细胞获得，特别是根据本发明方法的实施方案获得细胞产物的实施方案中观察到的那样。

在可根据本发明第二方面通过从组织探针体外耗尽造血细胞获得细胞产物的一些实施方案中，对于表b中列出的表面抗原中的一种或多于一种或特定组合，细胞产物相对于原始细胞群中阳性部分的比率在通常或优选范围内。

在第二方面的一些实施方案中，细胞产物其特征为细胞产物相对于原始群中阳性部分的比率值，其与表b中关于特定表面抗原的所示值不同。

在一些实施方案中，细胞产物相对于多潜能干细胞(比如表达ssea-4或cd90或cd133的细胞或共表达cd34/cd133的细胞)的原始细胞群中阳性部分的一个或多个百分比率共计至少10%或至少20%或30%或50%或75%。

在这些和其他实施方案的一些中，细胞产物相对于表达表面抗原cd90、cd133、cd44、cd71、cd73、cd105、cd106、cd117、cd146、cd166、cd34中的一种或组合的多潜能干细胞或祖[干]细胞或者特别是共表达cd34/cd133的细胞的原始细胞群中阳性部分的一个或多个百分比率共计至少5%或10%或者至少20%或30%或50%或75%。

此外，在这些和其他实施方案中，细胞产物相对于表达cd34或表达cd45表面抗原家族的表面抗原的原始细胞群中细胞阳性部分的百分比率不超过40%，或者特别是不超过30%、20%或10%或5%。

此外，在这些和其他实施方案中，细胞产物相对于表达表面抗原cd14、cd19、icam-1之一或共表达cd45/cd34的原始细胞群中阳性部分的百分比率不超过25%，或者特别是不超过20%、15%、10%、5%、2%或1%。

此外，在这些和其他实施方案中，细胞产物相对于表达cd45表面抗原家族的抗原比如cd45、cd45ra、cd45ro的原始细胞群中阳性部分的百分比率不超过40%，或者特别是不超过30%、20%、15%、10%、5%、2%或1%。

本发明的第三方面涉及用于药物治疗，特别是用于缺失或受损组织的医学再生，并且特别是用于治疗自身免疫性疾病和/或神经系统疾病的细胞产物，其包含非造血祖[干]细胞、多效能干细胞和多潜能干细胞，并且特别是本发明第二方面的间充质干细胞(特别是通过体外耗尽造血细胞从骨髓获得)。捐献组织可源自多种来源，除骨髓之外还包括例如血液、脂肪组织、脐带和其他组织，其可为同源或异源的。特别是，本发明的第三方面涉及用于治疗神经系统变性疾病和/或治疗自身免疫性疾病的细胞产物。特别是，其涉及疾病像多发性硬化、i型和ii型糖尿病、类风湿性关节炎、心肌梗塞和缺血性中风的治疗。

本发明的第四方面涉及包含本发明第二或第三方面细胞产物的药用制剂。

附图简述

当考虑以下其详述时将更好地理解本发明，并且除了上述那些之外的目的将变得显而易见。该描述参考附图，其中：

图1和2涉及类风湿性关节炎的小鼠模型，特别是

图1显示通过给予各种量的本发明示例性实施方案的细胞产物处理的3组小鼠以及未处理组和健康对照组的足迹分析结果；

图2显示给予本发明示例性实施方案的细胞产物之后雌性小鼠组临床症状的变化。

图3涉及i型糖尿病的小鼠模型，并且显示处理和未处理两组小鼠以及健康对照组的分析结果，特别是

图3.1显示血糖(血糖水平)；

图3.2显示糖化血红蛋白作为前3个月平均血糖水平的标记物；

图4涉及ii型糖尿病的小鼠模型，特别是

图4显示处理和未处理两组雌性小鼠以及健康对照组的血糖(血糖水平)分析结果；

图5涉及缺血性中风的小鼠模型，特别是

图5.1和图5.2分别显示与未处理组iii相比较，两个处理组iia和iic中神经功能缺损的分析结果。

图6涉及心肌梗塞的小鼠模型，特别是

图6显示如通过心脏中的胶原蛋白含量测量的处理和未处理两组小鼠以及健康对照组雄性小鼠的梗塞后心脏疤痕的表面积大小。

图7涉及多发性硬化的小鼠模型。图7.1-7.5显示根据实施例1获得并在给予eae小鼠之前经和不经体外培养进行体外扩增测试的不同细胞群治疗活性的存在或不存在，特别是

图7.1显示新鲜获得的级分c的效果，其为包含源自骨髓并耗尽造血细胞的细胞产物的本发明示例性实施方案的干细胞；

图7.2显示新获得的级分d的效果，其为包含由耗尽柱保留并随后洗脱的所选造血细胞的级分，

图7.3显示新鲜获得的级分a的效果，其为全骨髓，即原始细胞群，

图7.4显示体外培养的级分a(全骨髓)的效果，

图7.5显示体外培养的级分c(包含耗尽造血细胞的细胞产物的本发明示例性实施方案的干细胞)的效果，

图8-10涉及用3名向其转移了示例性实施方案细胞产物的示例性ms患者获得的临床数据。呈现3个时间点的数据：将细胞产物转移至患者之前不久(tr)以及此后12和24个月。

图8.1.a、8.2.a和8.3.a显示3名患者中的每一名所选特征性斑块的大小变化。

图8.1.b、8.2.b和8.3.b显示3名患者中的每一名在相应时间点的edss评分。

图9涉及在3名ms患者的上肢(图9.1)和下肢(图9.2)通过用示例性实施方案的细胞产物处理的平均效果。

图10显示3名ms患者血流中的免疫球蛋白水平与正常水平的上限和下限水平相比较的平均值。

用于实施本发明的方式

尽管显示并描述了目前优选的本发明实施方案，但应明确地理解本发明不限于此，而是可在以下权利要求的范围内以其他方式进行各种实施和实践。

构成原始细胞群的捐献自体或异源组织为用于本发明第一方面离体方法的起始材料。从供体获得组织的方法为已知的，并且不是本发明当前离体方法的主题。形成原始细胞群的去除组织通常以包含市售缓冲液(特别是基于pbs(磷酸盐缓冲盐水))的溶液获得，其可进一步包含例如抗凝剂和/或稳定剂。这种缓冲溶液本领域常用，并且例如存在于用于回收血液、骨髓或另一种组织的标准无菌袋中。

组织去除随后制备细胞产物和细胞产物治疗应用之间的持续时间可优选地保持很短。特别是，在细胞产物没有显著丧失治疗活性的情况下，组织去除和细胞产物治疗应用之间的时间可持续长达7或9天，但优选地保持低于72小时、48小时、36或24小时，温度在4℃-8℃之间或低于6℃或低于5℃，并且另外组织优选地保持在黑暗中。这些条件优选地在细胞群的整个离体处理期间应用。在最终产品观察到的细胞活力为至少80%，并且极罕见情况下甚至高于90%或95%。重要的是，最终细胞产物的这种细胞活力保持在相同水平至少24小时，并然后在随后的9天期间，特别是当细胞产物储存在黑暗中和温度为4-8℃下，仅逐渐降低至至少80%的水平。因此，有利地可在时间和组织去除两方面彼此分开，离体处理包括体外耗尽和治疗应用。一些用于储存细胞的缓冲液也使得能够储存于室温(19℃-25℃)下。

由原始细胞悬浮液产生的细胞悬浮液中细胞群的细胞数量和组成沿着该方法的步骤从原始细胞群到最终治疗活性细胞产物逐渐变化。例如通过facs(荧光活化细胞分选)，使用市售设备、荧光抗体和试剂盒，比如可得自miltenyibiotec的msc表型分析试剂盒或类似的市售产品，可分析在方法进展期间产生的悬浮液中细胞群的细胞总数以及各种细胞类型的细胞数量。可选择以下中的一些或全部以及其他表面抗原来监测该方法期间细胞悬浮液中不同细胞类型的分布：ssea-4、cd135、cd166、cd146、icam-1、cd11b、cd15、cd19、cd14、cd45、cd44、cd45ro、cd45ra、cd71、cd90、cd73、cd106、cd117、cd105、cd34、cd133、cd10。可添加其他标记物，例如用于监测细胞产物中期望细胞类型的细胞类型或用于免疫耗尽的其他表面抗原。

显然，除有意去除和免疫耗尽之外，在该方法的步骤期间还发生非特异性细胞丢失，导致细胞总数减少。因此，这种丢失还影响某些细胞类型的相对耗尽或富集程度。例如，洗涤和/或挑选程序期间的溶血助于期望的红细胞耗尽，和塑料粘附可助于不期望的间充质干细胞丢失。

例如通过使细胞群通过50μm-300μm滤器或网孔细胞滤网，特别是通过70μm或80μm或90μm或100μm-150μm滤器或网孔细胞滤网或通过200μm滤器或网孔细胞滤网，可挑选原始细胞群，产生原始单细胞悬浮液和/或可洗涤原始细胞群以去除存在于获得组织样品中的死亡细胞、细胞碎片和其他材料。在任选过滤之后，可通过温和离心，例如在300g-600g，特别是在300g-400g下10-20分钟，并重悬浮于合适的缓冲液中，将原始细胞群转化成洗涤的悬浮液。比如通过去除附聚成块的细胞或例如去除红细胞和/或血小板，这种洗涤和过滤可能涉及细胞的大量丢失。特别是取决于洗涤条件和组织来源，例如组织捐献中包含的20%-60%的细胞可能丢失。

在一些实施方案中，洗涤和/或过滤的单细胞悬浮液可直接经受免疫标记程序。在一些实施方案中，获得的组织也可分级，例如通过密度分级、例如通过在免疫耗尽之前基于ficoll或基于ficoll梯度分层，尽管优选地避免这种另外步骤。

体外免疫耗尽原始或洗涤和/或挑选的细胞悬浮液可使用几种不同抗体实施，其中特别是每种抗体对所选表面抗原组的表面抗原之一具有特异性。本文使用的术语抗体包括各种类型的免疫球蛋白，比如iga、igg、igg1、igg2或igm以及抗体和抗体衍生物(比如与可检测标签缀合例如经生物素/链霉亲和素或经二抗与标签缀合的抗体)的抗原结合片段。常用标签包括荧光团、金和磁性粒子。与可检测标签缀合的各种特异性抗体可市售得到并且适合于多种免疫耗尽程序。

免疫耗尽包括用特异性抗体标记表达一种或多种所选表面抗原的细胞的免疫标记程序和用于在单独步骤从原始细胞群去除免疫标记细胞的分离程序和/或几种特异性抗体可在一个或多个步骤组合中组合。

在一些实施方案中，免疫标记包括免疫磁性标记程序，其中抗体与磁珠缀合和其中在用于耗尽免疫磁性标记细胞的分离程序中使用磁分离装置。这种方法在本领域得到描述，并且相应的试剂和设备可市售得到(例如来自miltenyibiotec的clinimacs®试剂)。用于大多数单克隆抗体的间接方法在去除表达特定所选表面抗原的相应所选细胞方面更有效，因为没有磁性粒子的抗体比与磁性粒子缀合的抗体更有效地在细胞表面发现其抗原靶标。直接方法通常比间接方法更快。间接和直接两种标记程序均可在随后或步骤组合中的一个免疫耗尽程序内实施。

在免疫标记的这些和其他实施方案的一些中，可将细胞群在直接免疫标记程序中与缀合抗体一起温育，其中标记程序中使用的表面抗原特异性抗体在标记程序之前与标签缀合或可如此市售得到。用标签缀合抗体标记的生成的所选细胞直接准备用于分离程序。

或者或与包含一种或多种直接标记程序的实施方案组合，可实施一种或多种间接免疫标记程序。在间接标记程序中，根据本领域已知程序将细胞群首先与一抗一起温育，并随后与二抗或与包含标签的另一种缀合试剂一起温育并与一抗结合。特别是，一抗可为生物素化抗体，其通过链霉亲和素或通过与标签(比如荧光团或磁珠)偶联的二级抗生物素抗体缀合。

优选地，在温育细胞悬浮液以使一种或多种一级特异性抗体与所选表面抗原结合之后，洗涤细胞悬浮液以去除过量未结合的一抗，例如通过离心和重悬浮。然后将重悬浮的细胞群与试剂一起温育以使标签附着于一抗。

在这些和其他实施方案的一些中，对所选表面抗原特异性的抗体可与细胞悬浮液以单独步骤一起温育，每种或几种表面抗原特异性抗体，特别是少于10种或少于6种不同抗体，或者更特别地最多2种或最多3种或最多4种或最多5种不同抗体，可组合作为抗体混合物用于同时与细胞悬浮液温育。标签缀合抗体和非缀合抗体和/或标签可单独或以步骤组合温育。免疫标记程序的一些实施方案包含最多6个，特别是最多3个或最多2个温育步骤。

在一些实施方案中，细胞群中抗体/细胞数量的比率，特别是用于直接和/或间接标记程序的市售试剂，可与标准温育条件一起使用，例如针对单个抗体以及合并成抗体混合物的单个抗体由制造商比如miltenyibiotec、bdbiosciences和其他供应商规定的条件。

如果使用非市售抗体进行免疫耗尽，则可根据本领域已知的技术滴定用于与细胞悬浮液一起温育的最适抗体浓度。简而言之，将稀释系列的不同数量标签缀合或未缀合的一级表面抗原特异性抗体与固定数量的细胞一起温育。使用合适的检测系统比如facs(荧光活化细胞分选)确定抗体量/细胞数量的最佳比率，其中尽可能多的表达特异性表面抗原的细胞用标签标记，并且同时尽可能少的没有特异性表面抗原的细胞通过标记抗体与细胞表面的非特异性缔合来标记。

类似地，当在未缀合的一抗与细胞表面抗原结合之后使用间接标记时，可滴定用于与细胞悬浮液一起温育的标签(比如荧光团或磁珠)的量，以在结合的最大标签量/可用一抗和标签与细胞的最小非特异性缔合之间进行优化。

术语标准温育条件本文用于该方法免疫标记期间的温育条件，其例如对应于制造商使用免疫耗尽试剂的规格要求。这种试剂为例如单克隆抗体(包括抗体衍生物，特别是生物素化衍生物)和标签(比如荧光团或磁珠)缀合的衍生物。术语标准温育条件本文也用于针对特异性结合的抗体对所选表面抗原的相应抗原结合位点达最大饱和度，同时保持抗体与缺乏特定所选表面抗原的细胞以相当低的水平非特异性结合进行优化的条件。特别是，抗体或标签的合理水平的非特异性缔合可共计低于抗体与表达相应表面抗原的细胞的特异性结合水平的30%，特别是低于20%或低于10%或低于5%或低于2%。可以预计如制造商针对一些实施方案规定的标准条件，针对特异性结合的抗体对所选表面抗原的相应抗原结合位点达最大饱和度，同时保持抗体与缺乏特定所选表面抗原的细胞以低水平(比如以上指定的低于30%的水平)非特异性结合进行优化。

在一些实施方案中，标准温育条件包括免疫标记步骤中存在的每种抗体每100ml+/-10ml温育体积0.1-2.5mg抗体，特别是0.25-0.75mg，更特别地为每100ml+/-10ml温育体积0.5mg抗体的抗体浓度。在这些和其他实施方案的一些中，经受免疫耗尽的细胞数量，并且特别是在与针对所选抗原的抗体一起温育期间存在的细胞数量不超过10¹⁰个细胞或不超过5x10⁹或3x10⁹或2x10⁹或1.5x10⁹或1.2x10⁹或1.0x10⁹个细胞。特别是，与针对所选抗原的抗体一起温育期间存在的细胞在100ml+/-10ml温育体积中10⁵-10¹⁰个细胞的范围内，或者特别是在100ml+/-10ml温育体积中10⁷-5x10⁹个细胞或3x10⁷-2x10⁹个细胞的范围内。

在提供细胞产物的方法的一些实施方案中，实施至少一个免疫耗尽步骤，其中耗尽程度有限(即在限制条件，特别是包括免疫标记的限制性温育条件和/或限制性分离条件下)。限制性温育条件实现了每个细胞表达相对大量所选抗原表面标记物的原始细胞群细胞以比每个细胞表达相对少量所选表面抗原的细胞更高的效率从原始细胞群耗尽。这可例如通过减少抗体与表面抗原之间或抗体与标签之间形成的键数，例如通过降低标记所选表面抗原的效率实现。特别是通过在一定条件下实施与抗体或标签一起温育可降低标记效率，所述条件与标准温育条件下形成的结合对数量相比较仅使得标签缀合抗体或一抗和表面抗原之间或标签缀合试剂(比如链霉亲和素包被的磁珠)或标签缀合二抗和一抗之间形成较少数量的结合对。

在用磁珠作为标签的示例性实施方案中，例如由于在使用市售试剂时相对于制造商规格要求或相对于从滴定曲线获得的最佳条件(以磁珠与细胞可接受水平的非特异性结合确定磁珠与一抗最大结合的条件)降低温育温度、温育时间或磁珠浓度，可能会降低标记效率。在一些实施方案中，可同时应用多于一项这些措施。

在该方法的这些和其他实施方案的一些中，调整限制性温育条件以使得原始细胞群细胞上的cd34或cd133或cd117抗原结合位点，特别是cd34抗原结合位点仅被相应抗体部分饱和。

在本发明方法的这些和其他实施方案的一些中，体外免疫耗尽包括其以至少两个阶段实施的免疫标记程序：在第一阶段，细胞用针对所选表面抗原的抗体(除针对cd34、cd133或cd117表面抗原中的一种或多种，特别是针对cd34表面抗原的抗体以外)标记，和在第一阶段之后实施的第二阶段，细胞用针对第一阶段有意排除的表面抗原(即针对cd34、cd133或cd117表面抗原中的一种或多种，特别是针对cd34表面抗原)的抗体和任选地用针对其他所选抗原的抗体标记。第一和第二两个阶段均可包括一个或多个温育步骤，用于在单独温育步骤分别用单个抗体免疫标记细胞，或者用于在相同温育步骤用包含几种用于标记几种所选表面抗原的抗体的抗体混合物免疫标记细胞。此外，第一和第二两个阶段均可包括直接和/或间接免疫标记。在这些和其他实施方案的一些中，第一阶段包括间接免疫标记程序的第一步或由其组成和/或第二阶段包括间接免疫标记的第二步与在相同温育步骤用针对cd34、cd133或cd117表面抗原中一种或多种的标签缀合抗体直接免疫标记的组合或由其组成。

同时与包含几种用于标记两种或几种，特别是3或4种所选表面抗原的抗体混合物一起温育特别优选，因为这加速体外耗尽程序。这转而增强免疫耗尽之后细胞产物的生理和治疗特性，特别是在细胞群的组成和细胞活力方面。

在这些和其他实施方案的一些中，在第一阶段所选抗原包含cd14、cd45和至少一种其他cd45家族成员，特别是cd45ra和/或cd45ro，和其中在第二阶段所选抗原为cd34。在这些和其他实施方案的一些中，特别是通过将两个阶段或者特别是第二阶段的温育体积增加1.5-4倍，特别是2-3倍来调整条件以限制标记程度，并因此还限制耗尽程度。

在免疫标记的第一阶段缺乏针对cd34、cd133或cd117的抗体并且特别是通过在第二阶段用缓冲液体积(其大于制造商规定的标准体积)中的抗cd34、cd133或cd117抗体温育细胞，导致特别是cd34阳性细胞的部分耗尽。这导致表达cd34和cd133两者的细胞部分增加，cd34和cd133已知待由多潜能干细胞并因此由细胞产物中期望的细胞表达。

特别是已经观察到，当用与磁性标签偶联的抗cd34抗体对细胞进行第二标记步骤的体积增加2倍时细胞产物相对于原始细胞群中cd34阳性细胞部分的百分比率(%c/a比率)增加5-15%，特别是8-10%，并且如果体积增加4倍则其增加25-40%，特别是30-35%。

在这些和其他实施方案中的一些中，使用间接免疫标记生物素化一抗，其通过例如标签缀合的二抗或例如链霉亲和素连接的标签，像链霉亲和素包被的磁性粒子与标签缀合。

在这些和其他实施方案的一些中，免疫磁性标记可包括以下步骤a、b和c，它们不一定是在彼此之后立即实施；

在免疫[-磁性]标记的步骤a，使细胞与包含针对多于一种表面抗原的生物素化抗体的混合物一起温育，

在步骤a，应用温育条件以使得至少部分所选表面抗原饱和度最大化，同时使抗体与细胞的非特异性结合最小化；在步骤a之后通过离心去除过量未结合的抗体，随后重悬浮细胞；

在免疫磁性标记的步骤b，使细胞与包含针对表面抗原的生物素化抗体的混合物一起温育，

在步骤b，限制性温育条件仅使得至少一种表面抗原部分饱和；通过离心去除过量未结合的抗体，随后在步骤b之后重悬浮细胞；

在免疫磁性标记的步骤c，用与磁性粒子缀合的抗生物素抗体标记细胞群，

在步骤c，限制性温育条件仅使得抗原生物素结合位点被二级抗生物素抗体部分饱和；通过离心去除过量未结合的抗体，随后在步骤c之后重悬浮细胞。

在一些实施方案中，可组合免疫磁性标记的步骤b和c。在这种步骤组合b/c(其也可仅称为步骤b)，使细胞群与缀合于磁性粒子的抗生物素抗体和与缀合于磁性粒子并针对至少一种所选表面抗原的抗体在相同的温育步骤期间一起温育，随后为一步在步骤组合b/c之后通过离心和重悬浮细胞去除过量未结合的抗体。

在分别于步骤a-c或a和b之后应用的分离程序，去除用至少两种或至少3种或至少4种结合的磁性粒子标记的细胞。

抗体的示例性组合已在实验中描述。其包括例如如在以上步骤a中用作一抗的抗cd14和抗cd45家族抗体、和例如步骤b中使用的与磁珠缀合的抗cd34抗体、和例如步骤c中使用的与磁珠缀合的抗生物素抗体，其中步骤b和步骤c可任选地组合成一个步骤。

在包括免疫磁性耗尽的这些和其他实施方案的一些中，可限制分离条件，使得具有少于2个或3个或4个结合的磁性粒子的标记细胞不被磁分离装置去除。可测量去除磁性标记细胞的效率，例如通过使用具有可调磁场强度的电磁分离装置或通过增加细胞悬浮液到磁性装置的距离，导致施加在磁性标记细胞上的较低磁场达到期望水平。

在包括具有限制条件的免疫耗尽步骤的这些和其他实施方案的一些中，通过降低抗体和抗原之间的接触效率或通过减少抗体和抗原之间的结合概率来实现抗原结合位点的部分饱和。这可例如通过选择以下条件中的一个或组合实施：

-通过将温育体积增加1.5-4倍，特别是增加2倍；

-通过减少温育时间；

-通过适应温育温度；

-通过适应温育期间使用的旋转器或振动器的运行条件，例如运行速度；

-通过降低抗体量与细胞数量的比率。

在本发明方法的这些和其他实施方案的一些中，细胞产物中表达所选表面抗原组的至少一种表面抗原，特别是造血细胞特征性的所选表面抗原的所选细胞部分，与原始细胞群相比较，减少到至多1/2、1/3、1/5、1/10、1/50或1/100，并且其中所选造血表面抗原组包括cd14、cd19、cd34、cd45家族和icam-1。

在一些实施方案中，特别是耗尽其为“双阳性”，即表达两种所选表面抗原比如cd45+/cd34+、cd45+/cd45ra+、cd45+/cd45ro+或cd45+/cd14+的细胞部分，其绝对耗尽程度低于0.2，特别是低于0.1或0.05或0.02或0.01，对应于绝对耗尽因子超过5、10、20、50或100倍。

在这些和其他实施方案的一些中，细胞产物中表达非造血干细胞和祖细胞特征性的，特别是多效能干细胞、多潜能干细胞或者特别是间充质干细胞特征性的表面抗原组中至少一种的细胞部分，与原始细胞群相比较，增加至少2倍，或者至少3、5、10或100倍。非造血表面抗原并且特别是间充质干细胞抗原组包括例如ssea-4、cd90、cd133、cd71、cd73、cd105和cd106。

对于特定细胞类型特征性的表面抗原为本领域已知的。这方面的一些信息在本文以及一些所包含的参考文献中提供。还可从互联网、科学文献和商业机构检索进一步的相应信息，以适用于关于例如供体组织或治疗应用更新成当前知识或调整至特定应用。

本发明的第二方面涉及可通过本发明第一方面的方法获得的细胞产物。以上描述了细胞产物的有利特性，特别是令人惊讶的治疗活性。

作为治疗活性细胞产物获得的细胞群可进一步洗涤、纯化和制备，以用作本发明第三方面的药用组合物。在一些实施方案中，在给予之前，优选地如在没有体外培养的情况下耗尽之后获得的细胞产物(见下文)可悬浮于生理等渗溶液中，其可选择为特别适合于预期的治疗给予，比如全身静脉内给予、腰椎穿刺、直接注射到特定器官或在手术程序期间给予。

细胞产物可例如悬浮于包含0.5%人血清白蛋白的pbs/edta缓冲液中。对于从约50ml骨髓获得的细胞产物，缓冲至例如最终体积约150ml证明是合适的。然而，该浓度可依细胞产物中的实际细胞数量而定进行调整。在将作为药用组合物的细胞产物转移至患者(例如通过全身静脉内给予)之前不久，细胞浓度可用0.9%盐水溶液稀释至不大于约10⁶个细胞/ml的浓度，稀释至例如0.1-5x10⁶个细胞/ml或者特别是0.5-1.5x10⁶个细胞/ml。在一些实施方案中，给予1-10x10⁶个细胞/kg患者体重之间，或者特别是2-6x10⁶之间或2-8x10⁶之间。在特定实施方案中，例如通过静脉输注给予多达2x10⁶个细胞或2-4x10⁶个细胞或4-6x10⁶个细胞/kg体重。

在一些实施方案中，细胞产物的治疗活性细胞为骨髓来源的，特别是髂骨来源的自体非造血干细胞。在细胞产物制备过程期间，提取的骨髓仅经历非实质性的体外操纵，比如过滤、洗涤/离心和通过耗尽造血细胞和任选地其他细胞进行细胞分离。此外，在耗尽造血细胞之后，优选地将细胞产物转移至患者而没有先前进行体外扩增。细胞产物中获得的细胞数量通常是足够的，尽管其可特别是依组织来源和供体而定变化。

所述用于本发明第三方面医疗用途的细胞产物可通过不同给予方式使用和用于许多不同医学指征，特别是用于再生缺失或受损组织，并且特别是用于治疗神经系统变性疾病和/或治疗自身免疫性疾病，并且特别是用于治疗多发性硬化、i型和ii型糖尿病、类风湿性关节炎、心肌梗塞和缺血性中风。

实施例

部分a：小鼠实验

用小鼠实施一组初步实验。利用该初步实验组，最初开发和测试了在尽可能生理的状态和细胞环境下提供包含非造血干细胞和祖细胞的治疗活性细胞产物的方法概念。注意尽可能温和地实施所有离体步骤(包括体外耗尽造血细胞)，以最小化对原始细胞群中存在的少量脆弱非造血干细胞和祖细胞的损伤或丢失，和进一步最小化那些细胞对离体环境的非生理适应。希望获得足够大数量的生理健康的非造血干细胞和祖细胞，以避免细胞产物在治疗给予之前发生体外扩增，以提供治疗活性。

实施例1为用于提供含有鼠骨髓组织探针的细胞产物方法的示例性实施方案。在实施例2-7中，在几种鼠疾病模型测试了所获得细胞产物的治疗活性。对于每种疾病，必须处死大量小鼠(约100-250只)以获得足够的合并骨髓，后者经受离体方法的示例性实施方案。随后将由此获得的细胞产物用可变量的细胞产物静脉内给予受相同疾病影响的小鼠组。通过对以下模型疾病的既定测试来分析细胞产物的治疗活性。所有动物实验均得到当地生物伦理委员会的许可。这些小鼠实验的结果被提交给欧洲药品管理局，在此基础上其批准了部分b中所述的临床研究许可。

实施例1：从鼠组织提供治疗活性细胞产物

本领域众所周知的事实是，人和鼠细胞的细胞表面抗原谱不完全对应(例如phinneyandsensebé.2013)。因此，与人体组织相比较，对于鼠组织，不同的所选表面抗原组适合于通过体外耗尽和回收细胞产物中的非造血干细胞和祖细胞来去除造血细胞，这限制了鼠实验对人类的适用性。

然而，在用鼠和人体组织提供细胞产物的方法中，离体组织体外处理的基本步骤是相同的。用鼠组织实施的方法的示例性实施方案可包括以下步骤，如这里实施例1中所用：

-过滤从小鼠获得的离体骨髓；

-纯化离体骨髓(洗涤/离心)；

-用生物素化单克隆抗体(针对所选细胞表面抗原)进行第一标记步骤；

-通过离心和重悬浮去除未结合的抗体；

-用与超顺磁性右旋糖酐铁粒子缀合的抗生物素抗体和任选地与超顺磁性右旋糖酐铁粒子缀合的其他抗体(所述抗体与一种或多种其他细胞表面抗原特异性结合)进行第二标记步骤；

-通过离心和重悬浮细胞去除未结合的抗体；

-使用例如miltenyibiotec的clinimacs磁分离装置耗尽标记细胞(收集的阴性级分作为最终产物)。

在其他示例性实施方案中，免疫标记步骤的数目可以不同，并且特别是其可包括例如1或2或3或4个免疫标记步骤，和该方法可包括直接或间接免疫磁性标记或两者。

在实施例1中，选择本发明人选择的用于从鼠骨髓免疫耗尽造血细胞的细胞表面抗原，特别是由于其在抗原后面列出的基于细胞类型的特征性表达：

-cd5：t淋巴细胞、b淋巴细胞亚群；

-cd45r(b220)：和成熟b淋巴细胞的前体；

-cd11b：粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、nk细胞、b-1淋巴细胞；

-ly-6g(gr-1)：和成熟粒细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞的前体；

-7-4，ter-119：和成熟红细胞的前体；

-sca-1-(ly6a/eorly6d)：未成熟的造血祖细胞和造血干细胞。

-cd14-巨噬细胞、树突状细胞、库普弗细胞、肝细胞和粒细胞。

在该示例性实施方案中使用的抗体和更多抗体可从许多商业供应商处市售得到(参见例如http://www.antibodyresource.com/onlinecomp.html)。而且，用于免疫磁性耗尽的缓冲液、试剂和设备可例如从miltenyibiotec和其他供应商处市售得到。在进一步的示例性实施方案中，依所研究的特定疾病模型而定，针对另外或备选表面抗原的抗体可用于耗尽或部分耗尽造血干细胞和/或其他抗原。

在这些和其他实施方案中，可选择igg2亚家族的单克隆抗体，特别是针对cd45家族抗原(比如高度糖基化的cd45ra)的抗体，因为与igg1子类的抗体相比较，子类igg2的抗体呈现出与多糖的结合增强。

在这些和其他示例性实施方案中，所选抗原组中抗原的选择可适应于原始细胞群的细胞组成，并根据细胞表面抗原表达和细胞类型之间的已知相关性来实现从原始细胞群选择性去除造血细胞和任选地其他细胞类型。

用于从小鼠骨髓提供治疗活性细胞产物的方法的示例性实施方案的详述。

1.从小鼠分离骨髓作为起始材料，用于提供治疗活性细胞产物的方法的示例性实施方案：

从已在无菌条件和4°-8℃下处理以诱导特定模型疾病的适当品系小鼠和相同品系健康对照小鼠的股骨和胫骨获得骨髓，包括以下步骤：

-切断股骨和胫骨基部并用pbs(不含ca²⁺、mg²⁺)清洗骨髓腔。

-使分离和合并的骨髓悬浮于pbs(不含ca²⁺、mg²⁺)中，并通过网孔大小为40-70μm的尼龙滤器且标记为级分a。

-离心细胞悬浮液(400g，10分钟，室温)并弃去上清液。

-使细胞沉淀悬浮并在红细胞裂解缓冲液(5ml红细胞裂解缓冲液：150mmnh4cl.10mmkhco3.0.1mmna2edta.ph7.2)中温育5分钟。通过添加pbs(不含ca²⁺、mg²⁺)来终止裂解。

-离心细胞悬浮液(400xg，10分钟，室温)。

-将细胞沉淀重悬浮于pbs(不含ca²⁺、mg²⁺)中，然后通过网孔大小为40-70μm的尼龙滤器。

-离心细胞悬浮液(400g，10分钟，室温)，重悬浮于pbs(不含ca²⁺、mg²⁺)中并测定细胞总数。

2.从原始细胞群体外免疫磁性耗尽造血细胞：

除离心步骤任选地在4℃-室温之间的温度下实施以外，整个过程在无菌层流罩室中实施，并且所有与骨髓细胞处理相关的步骤均在无菌条件下于冰上和4°-8℃下实施。

-测定经受以下步骤的骨髓细胞总数。

-离心细胞悬浮液(400xg，10分钟，室温)并弃去上清液。

-使细胞悬浮于缓冲液b的体积a中，其中调整体积a使得在加入抗体混合物之后获得每1x10e7个细胞40μl的总温育体积，和其中缓冲液b为不含ca²⁺和mg²⁺的pbs、2mmedta、0.5%bsa。

2.1用生物素化单克隆抗体实施免疫-[磁性-]-标记的第一步：

-每1x10e7个总细胞加入10μl1号抗体混合物

其中1号抗体混合物每种以用于提供过量抗体的浓度含有cd5、cd45r(b220)、cd11b、anti-gr-1(ly-6g/c)、7-4、ter-119，

其浓度为被设计用于提供过量抗体的制造商推荐用于免疫耗尽的浓度。加入10μl(=与1号混合物相同的体积)含有针对cd14(igg1)、cd45(igg1)、cd45ra(igg2)的单克隆抗体(每种浓度为1mg/ml)的2号抗体混合物。

-将悬浮液充分混合并在4-8℃下和黑暗中温育10-15分钟。

-通过每1x10e7个细胞加入1-2ml缓冲液b来终止温育。如果细胞数量低(1x10e7或更低)，则仅加入2ml缓冲液b。离心细胞悬浮液(400g，10分钟，室温)。

-使细胞悬浮于每1x10e7个总细胞30μl缓冲液b中。如果细胞数量低(即1x10e7或更低)，则加入30μl-60μl缓冲液b。

2.2用与右旋糖酐铁微珠缀合的抗生物素抗体实施免疫磁性标记的第二步：

-加入20μl含有抗生物素抗体的3号抗体混合物，其浓度为每1x10e7个细胞制造商推荐用于免疫耗尽的浓度。如果细胞数量低(1x10e7或更低)，则仅加入20μl3号抗体混合物。

-将悬浮液充分混合并在4-8℃下和黑暗中温育10-15分钟。

-每1x10e7个总细胞加入1-2ml缓冲液b以终止与抗体的温育过程。如果细胞数量低(1x10e7或更低)，则仅加入2ml缓冲液b并标记为级分b。

2.3免疫磁性标记细胞的磁性分离

-离心(400xg，10分钟，室温)并弃去上清液。

-向沉淀中每1x10e7个总细胞加入50μl缓冲液b，使样品准备用于磁性分离。如果细胞数量低(1x10e7或更低)，则加入50μl-100μl缓冲液b。

-将柱ls(miltenyibiotec目录号130-042-401)置于磁性分离器中并用3ml缓冲液b冲洗。作为磁性分离器，使用与ls柱适配器目录号130-090-282组合的例如midimacs™分离器目录号130-042-301或quadromacs™分离器目录号130-091-051或variomacs™分离器。

-在3ml缓冲液b跑过柱之后，将细胞悬浮液施用于柱上。

-然后柱每次用3ml缓冲液洗涤3次。

-将通过柱的细胞收集在新管中并命名为级分c，即在实施例2-7的后续治疗实验中用于静脉转移的阴性级分。

-保留在柱中的细胞从磁场外的柱中洗脱并收集在单独的管中。该级分命名为d并代表磁性标记的造血谱系阳性细胞。

测试细胞产物中细胞群的造血细胞去除、非造血干细胞存在和细胞活力(数据未显示)。

3.概述用于离体提供的小鼠和细胞产物治疗活性的体内测试

在实施例2-7中，测试了根据实施例1获得的细胞产物其在几种鼠疾病模型的治疗活性。通过在合适的小鼠品系建立的处理诱导所选模型疾病类风湿性关节炎(ra)、1型糖尿病(db1)、2型糖尿病(db2)、缺血性中风(is)和心肌梗塞(mi)及实验性自身免疫性脑炎(eae)作为多发性硬化(ms)模型疾病。将从患病小鼠的合并骨髓以离体方法获得的细胞产物随后用以下表1的可变量的细胞产物(每只小鼠1-5x10⁶个细胞)静脉内给予受相同疾病影响的小鼠组。通过针对每种模型疾病建立的测试来分析细胞产物的治疗活性。

*除类风湿性关节炎2.5x10⁶个细胞/小鼠以外

**除类风湿性关节炎3.5x10⁶个细胞/小鼠以外

***除eae2.0x10⁶个细胞/小鼠以外

实施例2：类风湿性关节炎

在实施例2中，以小鼠类风湿性关节炎的实验模型体内测试了根据实施例1制备的细胞产物的治疗活性。

通过在距离基部1.5-2cm处的尾部以50μl体积的剂量皮下给予小鸡ii型胶原蛋白(2-4mg/ml)和完全弗氏佐剂(1mg/ml结核分枝杆菌)的乳液，在10-11周龄品系dba/1的两种性别小鼠，诱导如simonp.brooks&stephenb.dunnett.naturereviewsneuroscience10.519-529(2009年7月)中所述的类风湿性关节炎(ra)实验模型。在第一次免疫之后第21天给予加强剂量，其包含具有弗氏不完全佐剂的鸡ii型胶原蛋白(2-4mg/ml)，并且剂量体积为50μl。

3组(iia、iib、iic组)每组26只患病小鼠在第一次ii型胶原蛋白给予之后30-35天(因此15-16周龄)用实施例1中获得的细胞产物处理：

iia组-(1×10⁶个细胞/小鼠)

iib组-(2.5×10⁶个细胞/小鼠)

iic组-(3.5×10⁶个细胞/小鼠)。

另外，对其中诱导了ra的26只小鼠的对照组iii未处理，并且随后根据相同的诊断参数与ii组处理小鼠一起评估了28只相同品系和年龄的其中未诱导类风湿性关节炎疾病的健康小鼠的另一个对照组iv。

基于类风湿性关节炎的体内小鼠模型评估了以下诊断参数：ii型胶原蛋白的c-末端端肽(ctxii)、基质金属蛋白酶3型(mmp-3)、软骨寡聚基质蛋白(comp)及igg1和igg2a免疫球蛋白(数据未显示)。

此外，如图1所示，如simonp.brooks&stephenb.dunnett(naturereviewsneuroscience10.519-529.july2009)中所述实施足迹分析，以评价处理和未处理两者小鼠ra疾病的存在和病程，并与上述ii、iii和iv组的健康对照进行比较。y轴显示由小鼠产生足迹的自动测量面积(以像素为单位)，其后爪的前脚底在走过狭窄实验走廊时浸入墨水中。x轴显示以周为单位的观察时间。0-时间点表示以表1的量(每只小鼠的细胞数量)给予iia、iib和iic组小鼠细胞产物。在开始治疗之前两周开始通过给予细胞产物收集数据，其对应于用ii型胶原蛋白加强注射的给予时间点。

如图1所示，健康对照小鼠(组iv)产生的足迹面积在约1800-2600像素范围内，而其中诱导疾病的小鼠在未经处理和处理两者情况下给予细胞产物之后第一个约11周期间产生约3200-5300像素。

第12周左右，治疗效果在处理组iia、iib、iic清晰可见，足迹面积值下降至低于3000像素和甚至低于2500像素，因此接近健康对照小鼠的评分范围，而未处理小鼠评分值继续为约3600-4100像素。

另外，如brandddetal..collagen-inducedarthritis.natprotoc.2007;2(5):1269-75和seeuwssetal..amultiparameterapproachtomonitordiseaseactivityincollagen-inducedarthritisarthritisresther.2010;12(4):r160所述使用5点量表评价ra的临床症状严重程度，评分为：

0-无症状的疾病；

1-一脚趾发炎和肿胀；

2-多于一个脚趾发炎和肿胀(但不是整个爪子)或整个爪子轻度肿胀；

3-整个爪子发炎和肿胀；

4-包括脚趾、脚和脚踝在内的严重炎症和强直，其症状会阻止小鼠抓住金属丝笼盖。

该分析显示根据表1用实施例1的细胞产物处理之后类风湿性关节炎的临床症状减轻。在图2所示的iic组雌性小鼠获得了最好结果。

此外，在将细胞产物静脉内给予小鼠之前，将根据实施例8获得的细胞产物的细胞用荧光染料染色(pkh26glredsigma-aldrich

https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/sigma/bulletin/mini26bul.pdf)。在观察期的第2和第15周之间几乎每周处死每组的两只小鼠，并追踪在零时间点给予处理小鼠各器官的细胞分布。分离处死小鼠的器官，将组织匀浆化并通过facs鉴定标记的细胞。结果如表2.1所示，列出了观察期间各器官中出现的细胞百分比。

重要的是，该分析表明，包含非造血干细胞和前体细胞的给予细胞群既没有以任何大量迁移至源自供体小鼠的骨髓，也没有迁移至任何其他分析的器官比如淋巴结，直至给予之后第12周。该观察结果与治疗效果一致并且支持在全身给予细胞产物之后，一些转移的非造血祖细胞、多效能和多潜能干细胞比如间充质干细胞迁移至发炎的关节，在那里其减少了对关节组织的自身免疫反应，诱导组织修复，从而引起临床症状的减轻。还认为第13周的骨髓中晚期出现少量(大约少于0.3%)细胞可能与向内源性骨髓间充质细胞的信号传导以促进组织修复相关。此外，第12-第14周左右肝脏少量出现大约0.5-2%的转移细胞与肝脏中转移细胞必要的另外修复活性一致。已知20-25%的类风湿性关节炎患者在肝功能的实验室测试中显示异常，但这些与临床症状的发生或与典型形态变化的存在无关。最常见的图像形态学异常为具有脂肪变性的非特异性反应性肝炎，在60-70%的病例观察到，罕有扩大海湾肝脏。另一种经常发现的异常为结节性再生性增生(参见例如reynoldsw.j..wanlessi.r.:nodularregenerativehyperplasiaoftheliverinapatientwithrheumatoidvasculitis.j.rheumatol.1984.2:838-42)。

表2

实施例3：i型糖尿病

在实施例3中，在小鼠i型糖尿病的实验模型体内测试了根据实施例1制备的细胞产物的治疗活性。

根据以下程序通过腹膜内注射链脲佐菌素诱导体内i型糖尿病模型疾病：

将溶于枸橼酸盐缓冲液(0.1m.ph4.5)的链脲佐菌素(stz)以40mg/kg体重的剂量连续5天腹膜内注射给10-11周龄的两种性别品系c57bl/6小鼠。最大注射体积为200μl。该溶液撤除食物12小时空腹给予，而食物在注射之后恢复。所有动物在整个糖尿病模型的诱导期可自由饮水。(有关进一步信息参见：boone-villavdetal:effectofvaryingdoseandadministrationofstreptozotocinonbloodsugarinmalecd1mice;procwestpharmacolsoc.2011;54:5-9)。

根据表1，将包含干细胞的细胞产物用各种剂量的转移干细胞产物转移至3组小鼠iia、iib和iic。转移之后，使用标准测试条每周一次评估小鼠的血糖和糖化血红蛋白(hba)的血液值。对于患有i型糖尿病小鼠的处理(iia、iib、iic)和未处理(iii)两种组以及健康对照组(iv)的这种分析结果显示在图3.1和3.2中。

高血糖主要通过对β细胞α的直接细胞毒作用而发展，并使δ细胞保持完整，这是胰岛素缺乏的结果而不是胰岛素抵抗的结果。值得注意的是，由化学品比如stz诱导的糖尿病通常不太稳定并且是可逆的。此外，所给予的化学品除其对β细胞的细胞毒作用之外还对其他身体器官产生毒性作用。因此，关于高血糖结果的可变性很高。观察到除与糖尿病状态相关的典型症状比如多食、多饮和多尿之外，用stz处理的小鼠表现出抑郁的精神状态，活动较少。对照小鼠表现出活动正常并且生气勃勃。它们随意饮用水和食物，并且自然增重。

图3.1所示的这些结果表明，与未处理小鼠相比较，细胞转移之后第一周开始处理小鼠的血糖降低，通常在接受最多细胞数量(每只小鼠5x10⁶个细胞)的iic组降低最明显，并且在给予细胞产物之后13周的观察期结束时结果接近正常水平。相比之下，iii组未处理动物的血糖水平在第12周增至约3倍，之后最后未处理的小鼠死亡。

如图3.2所示，糖化血红蛋白的血液水平也在细胞产物转移之后约3周开始下降，并在13周接近iic组的正常水平，而在未处理的iii组动物，糖化血红蛋白水平在12周升高约两倍。糖化血红蛋白(血红蛋白a1c、hba1c、a1c或hb1c)为血红蛋白的一种形式(也参见https://en.wikipedia.org/wiki/glycated_hemoglobin)。正常葡萄糖水平导致正常量的糖化血红蛋白，并且血浆葡萄糖平均量的增加产生糖化血红蛋白部分的可预测增加。糖化血红蛋白的水平用作前3个月平均血糖水平的标记物。在糖尿病，糖化血红蛋白的量较高表明对与心血管病、肾病、神经病和视网膜病相关的血糖水平控制较差。

在将细胞产物静脉内给予小鼠之前细胞产物的细胞用荧光染料染色，并且在观察期的第1和第12周之间的每周处死每组的两只小鼠，并如以上对实施例2所述追踪在零时间点给予处理小鼠各器官的细胞分布。结果如表3所示，列出了观察期间各器官中出现的细胞百分比。

在i.v.转移之后，观察到标记细胞通过所有供血良好器官。

可以看出，在观察期的几周期间，一些标记细胞随着水平增加出现在肾脏。在慢性糖尿病，由于血糖水平高引起肾小球损伤和肾衰竭，因此由于高血糖可发生肾病。这是糖尿病更严重的并发症之一，导致高血压、贫血和水肿。干细胞可防止或修复肾脏损伤。

转移的细胞也迁移至肝脏，其中在观察期的各周内观察到水平增加。由于糖尿病的长期病程，每名糖尿病患者都会因碳水化合物和脂肪代谢紊乱而经历肝脏障碍，表现为肝脏中糖原和脂肪两者过度积累。两者都可导致肝硬化和脂肪变性，并且也可导致胆囊和胆管功能障碍。两种类型的糖尿病(i型和ii型)都会发生肝脏和胆管疾病。此外，糖尿病引起微血管功能障碍，这也可损害肝脏，后者作为最大代谢器官血管供血良好。肝脏中的干细胞可防止肝脏的进行性损伤。

i型糖尿病称为自身免疫性障碍。在观察期开始时淋巴结中转移细胞的出现增加通过减轻自身免疫反应来支持干细胞的治疗效果，导致通过胰岛再生防止糖尿病的进展并且还保护其他器官免于糖尿病并发症。

在静脉转移之后，观察到在观察期开始时或观察期间间歇性地转移细胞归巢至骨髓。骨髓为干细胞的储库，从中它们可根据需要重新定位至外周器官以修复受损组织。

实施例4：ii型糖尿病

在实施例4中，在小鼠ii型糖尿病的实验模型体内测试了根据实施例1制备的细胞产物的治疗活性。

将溶于枸橼酸盐缓冲液(0.05m.ph4.5)的链脲佐菌素(stz)以100mg/kg体重的剂量间隔2天两次给药，通过腹膜内注射给10-11周龄的两种性别品系c57bl/6小鼠实施在小鼠模型诱导ii型糖尿病。给予stz溶液之前15分钟，以240mg/kg体重的剂量腹膜内注射溶于生理盐水中的烟酰胺(na)。最大注射体积为200μl。食物撤除12-16小时之后施用溶液，并在注射之后恢复食物。在ii型糖尿病模型疾病的整个诱导期，小鼠可自由饮水。(有关进一步信息参见例如nakamuratetal:establishmentandpathophysiologicalcharacterizationoftype2diabeticmousemodelproducedbystreptozotocinandnicotinamide.biolpharmbull.2006;29:1167-74)。

根据表1，将干细胞以各种剂量转移至小鼠。检查小鼠的血糖，参见图4，其显示与健康对照小鼠(iv组)相比较，患有ii型糖尿病处理(iia、iib、iic组)和未处理(iii组)雌性小鼠的血糖水平。可以看出，当与未处理小鼠相比较，用干细胞产物处理通常导致血糖降低。应当注意的是，在iib组雌性处理小鼠的情况下，治疗效果最明显-参见临床观察期开始和结束时的血糖水平差异。

此外，在将细胞产物静脉内给予小鼠之前给予的细胞用荧光染料染色，并且在观察期的第1和第10周之间的每周处死每组的两只小鼠，并如以上对实施例2所述追踪在零时间点给予处理小鼠各器官的细胞分布。结果如表3所示，列出了观察期间各器官中出现的细胞百分比。

如以上对i型糖尿病讨论的那样，各器官中标记细胞的外周出现代表细胞在i.v.转移之后通过所有供血良好的器官例如至肝脏和肾脏的循环。它们干细胞可通过免疫抑制提供治疗效果，或提供由于糖尿病损伤的组织(例如在肝脏或肾脏)修复。再次观察到标记细胞的归巢和释放以及胰腺中细胞的出现，其中其可影响胰岛再生以产生生理活性形式的胰岛素。

实施例5：缺血性中风

在实施例5中，在brantd.watsonetal.,annneurol17:497-504,1985所述既定程序的条件下，以小鼠大脑皮层血管中通过光致血栓形成诱导的缺血性中风小鼠模型体内测试根据实施例1制备的细胞产物的治疗活性。

如下所述，使40只雄性和40只雌性11-16周龄的c57bl/6小鼠经受手术和光致血栓形成引起缺血性中风。另外，使20只两种性别的小鼠经受假手术。通过以适当浓度(3-5%)吸入氧气中的异氟烷在麻醉下实施手术。

然后，将每只小鼠置于立体定位装置中，通过皮肤中线的切口暴露颅骨，并且从前囟(franklin和paxinos的立体定位图)解剖约2mm的骨膜。接下来，以超过100mg/kg体重的剂量静脉(尾静脉)给予溶于盐水中的无菌新鲜玫瑰红溶液。然后用绿色激光(infinity0.5h532l-g50b)照射先前制备的颅骨表面，雄性照射60秒，雌性照射45秒。暴露之后闭合伤口。根据表1将这些小鼠分成组ii和组iii。

在假手术程序中，对照组iv中的10只小鼠给予玫瑰红并且未经受照射和对照组iv中的10只小鼠暴露于辐射而没有给予染料。

通过静脉内给予根据实施例1从相同品系c57bl/6小鼠骨髓获得的细胞产物处理表1的iia-iic组小鼠，小鼠还经受手术以在0-时间点处诱导缺血性中风。

如图5.1和5.2所示，继手术之后一周一次对每只动物进行临床评估，为期10周。应用了修改的5点量表(h.haraetal.,journalofcerebralbloodflowandmetabolism199616:605-611)，其中数值1-5对应于以下临床症状：

0-正常运动，没有改变神经信号

1-抬起尾部时弯曲身体和卷曲脚(轻度中风)

2-循环到身体倾斜的一侧，但正常姿势休息(轻度影响)

3-身体在休息时倾斜(中重度中风)

4-缺乏自发性活动(重度中风)

5-死亡

图5.1和图5.2分别显示与未处理组iii相比较，在处理组iia和iic两者根据以上标准分析神经功能缺损的结果。

可以看出，处理组iia和iic两者小鼠的神经症状从1.5-2之间的水平(对应于开始时的中度影响)降低至第8或9周左右的1或低于1的水平，和甚至降低至观察第10周0水平(对应于正常运动和没有改变神经信号)。

此外，在观察期的第3-第10周，处死来自每组的一只雄性和一只雌性小鼠，并追踪在时间点零给予处理小鼠各器官的细胞分布。

表5.1和5.2显示在给予细胞产物之后荧光标记细胞的示踪结果，类似于以上实施例2所述，其中表5.1显示雄性小鼠的结果和表5.2显示雌性小鼠的结果。

有趣的是，该分析表明，在包含非造血干细胞和前体细胞的给予细胞群中非常小的百分比(雄性少于2%和雌性不超过3.1%)出现在源于供体小鼠的骨髓中，而第8周之后，骨髓中基本上没有发现标记细胞(少于0.1%)。该观察结果提示一些给予的细胞最初迁移至骨髓，在那里其诱导骨髓中进一步产生干细胞和祖细胞，促进受损脑组织的再生。类似地，在第5和第7周之间脾脏中出现一小部分给予的细胞，表明细胞从循环中清除。

表5.1

表5.2

对于进一步的信息参见例如

brantd.watson.w.daltondietrich.raulbusto.mitchells.wachtel.myrond.ginsberg:introductionofreproduciblebraininfarctionbyphotochemicallyinitiatedthrombosis.annneurol17:497-504.1985.

h.hara.p.l.huang.n.panahian.m.c.fishman.m.amoskowitz:reducedbrainedemaandinfarctionvolumeinmicelackingtheneuronalisiformofnitricoxidesynthaseaftertransientmcaocclusion.journalofcerebralbloodflowandmetabolism16:605-611.

l.zeng.x.he.j.liu.l.wang.s.weng.y.wang.s.chen.g.-y.yang:differencesofcirculatinginflammatorymarkersbetweenlargeandsmallvesseldiseaseinpatientwithacuteischemicstroke.int.j.med.sci.2013.vol.10(10):1399-1405.

实施例6：心肌梗塞

在实施例6中，以kumarv.etal.,indianj.exp.biol.2009sep;47(9):730-6和brooksw.etal.,comp.med.2009;59(4):339-343所述小鼠心肌梗塞实验模型体内测试根据实施例1制备的细胞产物的治疗活性。

通过以250mg/kg体重的剂量，单次皮下给予溶于无菌0.9%nacl中的异丙肾上腺素(sigma)，在10-11周龄的354只两种性别balb/c小鼠诱导心肌梗塞实验模型。

实验中使用的异丙肾上腺素，4-{1-羟基-2-[(丙-2-基)氨基]乙基}苯-1,2-二醇为β-肾上腺素受体的非选择性激动剂。该化合物会引起心率加快(心动过速)、促进心律失常和加强心脏收缩。

异丙肾上腺素的心脏毒性主要由于：

-缺氧和缺血

-冠状动脉供血不足

-代谢障碍

-细胞内atp储备耗尽

-电解质紊乱

-离子泵功能受损的细胞和ca²⁺的积累

-氧化应激

-内环境稳态障碍

-细胞内结构损伤

为了测试根据实施例1获得的细胞产物的治疗活性，异丙肾上腺素注射之后，将细胞产物根据表1给予iia-c组的小鼠约4周。对照组iii患病小鼠没有给予细胞产物。健康对照组iv仅注射载体0.9%nacl。

每两周一次从每个测试组随机选择每只雄性和雌性动物进行放血用于诊断目的和获得心脏组织匀浆。结果如以下表6.1和6.2进一步所示。

每四周一次(或在第4、12和16周)，为了获得另外的心脏组织而将动物数量加倍(2只雄性，2只雌性)，用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)染色，并通过检查使用massonttc染色方案将组织切片染色之后获得的图像用于分析心肌坏死程度(concie.etal.mousemodelsformyocardial.ischaemia/reperfusion.j.cardiology2006;13(7-8),239-244)。

在转移细胞产物之后第4、12和16周，静脉转移根据实施例1获得的干细胞产物对上述心肌梗塞小鼠模型中雄性梗塞后心脏疤痕的影响显示在图6中，如x轴所示。第8周获得的心脏没有显示出纤维化的迹象，因此这些心脏没有对胶原蛋白染色。图中的条形代表心脏中胶原蛋白的含量，其基于在4、12和16周临床观察中于所选动物使用masson三色将组织切片染色之后获得的图像分析。

可以看出，如以像素为单位所示的疤痕表面积在组iii的未处理小鼠心脏最大，并且该面积随着时间而减小，如第12和16周所见。iia-iic组处理动物的疤痕大小较小。然而，这些结果必须加以预防性解释，因为疤痕大小不应随着时间增加，这特别是在第16周检查时对iia组所观察到。这指出了该测试固有的一些困难，比如心脏大小的个体差异和个体对梗塞诱导的组织损伤量的易感性。

以下表6.1和6.2显示从细胞产物在0-时间点给予处理小鼠的各器官的那周开始为期18周给予细胞产物中荧光标记细胞的示踪结果。在静脉内给予根据实施例1获得的细胞产物之后，观察到骨髓、肾脏、淋巴结和肝脏中标记细胞的缓慢渐进积累。最初迁移至骨髓的一些给予细胞诱导骨髓中进一步产生干细胞和祖细胞，促进受损心脏组织的再生。还提示全身分布导致释放免疫因子。

表6.1

表6.2

基于在小鼠获得的这些结果，可得出以下结论：

使用干细胞疗法在小鼠疾病模型治疗心肌梗塞1.为安全的；2.导致在大多数用细胞产物处理动物的情况下抑制疤痕形成，有利于疤痕心脏组织的梗塞后修复；3.通过正常组织的生长导致大多数处理动物逆转组织形态学异常。

实施例7：多发性硬化

在实施例7中，以小鼠的多发性硬化(ms)实验模型体内测试根据实施例1制备的细胞产物以及原始细胞群和耗尽的造血细胞的治疗活性。

具有自身免疫病因学的中枢神经系统的进行性疾病ms的最佳可用动物模型，为众所周知的小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)模型。就cns的病理变化以及临床症状而言，eae与ms非常相似。

通过用6-8周龄从departmentofanimalbreedingexperimentalmedicaluniversityoflodz获得的雌性sjl小鼠/j(jacksonlaboratory,usa)的髓磷脂免疫诱导eae。在腹部区域的两个部位皮下给予小鼠与完全弗氏佐剂(cfa,sigma)混合的免疫原性肽片段plp139-151。每只小鼠给予0.25ml溶于0.1ml重蒸馏水中的15mgplp肽139-151和0.75mg悬浮于0.15mlcfa中的冻干结核分枝杆菌h37rv(difcolab.,usa)的混合物的悬浮液。另外，在免疫当天和免疫之后第3天两次给予小鼠尾静脉溶于生理盐水(磷酸盐缓冲盐水-pbs，biomed)中至最终体积0.2ml的0.15μg百日咳毒素(来自百日咳博德特氏菌的百日咳毒素，sigma)。

对于eae的神经症状，每天在固定时间实施临床观察。评价量表考虑动物的运动技能和身体协调，并允许鉴定动物组之间观察到的神经差异。根据公开的标准(pettinellietal.,1982;głąbińskietal.,1997)使用总计6级量表，其中：

5-乳头状致命的一种疾病；

4-前肢和后肢瘫痪；

3-后腿或前肢完全瘫痪；

2-轻瘫或共济失调；

1-尾部无力；

0-无症状。

eae的常见临床症状一般地在免疫之后第10-15天之间出现。eae小鼠的处理通过在免疫之后第10-15天之间疾病eae的第一峰值时以2x10e6个细胞的剂量单次静脉转移干细胞来实施。在实施例7中，不仅测试了新鲜获得的级分c(即耗尽造血细胞的示例性本发明细胞产物，图7.1)，而且测试了新鲜获得的级分d(包含由耗尽柱保留并随后洗脱的所选造血细胞的级分，图7.2)和新鲜获得的级分a(全骨髓，原始细胞群，参见图7.3)的治疗活性。

另外，在体外培养3周之后，还测试了级分a(参见图7.4)和级分c(参见图7.5)的治疗活性，其中在第一步应用两周的增殖培养条件(培养基补充有fgf2、egf：dmem/f12(gibco,cergy,france)，含有：0.6%葡萄糖、25ug/ml胰岛素、100ug/ml转铁蛋白、20nm黄体酮、60mg/ml腐胺、30nm亚硒酸钠、2mm谷氨酰胺、3mm碳酸氢钠、5mmhepes、2mg/ml肝素、50mg/ml庆大霉素、20ng/mlfgf2和20ng/mlegf)和在第二步应用一周的分化培养条件(培养基不含fgf2、egf：dmem/f12(gibco,cergy,france)，含有：0.6%葡萄糖、25ug/ml胰岛素、100ug/ml转铁蛋白、20nm黄体酮，60mg/ml腐胺，30nm亚硒酸钠、2mm谷氨酰胺、3mm碳酸氢钠、5mmhepes、2mg/ml肝素、50mg/ml庆大霉素)。

除新鲜级分c给予18只eae小鼠(图7.1)以外，所有这些不同细胞群在免疫之后第10-15天之间的eae症状第一峰值时给予10只eae小鼠(图7.2-7.5)。

这些结果非常清楚地表明，耗尽造血细胞的细胞产物(实施例1的级分c，其在体外耗尽程序之后直接给予18只小鼠)具有治疗活性，因为到处理小鼠到观察期结束时通过以上所示量表测量的临床症状从数值约2降至数值刚好低于1，其中症状减轻大约在给予细胞产物之后第3天开始-对应于小鼠免疫(即诱导eae)之后约13-18天。在通过免疫诱导eae之后长达92天的整个观察期症状持续减轻。相比之下，在92天观察期内，未处理小鼠反而显示出eae症状显著增加高达数值3。

此外，类似于人类多发性硬化的小鼠eae模型疾病进展具有症状复发和缓解模式。从图7.1可以看出，在处理小鼠组仅观察到一个轻微的低强度复发，而在对照组观察到3个较大强度复发。这表明在整个观察期间处理组的eae疾病病程减轻，认为主要是由于静脉转移的干细胞级分c的免疫调节作用。

引人注目的是，仅通过转移干细胞级分c实现了有益的治疗效果，干细胞级分c为根据实施例1方法的示例性实施方案获得的细胞产物。通过全骨髓(级分a，图7.3)或通过造血细胞(级分d，图7.2)或者在包括有利于分化的这种培养条件下体外培养级分a3周之后(图7.4)或体外培养级分c3周之后(图7.5)未实现有益的治疗效果。在所有图7.2-7.5中，测量临床eae症状的数值在处理和未处理小鼠之间没有显著不同。

表7显示在给予细胞产物那周开始的第1、2和6周给予细胞产物中的荧光标记细胞的示踪结果。

表7

这些结果表明标记的干细胞已穿过血脑屏障并迁移至脑、脑干、延髓以及脊髓的上段和下段。细胞产物的细胞可提供斑块的组织再生和另外用于防止t细胞、b细胞及适应性和先天免疫系统两者的其他细胞穿过血液屏障并渗透超出它的神经组织。

脾脏中出现转移干细胞可能导致eae疾病病程期间的治疗性免疫调节。

肝脏中出现转移细胞可保护和再生eae小鼠的肝脏。已知ms患者存在从体内清除氧自由基所需的酶缺损。ms患者的酶缺陷和生成的毒素积累与运动控制的丧失成比例。中毒导致对中枢神经系统神经纤维的损伤。

观察到骨髓中标记转移细胞的归巢及其释放-如以上小鼠其他模型疾病的实施例中所述-对eae小鼠也一样。

用小鼠实施例的结论(a部分)：

测试结果表明，治疗性细胞群在治疗类风湿性关节炎(ra)、1型糖尿病(db1)、2型糖尿病(db2)、缺血性中风(is)、心肌梗塞(mi)和多发性硬化(ms)的动物模型中有效。

不希望受任何理论的束缚，假定转移细胞在整个身体的迁移与其首先阻断特定t淋巴细胞以防止或减少进一步(自身)免疫反应的治疗效果相关，然后其引起受损神经组织的再生以及最终引起受损的其他受影响器官(例如在肝脏中)的其他组织的再生。

b部分：人体临床试验

实施例8

在实施例8中，用捐献的人体组织开始，实施提供治疗活性细胞产物的离体方法的示例性实施方案。方法的该实施方案应用于来自6名健康个体小样本的骨髓捐献的方法初步测试，并且随后在临床试验期间用3名患有多发性硬化(ms)的人类患者开始：

实施例8的示例性实施方案具有与实施例1基本相同的步骤，然而使用不同的所选表面抗原组，其适合于通过体外耗尽和回收细胞产物中的非造血干细胞和祖细胞从人体组织样品去除造血细胞。

对于从人体组织提供治疗活性细胞产物的方法的一些实施方案，所选表面抗原组包含cd14、cd34、cd45和cd45家族的其他成员像cd45ra或cd45ro。

选择cd34、cd45和cd45抗原家族的至少一个其他成员作为所选表面抗原组的成员，用于去除造血干细胞和祖细胞、介导适应性免疫系统的淋巴细胞，特别是早期b和t细胞前体干细胞和b细胞谱系的细胞，所述细胞表达cd34或cd45家族的抗原或两者。

该方法的另一个有利条件为在免疫耗尽中使用针对cd34、cd45和cd45抗原家族的至少一个另外成员的抗体降低细胞产物包含可引起患者癌症的细胞的风险。大多数表达cd34的细胞也共表达cd45家族的至少一个成员，并且因此假定从原始细胞群有效去除这种共表达细胞。

所选抗原组中抗原的选择可适应于原始细胞群的细胞组成，并根据细胞表面抗原表达和细胞类型之间的已知相关性来实现从原始细胞群选择性去除造血细胞和任选地其他细胞类型。

以下列表表示本发明人选择用于从人体骨髓免疫耗尽造血细胞的一些细胞表面抗原，因为其在以下细胞类型具有特征性表达：

-cd14：在造血细胞比如单核细胞上表达，包括巨噬细胞和树突状细胞以及先天免疫系统的嗜中性粒细胞；还表达在一些癌细胞表面比如髓单核细胞白血病和组织细胞肉瘤及其他形式癌症中。

-cd34：在造血干细胞和成血管细胞(其可分化成造血细胞和内皮细胞两者)及间充质干细胞、内皮祖细胞、血管内皮细胞但不是淋巴管(除胸膜淋巴管以外)的子集上表达。

-cd45抗原家族(以前称为lca-白细胞共同抗原)：在除红细胞以外的几乎所有造血细胞上表达。

在文献中显示例如cd45表达在b谱系细胞中依细胞分化而定变化，与其在白血病t细胞和髓系细胞系上的稳定表达形成对比(actapatholjpn.1990feb;40(2):107-15)。

-cd45ra：特别是在幼稚t细胞上表达。

-cd45ro：特别是在活化的t细胞和记忆性t-细胞上表达。

-cd45r：特别是在b细胞及其前体、在树突状细胞和其他抗原呈递细胞的子群上表达。

在应用于人体骨髓的方法的该示例性实施方案中，所选表面抗原组包含抗原cd14、cd34、cd45及cd45表面抗原家族的其他家族成员，cd45ra、cd45ro或cd45r为cd45家族特别有利的家族成员。

与在小鼠的实施例1类似，根据实施例8的示例性实施方案提供治疗活性细胞产物的方法包括以下步骤：

-过滤离体骨髓；

-通过过滤洗涤和离心纯化离体骨髓；

-用针对所选cd抗原cd14、cd45、cd45ra的生物素化单克隆抗体进行标记；

-通过细胞离心和进一步稀释去除过量抗体；

-用抗生物素和抗cd34抗体(两者均与超顺磁性右旋糖酐铁粒子缀合)进行第二标记；

-通过离心和重悬浮细胞并进一步稀释去除过量未结合的抗体；

-使用例如clinimacs磁分离装置耗尽标记细胞(收集的阴性级分作为最终产物)。

在实施例8的方法的示例性实施方案中，已应用miltenyibiotec的climimax®分离技术，包括试剂、缓冲液、设备和管线。基本上遵循相应的miltenyibiotec规格要求和关于例如无菌应用一般实验室实践。在该具体示例性实施方案中使用的所有抗体可例如从miltenyibiotec、diaclone等市售得到)(参见例如http://www.antibodyresource.com/onlinecomp.html)。而且，用于免疫磁性耗尽的缓冲液、试剂和设备可例如从miltenyibiotec、cslbehringgmbh市售得到，例如用于人血清白蛋白等。

在提供实施例8的治疗活性细胞产物的示例性实施方案中，遵循以下方案：

体外免疫磁性耗尽之前的准备步骤：

-在分离程序之前，检查clinimacs分离所需的必要试剂和消耗品的量，并记录工作环境的参数。

-将人体骨髓组织探针(约50ml骨髓)接收于无菌袋中。将其称为级分a并保持在室温(20-25℃)下。

通过200微米滤器过滤组织探针，并取样用于流式细胞术分析、微生物学和形态学研究。用clinimacspbs/edta/hsa缓冲液(补充有1mmedta的磷酸盐缓冲盐水(ph7.2)，并在使用之前另外补充有0.5%(w/v)hsa(人血清白蛋白))稀释。加入的稀释缓冲液重量为细胞产物重量的两倍。

-离心15分钟(500×g无制动)，将沉淀重悬浮于95ml±5ml体积的clinimacspbs/edta/hsa缓冲液中，其为适合过滤和洗涤细胞悬浮液的体积，用于以生物素化单克隆抗体磁性标记。

免疫[-磁性]-标记的第一步：

其用生物素化单克隆抗体实施：

-通过加入0.5ml每种抗体的1mg/ml储备溶液制备3种单克隆抗体(cd14、cd45、cd45ra，来自diaclone)的混合物(得到总体积为1.5ml)。

-然后，加入6mlclinimacspbs/edta/hsa缓冲液，得到体积为7.5ml的抗体混合溶液。

-将抗体混合物的总体积(7.5ml)转移至含有以上制备的95ml过滤和洗涤过的细胞悬浮液的制备袋中(最终标记体积：102.5ml)。

-将细胞悬浮液与生物素化单克隆抗体混合物在室温(19-25℃)下于轨道旋转器上以约25rpm一起温育30分钟，用于进行免疫标记。

与抗体一起温育的细胞数量特别是在10⁷-5x10⁹个细胞，更特别是在3x10⁷-2x10⁹个细胞的范围内和温育体积为100ml+/-10ml。优选地，细胞总数不超过1.5或1.2×10⁹个细胞100ml+/-10ml孵育体积。优选地，细胞总数不超过1.5或1.2x10⁹个细胞和温育体积为100ml+/-10ml。

-通过添加补充有0.5%(w/v)has的clinimacspbs/edta缓冲液直至总体积为600ml终止温育，随后离心15分钟(500×g无制动)，以去除过量的生物素化单克隆抗体。

-将细胞沉淀以合适体积/细胞量重悬浮。与标准程序推荐的体积相比较，体积可增加1.5-4倍，特别是2-2.5或2-3倍。在实施例8的示例性实施方案中，加入补充有0.5%(w/v)has的clinimacspbs/edta缓冲液至最终体积为197.5ml(±5ml)，相比之下标准miltenyibiotec方案的推荐体积为90+7.5=102.5ml。

使用与右旋糖酐铁微珠缀合的抗生物素抗体和抗cd34抗体实施免疫磁性标记的第二步，其中使用浓度为30mg/ml的clinimacs抗cd34试剂no171-01和浓度为30mg/ml的clinimacs抗生物素试剂no278-01。

-为此目的，一小瓶(7.5ml)整个体积的每种clinimacs试剂(clinimacs抗生物素试剂、浓度为30mg/ml的clinimacs抗cd34试剂no171-01和浓度为30mg/ml的clinimacs抗生物素试剂no278-01)加入到制备袋中，并在室温(19-25℃)下于轨道旋转器上以约25rpm温育30分钟。

-通过添加补充有0.5%(w/v)has的clinimacspbs/edta缓冲液直至总体积为600ml终止温育，随后离心15分钟(500×g无制动)，以去除过量的生物素化单克隆抗体。

-通过添加补充有0.5%(w/v)has的clinimacspbs/edta缓冲液直至最终体积为约150ml制备样品并标记为级分b，用于使用clinimacs仪器进行磁性分离程序。

收集用于流式细胞术、微生物学和形态学研究的样品。

-使用cd34选择程序和分离clinimacstubingset实施使用clinimacs仪器的分离程序。在程序完成之后，计算每种获得的级分(阴性级分c、阳性级分d和洗涤级分)的重量，并取样用于流式细胞术、微生物学和形态学研究。

-获得的参与临床研究患者的细胞产物(级分c)用条形码化患者信息标记并释放以转移至患者。

用来自6名健康供体的骨髓探针离体实施本发明体外耗尽方法的该示例性实施方案，产生原始悬浮液或级分a。在通过使用针对cd14和cd34表面抗原和cd45表面抗原家族的至少两个成员(特别是cd45和cd45ra)的抗体的免疫耗尽程序体外耗尽造血细胞用于去除不期望的造血细胞之后，收集获得的治疗活性细胞产物或级分c。结果如表8.1所示。特别是显示了细胞产物中表达特定细胞表面抗原的阳性细胞部分与原始群中阳性部分的百分比率(c/ax100%)，并且还显示了级分c的细胞总数中阳性部分的百分比。

以下表8.1中所示的c/a百分比率值代表级分c中表达特定表面抗原的细胞数量中值除以级分c中表达表面抗原的细胞数量中值。

例如，在可根据本发明第二方面通过从组织探针体外耗尽造血细胞获得的细胞产物的一些实施方案中，并且特别是在可根据本发明方法获得的一些实施方案中，表达一种或多种指示多潜能干细胞的表面抗原的细胞部分，比如表达ssea-4或cd90或cd133的细胞或共表达cd34/cd133的细胞，共计细胞总数的至少0.01%-1%，特别是至少0.03%或至少0.1%或至少0.3%或至少1%，如通过血细胞计数分析测量的那样。

在以下表8.2中，沿着体外程序的各种细胞悬浮液中细胞群的活力表示为群细胞总数中活细胞的百分比：级分a为骨髓组织探针原始细胞群的悬浮液，级分b为用抗体进行两次标记步骤之后和在免疫磁性分离之前的细胞悬浮液，级分c为其流过柱即耗尽造血细胞的期望细胞产物的细胞悬浮液，和级分d包含造血细胞部分，后者通过保留在免疫磁性柱中并随后洗脱而从原始细胞群去除。每个级分中的活细胞部分通过基于对从每个级分去除并用碘化丙锭(pi)染色的细胞样品进行流式细胞术测量的活力分析确定(carloriccardi,ildonicoletti(2006):“analysisofapoptosisbypropidiumiodidestainingandflowcytometry”,natureprotocols1,1458-1461)。

表8.2显示健康受试者(kb4)和多发性硬化患者(kb12)两者级分的活力分析结果。

表8.2：活力-级分中细胞总数的活细胞百分比

实施例9

ms患者的临床数据

在t=0时给予患者如实施例8中所述获得的自体细胞产物。给予细胞产物的量为

kb1210-013.12x10e6个细胞/kg体重(95kg)

kb1210-0081x10e6个细胞/kgb.w.(70kg)

kb1210-0117.3x10e6个细胞/kgb.w.(56kg)

如johnf.kurtzke开发的扩展残疾状态量表(edss)已被用于评价3名受试多发性硬化患者的临床症状和量化残疾程度。在转移根据实施例8获得的自体干细胞产物的时间点(tr)和在转移细胞产物之后3、6、9、12、18和24个月时这些患者的评价结果列于表9.1中：

表9中的结果表明，所有3名患者均从治疗性治疗中获益。相对不太严重的患者kb1210-01的临床症状在大多数时间保持不变。这对应于治疗的有益效果，表明疾病的进展可以停止并且没有复发，即进一步的发作增加在观察期间发生的症状严重程度。

对于具有更严重症状的患者kb1210-008和kb1210-011，分别在观察期的前9或18个月发现其病症改善，之后观察到症状增加。对于患者kb1210-008，ms症状的增加最大。然而，未观察到ms疾病的典型复发。值得注意的是)，一段时间之后第二次输注可能是可取的。

对于每名ms患者，选择最具特征性的均质斑块以通过mri成像进行分析(参见图8.1-8.3)。在cnsmri成像的两个平面中的最大垂直和水平轴区域测量斑块表面：前轴和横轴。在3个时间点测量斑块的表面积：在如根据实施例8制备的细胞产物(tr)时或之前不久以及在i.v.给予之后12和24个月。

已针对ms分析的3名患者kb1210-01、kb1210-008、kb1210-011的每个病变(斑块)指示了中枢神经系统cns中的确切位置。将斑块框起来并且其周边进入邻近最长横向和纵向尺寸的矩形。在此基础上计算表面积。

图8.1.a、8.2.a和8.3.a分别显示每名患者kb1210-01、kb1210-008、kb1210-011在给予(转移(tr))给患者细胞产物之前不久的3个时间点以及之后12和24个月时所选特征性斑块大小的变化。

图8.1.b、8.2.b和8.3.b分别显示每名患者kb1210-01、kb1210-008、kb1210-011在相应时间点如表9.3(参见以上)中列出的edss评分。

从图8.1/2/3.a和8.1/2/3.b的并置可以看出，mri成像的数据分析与3名ms患者中每一名的edss评分之间存在明显的相关性。

关于ms评价的更多信息也可参见habera,laroccang.eds.minimalrecordofdisabilityformultiplesclerosis.newyork:nationalmultiplesclerosissociety;1985。

此外，根据多发性硬化综合功能(msfc)测试评价上述ms患者。有关参考文献参见例如：

1.fischerj.s.,jaka.j.,knikerj.e.,rudickr.amultiplesclerosisfunctionalcomposite(msfc)administrationandscoringmanual.nationalmultiplesclerosissociety.october2001.

2.millerd.m.,rudickr.a.,cutterg.,baierm.,fischerj.s.clinicalsignificanceofthemultiplesclerosisfunctionalcomposite.relationshiptopatient-reportedqualityoflife.arch.neurol.,2000,57:1319-1324.

在细胞产物转移(tr)时或在其之前不久及在之后的3、6、7、8、9、10、11、12、18和24个月每次对照访问时给予msfc测试。图9.1显示msfc的九柱孔测试(9-hpt)结果，该测试为对上肢功能的测试。图9.2显示测量没有休息的长距离步行(作为msfc限时25英尺步行的备选方案)能力的测试结果。在图9.1和9.2中显示3名ms患者kb1210-01、kb1210-008、kb1210-011在每个上述时间点的平均值。

关于图9.1：9-hpt测试为上肢功能的定量测量，并且根据标准方案实施(jills.fischers.j.etal.,“multiplesclerosisfunctionalcomposite(mfsc).administrationandscoringmanual”,revisedoctober2001)。以惯用手的连续两次试验随后立即进行非惯用手的连续两次试验测试惯用(图9.1.a)和非惯用(图9.1.b)手两者。注意在坚固桌子(不是滚动的医院床头桌)上给予9-hpt并固定9-hpt装置。在图9.1中，y轴表示用钉子填充孔并再次去除它们所需的时间，和x轴表示在转移(tr)细胞产物时或之前不久及之后12和24个月时的测量时间点。测试的3名ms患者的平均值由填充三角形表示，并且为了比较，健康对照个体所需的平均、低和高时间量由以灰色-黑色的可变色调填充的圆圈表示。结果清楚地揭示ms患者在治疗之前比健康个体需要显著更长的时间，并且在转移之后的12个月时间点其惯用和非惯用手在9-hpt测试中的表现显著改善，当在24个月时间点非惯用手的效果仍然略微进一步改善，但在惯用手其不再强劲。该结果与观察结果一致，即响应ms患者的医学治疗，通常就训练较好的惯用手而言9-hpt性能的表现最小。此外，这些结果与mri分析的结果很好地相关，其中在右半球观察到最有益的治疗效果，右半球负责这里呈现的3名右撇子ms患者的非惯用左手。

为了测量下肢功能，给予了msfc的进一步测试，即“限时25英尺步行”测试。在该测试中，指导患者尽可能快地步行，但安全地到达清楚标记的25英尺路线的一端并返回。患者可使用适当的辅助器具比如手杖。然而，在临床观察期间，转移时基于edss量表评分在2.5-4.5之间的3名ms患者kb1210-01、kb1210-008、kb1210-011(参见表9.1)在“限时25英尺步行”测试中开始跑步或行走异常快速。显然，该测试太容易正确地测量细胞产物转移之后这些患者下肢功能表现的实际增加。因此，医生在临床观察期间评估下肢的功能，尤其是通过访问患者关于其在正常日常活动期间长距离步行的能力，并根据edmus分级量表(egs/dss)评分(amatomp,etal.fortheevaluationoftheedmussystem(evalued)studygroup:europeanvalidationofastandardizedclinicaldescriptionofmultiplesclerosis.j.neurol.2004;251:1472-1480)。此外，通过将步行距离分为以下类别基于精细尺度测量在没有疲劳的情况下行走一段距离的能力：

-100-200米；

-200-300米；

-300-500米；

-超过500米，但仍距离有限，由患者指定

-超过500米，即像健康个体一样距离无限。

在临床观察期间，注意到步行支撑件比如手杖的潜在用途。事实上，只有患者kb1210-011在转移细胞时需要手杖，但在转移细胞产物之后3个月他不再需要它。

图9.2中的结果显示3名ms患者kb1210-01、kb1210-008、kb1210-011在转移细胞产物之后12和24个月时的步行距离的平均增加。在24个月临床观察结束时达到的平均距离是转移时的2.5倍。

关于图10：在转移细胞产物时(tr)和之后12和24个月时间点测量3名ms患者的免疫球蛋白iga、igg、igm和ige血液水平的平均值，如填充三角形所示。为了比较，在健康对照个体测量的标准的正常低和正常高水平分别由填充深和浅灰色的圆圈表示。

如图10.1、10.2和10.3所示，i.v.转移根据实施例8制备的细胞产物不会导致体液免疫反应，如iga(g/l)、igg(g/l)和igm(g/l)的血液水平所示，其全部处于健康个体的正常低和正常高血液水平的范围内。

相比之下，在图10.4中，3名ms患者的ige(iu/ml)平均浓度高于健康个体的水平。