政府支持声明本文所述发明全部或部分受国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)(资助号r01ns24180、r01ns32129、r01ca104996、r01ca096859)及全国多发性硬化协会(nationalmultiplesclerosissociety)(资助号ca1011a8-3)的支持。美国政府在本发明中享有一定权利。本发明涉及能够结合并识别cns中的神经元并能够引起cns神经元反应的抗体，特别是人天然抗体、来源其的重组抗体及其片段。这些抗体可用于诊断和治疗与神经损害、损伤或变性有关的病况、神经变性疾病、慢性神经损伤或损害和突发性神经损伤或损害。本发明的抗体、其可变区或其cdr结构域序列及其片段还可用于与化疗剂、免疫调节剂或神经活性剂和/或与其他抗体或其片段组合的疗法中。本发明特别涉及用于减轻或治疗中风或缺血、特别是脑缺血的方法，和用于中风或缺血的相关药剂、构建体和组合物。
背景技术：
：：神经再生是指神经组织、细胞或细胞产物的再生长或修复。此类机制可包括髓鞘再生、新的神经元、胶质细胞、轴突、髓磷脂或突触的产生。神经再生因所涉及的功能机制以及再生程度和速度而在周围神经系统(pns)和中枢神经系统(cns)间有所不同。在损伤后成熟哺乳动物中枢神经系统(cns)中的轴突再生非常有限。因此，在脊髓损伤(sci)、创伤性脑损伤、中风和涉及轴突断裂的相关病况之后功能缺陷持续存在。这种情形不同于哺乳动物周围神经系统(pns)中的情况，周围神经系统中长距离轴突再生和实质性功能恢复可发生在成体中。神经元的胞外分子和内在生长能力两者影响再生的成功。成年哺乳动物中，中枢神经系统(cns)轴突在损伤后不会自发地再生。相比之下，周围神经系统(pns)轴突容易再生，允许在周围神经损害后恢复功能。aguayo与同事证实，至少一些成熟cns神经元当提供有允许的周围神经移植物时保持再生的能力(richardsonpm，mcguinnessum，aguayoaj(1980)nature284：264-265；richardsonpm，issavm，aguayoaj(1984)jneurocytol13：165-182；davids，aguayoaj(1981)science214：931-933；benfeym，aguayoaj(1982)nature296：150-152)。该研究表明对于轴突生长，pns环境是刺激性的和/或cns环境是抑制性的。随后的研究鉴定出pns中的生长促进因子和cns中的生长抑制因子两者。再生的抑制剂包括cns髓磷脂中的特定蛋白质和与星形胶质瘢痕有关的分子。另外，cns中相对于pns的较慢的碎片清除可妨碍轴突再生。了解影响轴突生长的因素对开发促进cns再生的治疗剂至关重要。在周围神经损伤后，轴突容易再生。与细胞体断开的轴突的远端部分进行沃勒变性。这种活性过程导致轴突断裂和分解。碎片被神经胶质细胞(主要为巨噬细胞)除去。近端轴突然后可再生，并且使其目标重新受神经支配，使得功能恢复。cns再生抑制剂的两个主要类别是髓磷脂相关抑制剂(mai)和硫酸软骨素蛋白聚糖(cspg)。这些分子限制轴突再生，并且通过干扰其功能，在成体cns中实现某种程度的生长。细胞自主性因子也是cns再生失败的重要决定因素。cns神经元不会增量调节生长相关基因至与pns神经元相同的程度。因此甚至在没有抑制剂时，其再生能力也受到限制。提高神经元的内在生长能力允许cns内适度的轴突再生(bomzehm等人(2001)natneurosci4：38-43；neumanns，woolfcj(1999)neuron23：83-91)。作为cns髓磷脂的组分，mai是由少突胶质细胞表达的蛋白质。mai体外削弱神经突增生，被认为在cns损伤后体内限制轴突生长。mai包括nogo-a(chenms等人(2000)nature403：434-439；grandpret等人(2000)nature403：439-44)、髓磷脂相关糖蛋白(mag)(mckerracherl等人(1994)neuron13：805-811)、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(omgp)(kottisv等人(2002)jneurochem82：1566-1569)、肝配蛋白-b3(bensonmd等人(2005)procnatacadsciusa102：10694-10699)和脑信号蛋白4d(sema4d)(moreau-fauvarquec等人(2003)jneurosci23：9229-9239)。这些中的3种(nogo-a、mag和omgp)与神经元nogo-66受体1(ngr1)相互作用从而限制轴突生长。这3种在结构上不相关的配体还对第二种轴突生长抑制性受体(配对的免疫球蛋白样受体b(pirb))显示亲和力(atwaljk等人(2008)science322：967-970)。已鉴定出几种识别分子，其充当构成促进和/或抑制神经突生长的基础的分子线索。在神经突增生促进性识别分子中，神经细胞粘附分子l1在介导神经突增生中起突出作用(schachnerm(1990)seminarsintheneurosciences2：497-507)。l1依赖性神经突增生受嗜同性(homophilic)相互作用介导。l1促进表达l1的神经突和施万细胞及l1转染的成纤维细胞中的神经突增生(bixby等人(1982)procnatlacad.sci.u.s.a.84：2555-2559；chang等人(1987)jcellbiol104：355-362；lagenaur等人.(1987)procnatlacadsciusa84：7753-7757；seilheimer等人(1988)jcellbiol107：341-351；kadmon等人(1990)jcellbiol110：193-208；williams等人(1992)jcellbiol119：883-892)。神经系统损伤每年影响90,000多人，如果包括脑血管事件例如中风，则人数大更多。据估计，仅脊髓损伤每年就影响10,000人。由于神经损伤这种高的发生率，神经再生和修复(神经组织工程学的分支学科)，正成为致力于发现损伤后恢复神经功能的新方法的快速发展的领域。神经系统被分成两部分：由脑和脊髓组成的中枢神经系统及由脑神经和脊神经连同其相关神经节组成的周围神经系统。虽然周围神经系统具有修复和再生的内在能力，但是相比之下，且就绝大多数而言，中枢神经系统在其自我修复和再生能力方面受到限制。目前还没有可接受并获得批准的在中枢神经系统损伤后恢复人神经功能的治疗法。在脊髓损伤(sci)后，轴突保护和修复作为防止运动神经元损失和永久失能的有效策略仍具有巨大潜力。使用防止损害和促进损伤后轴突修复的靶向营养因子已实现了神经元保护。这些分子主要采用基于体外系统(其集中于靶向特异性小分子神经营养因子)的选择策略而鉴定。虽然这些分子在临床前模型中显示神经保护结果，但是临床试验的结果不太有利。使用损伤和疾病的多个模型，证实了天然自体反应性单克隆抗体在cns细胞中的有益生物功能。使用小鼠单克隆igm，in-1，体内证实了神经元存活、轴突再生和功能恢复的抗体介导的促进(bregmanbs等人(1995)nature378(6556)：498-501；caronip，schwabme(1988)neuron1(1)：85-96)。在cns损伤前使用脊髓匀浆物(sch)免疫，获得类似结果(ellezamb，bertrandj，derghamp，mckerracherl(2003)neurobioldis12(1)：1-10；huangdw等人(1999)neuron24(3)：639-647)。多发性硬化(ms)是一种慢性、频繁进行性、炎性中枢神经系统(cns)疾病，其病理学特征在于原发性脱髓鞘，通常没有最初的轴突损伤。ms的病因和发病机制未知。ms的几个免疫学特征及其与某些主要组织相容性复合体等位基因适度相关，引起了ms是免疫介导的疾病的推测。自身免疫假设得到实验性自身免疫(变应性)脑脊髓炎(eae)模型的支持，其中将某些髓磷脂组分注射给遗传易感动物导致t细胞介导的cns脱髓鞘。然而，在ms患者的cns中未明确鉴定出特异性自身抗原和致病性髓磷脂反应性t细胞，ms也不与其他自身免疫疾病有关。基于流行病学数据的备择假设是环境因素，或许是未鉴定的病毒促成了cns中的炎症反应，其导致直接或间接(“旁路对象(bystander)”)的髓磷脂破坏，可能伴有受诱导的自身免疫组分。这种假设得到以下证据的支持：在人和动物两者中若干天然存在的病毒感染可引起脱髓鞘。一个普遍应用的实验性病毒模型由泰勒氏(theiler′s)鼠脑脊髓炎病毒(tmev)诱导(dalcanto，m.c.，和lipton，h.l.，am.j.path.，88：497-500(1977))。在ms的情况下，脱髓鞘最终导致神经细胞死亡。然而，脱髓鞘后的轴突死亡不是即时的。如果提供合适的支持分子或细胞，神经系统则具有明显的修复能力。保护cns的轴突有希望成为限制存活轴突的丧失和防止永久失能的有效策略。可通过调节损伤中的潜在神经毒性炎性环境来实现神经保护。正在研究设计以限制兴奋性毒性、抑制一氧化氮或阻断离子通道的试剂作为保护处于危险中的轴突的方法(pitt，d.，p.werner，和c.s.raine(2000)natmed6：67-70；okuda，y等人(1997)journalofneuroimmunology73：107-116；waxman，s.g.(2002).jrehabilresdev39：233-242)。这些试剂中的许多是具有已经证实的毒性并全身作用于所有细胞的小分子。缺血是向组织的血液供应受限，引起细胞代谢(以保持组织存活)所需要的氧和葡萄糖短缺。缺血通常由血管问题引起，引起组织的损害或功能障碍。它也指有时由于淤血(诸如血管收缩、血栓形成或栓塞)导致的身体给定部分的局部贫血。缺氧是其中作为整体的身体或身体区域(组织缺氧、或较不常见的区域缺氧)缺乏足够氧供应的病况。动脉氧浓度的变化可以是正常生理的一部分，例如，在剧烈身体锻炼过程中。氧供应和其在细胞水平的需求之间的错配可以导致缺氧状况。缺血性缺氧在血流减少时发生，并且可以例如在心脏衰竭和血管扩张性休克中发生。脑缺氧在没有足够氧气进入脑部时发生。脑部需要氧和营养物的恒定供给来发挥功能。在脑缺氧时，有时只有氧供应中断。这可以由烟雾吸入)、一氧化碳中毒、气哽、防止呼吸肌运动的疾病、高海拔、气管(气管)上的压力和窒息(strangulation)引起。在其他情况下，氧和营养物供给两者都被停止或中断，例如在心脏骤停、心律失常、全身麻醉并发症、溺水、药物过量、出生期间或出生后新生儿损伤，诸如脑性麻痹、中风、非常低血压中。脑缺血是到脑部的血流不足，并且可以是急性或慢性的。急性缺血性中风是神经紧急情况，如果快速治疗，其是可逆的。慢性脑缺血可以导致被称为血管性痴呆的痴呆形式。影响脑部的短暂缺血发作被称为短暂性缺血发作(tia)，经常被称为小中风。中风，也称为脑血管意外(cva)，是由于到脑部的血液供应干扰导致的脑功能的迅速损失。这可能是由于堵塞(血栓形成、动脉栓塞)或出血(血液渗漏)引起的缺血(缺乏血流)。脑缺血，也被称为脑缺血，是其中到脑部的血流不足以满足代谢需求的病况，并且是与蛛网膜下腔出血和脑内出血一起发生的中风类型。缺血可以是局灶性缺血，其限于脑的特定区域，或全脑缺血，其涵盖脑组织的广泛区域。中风是美国长期残疾的主要原因。每年，接近800,000人患有中风。缺血性损伤之后，与临床赤字相关的残疾主要是由于神经元的功能障碍。功能恢复的缺乏部分归因于再生和神经可塑性的限制(walmsley，a.r.，和mir，a.k.(2007)currentpharmaceuticaldesign13：2470-2484)。中风可以导致改变的运动功能，诸如在身体一侧不能移动一个或多个肢体，认知效果，诸如不能理解或组织说话，或其他缺陷，包括视觉效果，诸如不能看到视野的一侧。目前不存在有效的治疗来预防或逆转中风相关的神经系统缺陷。缺血性中风在医院中偶尔用血栓溶解(也称为“凝块破坏者(clotbuster)”)治疗，并且一些出血性中风受益于神经外科手术。复发的预防可以涉及施用抗血小板药物，诸如阿斯匹林和双嘧达莫，控制和降低高血压，并且使用他汀类药物。所选患者可能受益于颈动脉内膜切除术和使用抗凝血剂。脑缺血的介入治疗仍然受限于通过使用重组组织纤溶酶原激活剂rtpa的酶促血栓溶解(brott，t.g.，等人(1992)stroke23：632-640；haley，e.c.，等人(1992)stroke23：641-645；group，t.n.(1995)newenglandjmed333：1581-1587)，和经由直接插管介入去除血液凝块(gobinyp等人(2004)stroke35：2848-2854)。然而，rtpa具有短的3小时的治疗窗口，如果超过3小时时间期输注，则出血性脑缺血发病率增加(clark，wm等人(1999)jama282：2019-2026；hackew等人(2008)newenglandjmed359：1317-1329)。已鉴定出人单克隆自身抗体，其在中枢神经系统中显示活性，并且与刺激髓鞘再生特别有关。将期望的是，开发在cns中具有活性且具有促进神经再生和/或保护神经元免受疾病、损伤、损害和/或死亡的能力的人单克隆抗体，特别是具有这些活性的重组抗体，特别是在中风或脑部/脑缺血的情况下，或当到脑部或cns的氧或血流被剥夺或受急性或慢性影响时。具体而言，具有进入cns并治疗、预防或减轻脑缺血或中风的能力的人单克隆抗体的使用和应用将是期望的。本发明针对的正是该目标的完成。本文参考文献的引用不应解释为承认所述文献是本发明的现有技术。技术实现要素：本发明涉及在cns中具有特定有效性的神经调节剂，所述调节剂包含选自igm亚型的抗体、其活性片段、其单体、其激动剂及其组合的物质。本发明的神经调节剂或抗体具有以下一个或多个特征：它们保护和/或稳定神经元；它们靶向cns或神经细胞损害、受损(compromise)或损伤的部位；它们减少或阻止细胞死亡，例如过氧化氢诱导的细胞死亡。在本发明的一个具体方面，所述药剂，特别是神经元结合单克隆抗体是有效的，且可应用或用于治疗和减轻中风和缺血，特别是脑缺血，和其中涉及或已经发生神经细胞或脑的缺血或缺氧的病况。本发明提供神经元结合单克隆抗体，其具有促进神经突延伸、以在神经再生中起作用和/或保护神经元免受损害以及用于中枢神经系统的诊断和治疗目的的能力。本研究证明，当将神经元结合单克隆抗体、特别是抗体igm12rhigm12施用于中风之后的动物(在这种情况下，用于诱导缺血性中风的动物模型)时，其导致动物功能的明显改善并保护组织完整性。具体而言，提供特异性重组抗体，其中所述抗体识别并能够结合神经元，包括皮质神经元、海马神经元、小脑颗粒细胞和视网膜神经节细胞，且在中风、缺血病况或神经细胞或小胶质细胞缺血或缺氧事件中或之后，其靶向并介导神经元和神经细胞。本文提供重组完全人抗体。本发明的抗体在与神经受损、损害或损伤有关的病况或疾病中具有诊断和治疗用途。在一个总体方面，本发明提供针对且能够结合神经元上的一个或多个表位的抗体，所述神经元包括皮质神经元、海马神经元、小脑颗粒细胞和视网膜神经节细胞。在一个大的方面，本发明提供分离的特异性结合成员(bindingmember)，特别是抗体或其片段，包括识别、结合和/或靶向神经元的重组人抗体。本发明提供特异性结合神经元和保护神经元免于细胞死亡并且不会促进髓鞘再生的抗体，特别是人抗体，特别是igm抗体。本发明的抗体应用于治疗或减轻其中神经受损、损伤或损害或处于受损、损伤或损害风险的哺乳动物的疾病或病况，包括应用于脊髓损伤(sci)、创伤性脑损伤(tbi)、肌萎缩性侧索硬化(als)、多发性硬化(ms)、阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease)、中风、帕金森病(parkinson’sdisease)、亨廷顿舞蹈病(huntington’sdisease)、产前缺氧/围产期缺血、大脑性麻痹、脑病、脊髓病或运动神经元疾病，并且特别应用于神经元和这些疾病中神经能力的保护、存活或维持。在一个具体方面，本发明的抗体或其组合物可用且应用于中风和脑缺血中。在一个具体方面，本发明的抗体或组合物可用于其中到脑部的血流和/或氧不足以满足代谢需求或其中对脑部的创伤性损伤导致神经元和相关细胞的死亡或损伤或死亡或损伤风险的病况。在一个具体方面，本发明提供抗体或其片段，其是抗体12或42，特别是血清来源的或重组的igm12或igm42。在本发明的一个方面，提供包含图5和/或图6中所示的可变区cdr序列的重组或合成神经元结合抗体。抗体12包含图5中所示的重链cdr序列cdr1ggsvslyy(seqidno：31)，cdr2gyiyssgst(seqidno：32)和cdr3arsasirgwfd(seqidno：33)，及轻链cdr序列cdr1qsissy(seqidno：34)、cdr2aas(seqidno：35)和cdr3qqsyhtpw(seqidno：36)。抗体42包含图6中所示的重链cdr序列cdr1gftfstya(seqidno：37)、cdr2invggvtt(seqidno：38)和cdr3vrrsgpdrnsspadf(seqidno：39)及轻链cdr序列cdr1qgig(seqidno：40)、cdr2tts(seqidno：41)和cdr3qkynsaprt(seqidno：42)。因此，以本文鉴定的抗体的cdr为基础的重组抗体可用于靶向和保护神经元，特别是疾病或癌症中的易感、受损、损伤或损害的神经元。本发明因此提供特异性结合神经元和保护神经元免于细胞死亡并且不会促进髓鞘再生的分离的人igm抗体或其片段，其中抗体或片段包含：(a)图5所示的可变重链氨基酸cdr结构域序列cdr1ggsvslyy(seqidno：31)、cdr2gyiyssgst(seqidno：32)和cdr3arsasirgwfd(seqidno：33)及轻链cdr序列cdr1qsissy(seqidno：34)、cdr2aas(seqidno：35)和cdr3qqsyhtpn(seqidno：36)；或(b)图6所示的可变重链氨基酸cdr结构域序列cdr1gftfstya(seqidno：37)、cdr2invggvtt(seqidno：38)和cdr3vrrsgpdrnsspadf(seqidno：39)和轻链cdr序列cdr1qgig(seqidno：40)、cdr2tts(seqidno：41)和cdr3qkynsaprt(seqidno：42)，以用于治疗或减轻其中神经受损、损伤或损害或处于受损、损伤或损害风险的哺乳动物的疾病或病况。在更具体的方面，本发明的抗体包含包括图5和/或图6所示的抗体12或42的氨基酸序列。本发明的重组抗体igm12包含图5所示的可变重链序列(seqidno：1)和轻链序列(seqidno：11)。本发明的重组抗体igm42包含图6所示的可变重链序列(seqidno：17)和轻链序列(seqidno：27)。在本发明的具体方面，重组抗体是包含人重链可变区、恒定区和人j链的完全人重组抗体。本文提供完全人重组igm12抗体，其包含图5所示的人免疫球蛋白重链(包含可变区(seqidno：1)或其cdr)、人恒定区、特别是κ序列(seqidno：3、5、7和9)和人j链(seqidno：15)。在又一个方面，本发明提供分离的抗体或其能够结合抗原的片段，其中所述抗体或其片段包含含有基本如本文或图6中所示的氨基酸序列的多肽结合结构域。本发明提供能够结合神经元的分离的人抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含重链可变区(seqidno：17)或其cdr和轻链可变区(seqidno：27)或其cdr，或包含基本如本文或图6中所示的氨基酸序列。在又一个方面，本发明提供分离的完全人抗体或其能够结合抗原的片段，其中所述抗体或其片段包含含有基本如本文和图5中所示的氨基酸序列的多肽结合结构域。本发明提供能够结合神经元的分离的完全人抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含重链可变区(seqidno：1)或其cdr及轻链可变区(seqidno：11)或其cdr，或包含基本如本文和图5中所示的氨基酸序列。本发明特别提供分离的人igm抗体或其活性片段，其包含图5所示的可变重链氨基酸cdr结构域序列cdr1ggsvslyy(seqidno：31)、cdr2gyiyssgst(seqidno：32)和cdr3arsasirgwfd(seqidno：33)及轻链cdr序列cdr1qsissy(seqidno：34)、cdr2aas(seqiqno：35)和cdr3qqsyhtpw(seqidno：36)。在一个具体方面，本发明提供分离的完全人重组igm抗体或其活性片段，其包含可变重链氨基酸cdr结构域序列cdr1ggsvslyy(seqidno：31)、cdr2gyiyssgst(seqidno：32)和cdr3arsasirgwfd(seqidno：33)及轻链cdr序列cdr1qsissy(seqidno：34)、cdr2aas(seqidno：35)和cdr3qqsyhtpw(seqidno：36)、人恒定区和seqidno：15所示的人j链序列。在其他方面，本发明提供包含编码上述神经元结合多肽或抗体的序列的分离的核酸和制备本发明的多肽或抗体的方法，所述方法包括在引起所述多肽或抗体表达的条件下表达所述核酸，并回收多肽或抗体。在一个此类方面，提供编码具有图5或图6所示的氨基酸序列的抗体可变区序列的核酸或提供具有图5或图6所示的cdr结构域序列的抗体。在一个方面，提供包含图5或图6的核酸序列的核酸。在又一个方面，提供编码图5或图6所示的重链可变区vh或轻链可变区vl的核酸。本发明还涉及编码本发明抗体的重组dna分子或克隆基因或其简并变体；优选核酸分子，特别是编码抗体vh和vl、特别是cdr区序列的重组dna分子或克隆基因，其具有图5或图6所示序列或能够编码图5或图6所示序列。在优选的方面，本发明提供编码igm12的重链(seqidno：2)和轻链可变区序列(seqidno：12)的核酸，以及编码igm42的重链(seqidno：18)和轻链可变区序列(seqidno：28)的核酸。在本发明的一个方面，提供核酸，其编码包含可变重链氨基酸cdr结构域序列cdr1ggsvslyy(seqidno：31)、cdr2gyiyssgst(seqidno：32)和cdr3arsasirgwfd(seqidno：33)及轻链cdr序列cdr1qsissy(seqidno：34)、cdr2aas(seqidno：35)和cdr3qqsyhtpw(seqidno：36)的抗体或其片段。在又一个方面，核酸还编码人恒定区和人j链，特别是seqidno：15的j链。在本发明的一个方面，提供核酸，其编码包含可变重链氨基酸cdr结构域序列cdr1gftfstya(seqidno：37)、cdr2invggvtt(seqidno：38)和cdr3vrrsgpdrnsspadf(seqidno：39)及轻链cdr序列cdr1qgig(seqidno：40)、cdr2tts(seqidno：41)和cdr3qkynsaprt(seqidno：42)的抗体或其片段。在又一个方面，核酸还编码人恒定区和人j链，特别是seqidno：15的j链。包含本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体可用于治疗、预防或诊断人或动物体的方法，例如哺乳动物中的神经保护方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的本发明的抗体、其片段和重组抗体。包含本发明的cdr结构域序列的重组抗体或其片段可用于哺乳动物中的神经保护方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的本发明的抗体、其片段和重组抗体。本发明的药剂，特别是重组抗体或其片段可在预防、治疗或减轻能够、可能或的确导致cns损伤的神经损伤、损害或受损和并发症的方法中用作神经保护剂。当涉及或关联神经元的结构、功能或存活丧失(包括脑损伤或创伤、脊髓损伤(sci)、神经损伤、头损伤、其中脑供血减少或受损的病况、脑感染性疾病、神经变性疾病)时，本发明的治疗或预防方法是可适用的。根据本发明的方法治疗、预防或减轻的示例性的此类疾病或病况包括脊髓损伤(sci)、创伤性脑损伤(tbi)、肌萎缩性侧索硬化(als)、多发性硬化(ms)、阿尔茨海默病、中风、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、产前缺氧/围产期缺血和/或大脑性麻痹、脑病、脊髓病和运动神经元疾病。本发明因此涉及治疗或减轻其中神经受损、损伤或损害的哺乳动物中或者其中神经或神经元易于受损、损伤或损害或者有受损、损伤或损害风险的情形中的疾病或病况的方法，所述方法包括施用选自igm12和igm42的重组抗体或完全人抗体或其片段。在本发明的一个具体方面，包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体，可以用于方法中或以组合物施用以治疗或减轻中风或脑缺血。在本发明的一个具体方面，包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体，可以用于方法中或以组合物施用以治疗或减轻中风。在本发明的一个具体方面，包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体，可以用于方法中或以组合物施用以治疗或减轻脑缺血。在本发明的一个实施方案中，包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体，可以用于方法中或以组合物施用以改善病况诸如中风中的运动功能。包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体，可以用于方法中或以组合物施用以改善患有或疑似患有中风的动物中的运动功能。包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体，可以用于方法中或以组合物施用以改善已经具有中风或具有脑缺血的动物中的运动功能。在一个具体方面，如图5中所示，包含重链cdr序列cdr1ggsvslyy(seqidno：31)、cdr2gyiyssgst(seqidno：32)和cdr3arsasirgwfd(seqidno：33)以及轻链cdr序列cdr1qsissy(seqidno：34)、cdr2aas(seqidno：35)和cdr3qqsyhtpw(seqidno：36)的igm12、rigm12、抗体12用于治疗、预防或减轻中风或脑缺血。在其一个方面，包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体可以在其中确定、怀疑中风和/或脑缺血或处于中风和/或脑缺血的风险的情况下，包括其中可以施用或利用酶促溶栓剂，诸如组织纤溶酶原激活剂(tpa)或其他溶栓剂或抗血栓形成剂的情况下，进行施用。在本发明的一个方面，在其中神经受损、损伤或损害的情况、疾病或病况中或者在其中神经或神经元易于受损、损伤或损害或者有受损、损伤或损害风险的情形下，包含本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体可用于方法中或以组合物施用以改进或稳定神经功能或运动功能。在一个具体方面，抗体或其片段在疾病、创伤或病况的早期或初始阶段使用或施用，或在疾病、创伤或病况的进程或持续时间内重复，以利于或维持神经系统功能或运动功能的改进或稳定，包括或选自运动(例如步行)或认知功能(例如回忆或识别)。在本发明的一个方面，包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体可用于方法中或以组合物施用以减缓或减轻中风或脑缺血事件中的神经影响、缺陷、损害或神经元细胞死亡。根据该方法，所述抗体减轻一种或多种功能或可评价的神经或运动参数，包括可评估的或可量的参数例如中风量表(scale)或功能量表。抗体的施用有效改善或减轻一种或多种与中风相关的症状或参数，包括例如，上下肢运动功能、肢体共济失调、感觉功能、语言、声音清晰度、注意力、注视和视觉功能、手臂、手和腿部力量和运动中的一种或多种。本发明的方法可包括施用多于一种抗体或片段，包括抗体igm12和42的组合。在本发明的一个方面，提供包括施用一种或多种抗体或其片段的方法，其中抗体包含(a)可变重链氨基酸cdr结构域序列cdr1ggsvslyy(seqidno：31)、cdr2gyiyssgst(seqidno：32)和cdr3arsasirgwfd(seqidno：33)及轻链cdr序列cdr1qsissy(seqidno：34)、cdr2aas(seqidno：35)和cdr3qqsyhtpw(seqidno：36)，或(b)可变重链氨基酸cdr结构域序列cdr1gftfstya(seqidno：37)、cdr2invggvtt(seqidno：38)和cdr3vrrsgpdrnsspadf(seqidno：39)及轻链cdr序列cdr1qgig(seqidno：40)、cdr2tts(seqidno：41)和cdr3qkynsaprt(seqidno：42)。在又一个此类方法中，抗体igm12和/或抗体igm42的一种或多种可与另一种cns活性抗体组合，特别包括抗体rhigm22和/或rhigm46的一种或多种。rhigm22抗体包含seqidno：43和44所示氨基酸序列，或这些seqid的cdr。rhigm46抗体包含seqidno：45和46所示氨基酸序列，或这些seqid的cdr。因此，抗体igm12和/或抗体igm42的一种或多种可与一种或多种包含以下的髓鞘再生抗体组合：(a)包含cdr1序列ssgmh、cdr2序列v(i)isydgsrkyyadsvkg和cdr3序列gvtgsptldy的重链可变区cdr及包含cdr1序列sgsssnignnfvs、cdr2序列ditkrps和cdr3序列g(e)twdsslsavv的轻链可变区cdr；或(b)包含cdr1序列sgftfssyw、cdr2序列ikkdgsek和cdr3序列arpncggdcylpwyfd的重链可变区cdr及包含cdr1序列qsvlyssnnkny、cdr2序列ywas和cdr3序列qqyyntpqa的轻链可变区cdr。抗体的组合可在不同的时间和以不同的量或浓度共同或连续施用。可使用双特异性或多特异性抗体。在一个具体此类方面，通过联合施用或通过相隔短的持续时间或较长持续时间(包括数小时、数天或数周)的连续施用，将抗体12和/或42与抗体22和/或46和/或具有igm22或igm46的cdr区cdr1、cdr2和cdr3序列的抗体组合施用。在一个此类具体方面，通过联合或连续施用，将抗体12和/或42与抗体22和/或46组合施用用于治疗或减轻涉及神经变性的疾病或病况，特别包括脱髓鞘。在又一个此类方面，通过联合或连续施用，将抗体12和/或42与抗体22和/或46组合施用用于治疗或减轻脱髓鞘疾病或病况。在一个具体方面，通过联合或连续施用，将抗体12和/或42与抗体22和/或46组合施用用于治疗或减轻多发性硬化。在一个此类方面，在ms疾病的可测量临床方面，实现髓鞘再生和神经保护的联合作用，包括协同作用。鉴于本发明药剂的神经保护和/或神经再生能力，本发明还涉及产生和刺激神经元增殖的体外方法，包括皮质神经元、海马神经元、小脑颗粒细胞和视网膜神经节细胞的增殖。此类增殖的神经元可适于移植和神经细胞治疗方案和方法。本发明的诊断效用延伸到本发明的抗体在表征cns神经损伤或损害或者筛查或评价涉及神经损伤、损害或死亡(包括坏死性或凋亡性死亡)的疾病或病况的测定法和方法中的用途，包括体外和体内诊断和成像测定法。因此，所述抗体可用于测定和方法中以评价中风或缺血和/或评估缺血或中风或预测的或怀疑的缺血或中风后的损伤。在免疫测定中，可制备控制量的抗体等，并用酶、特异性结合配偶体、配体、染料、荧光标签和/或放射性元素标记抗体，然后可引入细胞样品中。在标记材料或其结合配偶体有机会与样品中的部位起反应后，所得质量可通过已知技术检查，这随所连接的标记的性质而变化。在体内诊断或成像应用中，可制备抗体或其神经元结合片段，并用酶、特异性结合配偶体、配体、染料、荧光标签和/或放射性元素标记所述抗体或其神经元结合片段，然后可引入动物中。在标记材料或其结合配偶体有机会与动物内的部位起反应后，可通过已知技术检查动物，这随所连接的标记的性质而变化。在本发明的诊断效用的方面，本发明的抗体或其活性片段可用于测定和方法中以表征脑缺血或中风。具体而言，在其中疑似脑缺血或中风或有脑缺血或中风风险的情况下，本发明的抗体可用于确定或评价脑缺血和或/中风。放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，可用于体外诊断技术和体内放射性成像技术。在本发明的又一个方面，放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，特别是放射性免疫缀合物，可用于放射性免疫疗法，特别作为用于神经损伤修复、神经再生、神经变性恢复、癌症或cns肿瘤疗法的放射性标记的抗体，或在某些情况下备选地用于受损害神经组织或神经元的切除。在体内方面，抗体或其神经元结合片段是标记的，并在手术或手术技术(包括立体定向术或最小侵入性技术)之前、期间或之后施用于动物，用于定位神经损伤或评价其余受损害或受损伤的神经组织的目的。在一个此类方面，放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，可用于放射免疫导向手术技术，其中它们可在靶向、鉴定或除去此类细胞的手术之前、期间或之后，鉴定和表明受损、受损害、受损伤或濒死神经细胞或神经元或神经组织的存在情况和/或位置。免疫缀合物或抗体融合蛋白包括在本发明中，其中本发明的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，与其他分子或药剂缀合或连接，其进一步包括但不限于与神经活性药物、化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性剂、化疗剂或药物缀合的结合成员。本发明包括可以试验试剂盒的形式制备的测定系统，其用于定量分析例如受损害、受损或受损伤神经元的存在程度或定量测定样品中的神经元。系统或试验试剂盒可包括通过本文所述的放射性技术和/或酶技术之一，使标记与抗体偶联而制备的标记组分，以及一种或多种其他的免疫化学试剂，任选其中至少一种是游离或固定的组分或其结合配偶体。可在药物组合物中制备本发明的抗体，且在一个具体的实施方案中为包含本文图5和图6提供的重链和/或轻链序列的重组抗体，或其活性片段和来源于其中、特别包含图5和图6所述cdr区序列的单链、重组或合成抗体，所述药物组合物包括合适的媒介物、载体或稀释剂，用于在其中疗法是适宜的情况下施用，以例如治疗或减轻涉及神经元受损、损害、损伤或死亡的病况或疾病。此类药物组合物还可包括通过本领域已知方法(诸如聚乙二醇化)调节抗体或片段的半衰期的方法。此类药物组合物还可包含其他抗体或治疗剂。本发明还包括与其他分子或药剂共价连接或以其他方式结合的抗体及其片段。这些其他分子或药剂包括但不限于具有截然不同的识别特征的分子(包括抗体或抗体片段)、毒素、配体、神经活性剂和化疗剂。在另一个方面，本发明的抗体或片段可用来靶向或导向治疗分子或其他药剂，例如使分子或药剂靶向神经元，例如靶向皮质神经元、海马神经元、视网膜神经节细胞或小脑颗粒细胞，包括伤口部位、缺血部位、肿瘤部位、炎症区域或神经变性病灶。本发明的抗体或片段可用于靶向或引导治疗性分子或其他药剂，例如将分子或药剂靶向至脑缺血或中风的部位。从接下来的参照下列说明性附图和随附权利要求书进行的详述来看，其他目的和优势对本领域技术人员而言将是显而易见的。附图说明图1：人igm与多种类型的神经元表面结合。shigm42(a)和rhigm12(c)与共表达神经丝(nf)(b和d)的活的皮质神经元表面结合。在培养基中与10μg/mligm孵育10分钟过程内，将细胞保持在冰上。将细胞固定，洗涤，用抗人μ链fab’2-fitc第二ab检测人igm。内部nf以特有的节段模式存在。使皮质细胞在聚鸟氨酸包被的盖玻片上的神经基础b27培养基中生长6天。并非所有的皮质神经元均表达nf，但是igm与培养物中的所有神经元结合。rhigm12(e绿色)和shigm42(f绿色)与共表达神经丝(nf，红色)的活的小鼠海马神经元表面结合。使海马神经元在聚赖氨酸包被塑料上的神经基础b27培养基中生长1周。使自人颞叶切除而分离的细胞在dmem/f12/n2/b27中生长21天。rhigm12与也是βiii微管蛋白阳性(f，得自promega的抗βiii)的细胞表面结合(g)。图2.人igm以截然不同的模式标记小脑颗粒细胞表面。使在培养1天的大鼠小脑颗粒细胞与10μg/ml人血清来源的igm、shigm12或shigm42在培养基中在冰上活着孵育15分钟。在用4％低聚甲醛洗涤和固定后，使细胞在室温下与fitc缀合的抗人μ链抗体一起孵育，并使用免疫荧光显微镜成像。使用这两种抗体的神经元膜标记的模式不同。神经突膜的短区被shigm12结合，导致清楚的点状模式。神经突膜的较大区被shigm42结合，导致节段模式。放大倍数为400x。图3.神经元结合性人igm、rhigm12和shigm42保护培养中的皮质神经元免于过氧化物诱导的细胞死亡。培养3天的小鼠神经元用含或不含10μg/ml人igm的500nmh2o2或盐水处理30分钟。细胞用新鲜的神经基础b27培养基洗涤，24小时后，使用flica胱天蛋白酶-3测定试剂盒(immunochemistrytechnologies935)，检测一式三份处理的96孔中胱天蛋白酶-3的表达。条形柱表示免于胱天蛋白酶3活化的保护％。图4表示用于产生重组抗体的可扩增载体。这是用于产生基于shigm22(rhigm22)的重组抗体的载体图，该载体经修饰以产生重组igm12和igm42。对于在cho细胞中表达，vh启动子用e1a启动子置换。cλ轻链恒定区用κ轻链恒定区cκ置换。图5表示重组载体中的igm12抗体氨基酸和核酸序列。重链氨基酸序列和编码核酸序列呈灰色，提供并标出vh的每一个和恒定区序列ch1、ch2、ch3和ch4。轻链氨基酸序列和编码核酸序列呈紫色，标出可变vl和恒定cl(κ)序列。注释了重链和轻链可变区的cdr区序列。在氨基酸和核酸序列中标示了人j链。图6表示重组载体中的igm42抗体氨基酸和核酸序列。重链氨基酸序列和编码核酸序列呈灰色，提供并标出vh的每一个和恒定区序列ch1、ch2、ch3和ch4。轻链氨基酸序列和编码核酸序列呈紫色，标出了可变vl和恒定cl(κ)序列两者。注释了重链和轻链可变区的cdr区序列。图7.重组rhigm12改进患tmev诱导性疾病的小鼠中的缺陷。在100μgshigm12的单一i.p.剂量后3周，平均每小时自发性夜间活动(当小鼠有正常活动性时)改变。在tmev感染后90天各组5只sjl小鼠用rhigm12(红色条形柱)或对照人igm(黑色条形柱)治疗，在accuscan活动监测箱中按组每周监测3天。将3个夜间时段内的每小时夜间水平活动的平均值±sem与igm治疗前3个夜晚的夜间活动进行比较。在单剂量的rhigm12治疗后3周-7周存在与治疗前水平相比夜间活动增加(p＜0.01)，但用对照治疗后无增加。对未感染年龄匹配小鼠的运动水平作图用于比较(绿色条形柱)。图8.在小鼠脑干采集的mrs光谱。上小图表示从中采集信号的三维像素。定位该目标区域使用解剖界标。极短mri扫描用来获取3个正交平面的图像以定位脑干上的2.5mm3立方体(上小图)。小鼠脑干的300mhz，1h光谱(下小图)。容易地鉴定出胆碱(cho)、肌酸(cr)和n-乙酰基-天冬氨酸(naa)峰。光谱参照水(在4.7ppm)。图9.脑干naa水平降低与轴突丧失增加有关。用tmev感染后0-270天，对10只sjl小鼠进行了前瞻性研究。获得每只小鼠脑干的mrs，并测定naa浓度(上)。在病毒感染后90天(通过横切面的直接计数显示大轴突丧失的点)，在达到统计显著性下降的所有小鼠中记录到naa逐渐降低(2)。在疾病持续期间，naa水平保持低下。未感染小鼠(黑色条形柱)、感染后90天(灰色)和270天(白色)以t6水平计数的绝对轴突(下)。图10.在单剂量的人igm后脑干中的naa。tmev感染后90天，当naa水平开始下降，且可检测到大轴突丧失时，向各组10-15只sjl小鼠i.p.施用单次100μg剂量的shigm12、shigm42、对照人igm或盐水(pbs)。在治疗前和治疗后5周和10周，收集脑干的mrs。由这些光谱计算naa水平。在shigm12和shigm42治疗组中，与治疗前水平相比，naa在5周后(p＝0.005，p＝0.029)和在10周(p＜0.001，p＝0.037)增加。在用对照试剂治疗的各组小鼠中是稳定的或趋于向下。该图表示脑干三维像素naa水平的平均值+/-sem。图11.与神经元结合的人igm不改变脱髓鞘、髓鞘再生或炎症。各组5只慢性tmev感染小鼠用单次100μg剂量的人igm治疗。在治疗后10周，所有组包括相同程度的脊髓炎症(黑色条形柱)和脱髓鞘(红色条形柱)。如所预期的一样，用少突胶质细胞结合性igm、rhigm22治疗的小鼠，显示较多髓鞘再生(绿色条形柱)。shigm12和shigm42不促进脊髓髓鞘再生。这表明体内有保护轴突的多种方式。图12.静脉内注射后cd-1小鼠循环中的神经元结合性人igm的血清半衰期。夹心elisa用来定量测定48小时内小鼠血清的人μ链的衰变。碱性磷酸酶底物(sigma104)的od405平均值获自该方法。绘制每组3只小鼠的血清和标准误差。图13.35s标记的rhigm12进入tmev感染和未感染sjl小鼠的脑和脊髓。将35s标记的rhigm12i.p.施用于5个月tmev感染的和年龄匹配的未感染sjl小鼠。4小时后，一对小鼠用盐水灌注，急速收获组织，称重，用剃刀切碎，并与10ml闪烁液(ultimagoldlsc)混合。在24小时时重复相同步骤。48小时后，使组织增溶，将小瓶在beckman闪烁计数器中计数1分钟。对每只小鼠的全脑和脊髓总计数绘图。小瓶中无组织的背景计数为12个计数。图14.神经元结合性人igm体内靶向脊髓病变。向患慢性tmev诱导的脊髓脱髓鞘的小鼠腹膜内施用1.0mgshigm42(a)、rhigm12(b)或对照人单克隆igm(c)。4小时后，小鼠用4％低聚甲醛灌注，取出脊髓，冷冻切片，使用针对人μ链的fitc缀合的fab’2片段(jacksonimmnoresearch)免疫标记。来自接受shigm42或rhigm12的小鼠的脊髓在病变中含有人igm。病变中几乎未发现对照人igm。下小图为h/e染色以显现炎性细胞和病变。我们得出的结论是，在tmev模型中某些人igm可穿过bbb。图15.神经元结合性人igm定位于脊髓病变中神经丝+(nf)轴突。向患慢性tmev诱导的脊髓脱髓鞘的小鼠腹膜内施用1.0mgigm，4小时后处死。将脊髓纵向冷冻切片，用fitc缀合的抗人μ链fab’2片段(绿色)和抗-nf(smi-32和34，红色)免疫标记，接着用trict缀合的第二抗体免疫标记。合并的共聚焦图像证实shigm42(a)与长nf+纤维(b)共定位，在(c)中合并。rhigm12(d，绿色)也与nf+结构(d，红色)例如横切轴突纤维束共定位。图16.rhigm12和shigm42不会使eae临床评分变差。在每只小鼠达到1的临床评分(尾无力)时，向患mog肽诱导的eae的各组10只c57bl6小鼠i.v.施用单次100μg剂量的rhigm12、shigm42、对照人igm或盐水，且每隔一天进行监测直到免疫后28天。图为每个治疗组的平均临床评分的平均值+/-sem。平均临床评分的秩的anova(anovaonranks)表明组间无差异(p＝0.14)。图17.rhigm12和shigm42不加重eae脊髓病理。在图13的研究结束时，取出脊髓，切成1mm块，从每3个的连续块中切取横切面，用erichrome染色以显现病理。不知情地对10个横切面/小鼠(40象限(quadrant))进行分级。炎症(p＝0.825)或脱髓鞘(p＝0.766)在组间无差异。图18.rhigm12促进神经突增生使e15海马神经元在聚-d-赖氨酸(pdl)(a)或rhigm12(b)硝酸纤维素包被的盖玻片上生长。接种(plating)细胞后12小时，将这些神经元固定，并用β3-微管蛋白抗体(a1和b1，绿色)和德克萨斯红鬼笔环肽(a2和b2)染色。a3-b3是a1-a2和b1-b2的重叠，其中核用dapi(蓝色)染色。c、d和e显示总的(c，p＝0.0056)、最长(d，p＜0.0001)和次最长(e，p＝0.0782)神经突长度的测量值。与具有多个对称神经突的接种在对照pdl基质上神经元相比(72％相对于18％)，在rhigm12上生长的神经元带有较少神经突(f，p＜0.0001)，且大多数为3期神经元(g)。统计分析显示平均值±sem(非配对t检验)。图19.rhigm12驱动轴突形成海马神经元在接种在pdl(a)、pdl+层粘连蛋白(b)或rhigm12(c)的基质上后12小时用tau1(a1-c1，绿色)或map2(a2-c2，蓝色)染色。a3-c3是a1-c1和a2-c2的重叠，将f-肌动蛋白(红色)用德克萨斯红鬼笔环肽标记。d-f显示在通过短划线标示的a1-c1中，沿自细胞体到生长锥的最长神经突的相对tau1强度。tau1染色不对称地富集在于rhigm12和层粘连蛋白基质两者中生长的3期神经元中的最长神经突远部。图20.rhigm12结合识别神经元膜在固定后，将div3海马神经元用rhigm12、霍乱毒素b(ctb，alexafluor594)和菲律宾菌素三重染色(a)。rhigm12(a1)均匀地标记神经元表面，其模式类似于分别用ctb或菲律宾菌素标记的gm1(a2)或胆固醇(a3)的模式。然而，用rhigm12在37℃下处理30分钟后，膜结合的rhigm12在神经元表面聚集(b1-c1)。用rhigm12处理导致胆固醇(b2)和gm1(c2)两者的群聚，其与聚集的rhigm12共定位(b3-c3)。b和c底部的下小图是方框标示区域的更高放大倍数，表明生长锥区中聚集的rhigm12(绿色)与群聚的胆固醇(蓝色)或gm1(红色)共定位。图21.rhigm12与神经元膜微结构域中的gm1共定位a.div1海马神经元首先用4％低聚甲醛固定，然后经rhigm12染色。rhigm12标记较小的点结构(punctumstructure)。b.将活的div1海马神经元冷却到4℃达30分钟，然后用rhigm12标记，接着用抗β-iii-微管蛋白抗体染色(在固定后)。rhigm12使神经元表面上大得多的点形成染色。c.活的div3海马神经元用甲基-β-环糊精在37℃下处理30分钟以消耗胆固醇，然后冷却至4℃。固定的神经元然后用rhigm12(绿色)和霍乱毒素b(红色)染色。rhigm12与较大的点(其与由霍乱毒素b标记的gm1共定位)结合。下小图显示方框标示区域的更高放大倍数。图22.rhigm12与脂筏结合使活的div7皮质神经元在4℃下与rhigm12或对照igm抗体结合30分钟。a.神经元在抗体结合后洗涤3次，在含有0.5％np-40的缓冲液中裂解。裂解物通过在4℃下微量离心分离，上清液和沉淀两者用抗人igm第二抗体进行印迹法。与不与神经元结合并洗掉的对照igm抗体相比，rhigm12在沉淀和上清液两者中均有分布。下小图显示加载等量的蛋白质的各个考马斯染色凝胶。b.在含有1％tritonx-100的缓冲液中裂解的神经元在4℃下以蔗糖梯度通过超速离心分级分离。相继针对rhigm12、窖蛋白-1、转铁蛋白受体、β3-微管蛋白(b3-tub)和β-肌动蛋白，用特异性抗体对所得级分进行印迹法。rhigm12位于含有窖蛋白-1和β3-微管蛋白的低密度级分。较高密度级分含有转铁蛋白受体、β3-微管蛋白和肌动蛋白。一些rhigm12定位于去污剂不溶性沉淀，所述沉淀主要由微管蛋白中富含的细胞骨架蛋白构成。大部分肌动蛋白进入去污剂可溶性较高密度级分。图23.rhigm12与微管结合a.首先将div1海马神经元在37℃下用rhigm12处理30分钟，然后用含有4％低聚甲醛和0.1％tritonx-100的缓冲液同时固定并提取，接着针对rhigm12(绿色)、β3-微管蛋白(蓝色)和f-肌动蛋白(红色)进行染色。rhigm12结合去污剂不溶性分子，所述去污剂不溶性分子与沿神经突干(neuriteshaft)(a2和4)和在生长锥中心域的束状微管共定位，但不与位于生长锥周围的f-肌动蛋白共定位(a3和4)。b.使div7皮质神经元先结合rhigm12，然后在0.5％np-40中裂解。对上清液进行免疫共沉淀。rhigm12和β3-微管蛋白两者彼此免疫共沉淀。图24.提出的rhigm12促进轴突形成的机制a.神经元膜含有筏微结构域(raftmicrodomain)和非筏微结构域(nonraftmicrodomain)两种。在神经元膜均匀分布的筏微结构域分隔成两个库。它们之一与微管结合。b.rhigm12的结合诱导筏微结构域群聚，这促进了微管稳定并锚定神经元膜。c.在神经突增生期间，通过与rhigm12相互作用，生长锥探测环境，而筏微结构域群聚。结果，微管稳定于rhigm12接触部位并锚定神经元膜，这促进图3和图6中观察的生长锥周围至中心域转换，其中浸泡施用的(bath-applied)rhigm12在生长锥中心域聚集。图25.rhigm12不与微管蛋白直接结合a.n2a成神经细胞瘤细胞用rhigm12(a1，绿色)和β3-微管蛋白(a2，红色)染色。核用dapi(a3，蓝色)标记。n2a细胞是rhigm12染色阴性的，但表达β3-微管蛋白。b.将n2a细胞裂解物的上清液与rhigm12一起孵育，与rhigm12结合的分子被蛋白质-l琼脂糖拉下(pulleddown)，并进行western印迹法。rhigm12不与沉淀结合。β3-微管蛋白不被rhigm12拉下，但在上清液中检测到。图26.rhigm12拉下肌动蛋白，但不与f-肌动蛋白共定位a.在固定后，先将div1活的海马神经元在4℃下用rhigm12(a1，绿色)染色，将f-肌动蛋白(a2，红色)用德克萨斯红鬼笔环肽标记。在生长锥区，f-肌动蛋白收缩，且在中心域富集，而rhigm12使生长锥表面上点结构均匀染色，这就标记了生长锥的最边缘。b.少量肌动蛋白被rhigm12拉下，3种所测的抗肌动蛋白抗体无一在免疫沉淀反应中起作用。位于与β3-微管蛋白类似位置的条带是用空心箭头标示的igg重链。图27(a)细胞膜将在有数千纳米孔(大小为200nm)穿孔的薄金膜上重构。(b)悬浮金膜与两侧的缓冲溶液接触。图28.与神经元结合的人抗体促进神经突延伸。将神经元接种在用人igm包被的基质上，使之生长24小时后，用抗神经丝进行免疫标记。与非许可性人igm(b)相比，shigm42诱导增生(a)。图29.与神经元结合的人抗体使膜结构域群聚。在0℃下进行体细胞(soma)和轴突上的均匀免疫标记(a)。当细胞升温至15℃达15分钟时，shigm42定位在轴突细胞表面上更多的分散斑块上(b)。图30.促进神经突延伸的人抗体体内靶向损伤部位。将抗体i.p.施用于患有慢性sci的小鼠，4小时后取出脊髓，在脊髓横切面中检测人igm。来自施用抗体的小鼠的脊髓受损区显示结合带荧光标签的抗人igm的平行纤维(a)。来自施用对照人igm的小鼠的脊髓受损区不含人igm(b)。图31.脊髓挤压伤。显微照片显示来自对照小鼠(a)或8gfejota夹压迫后30天小鼠(b)的h&e染色脊髓的典型外观。压伤与广泛炎性细胞浸润、运动神经元丧失有关。图32.tmev感染小鼠自发性夜间活动的实例。a)在64天时间内水平活动原始完整记录。多夜间活动和少昼间活动易于理解。因为小鼠正常在夜间活动，因此我们选择夜间活动用于分析(6pm-6am)。然而，通过目视检查水平(b)或垂直(c)活动中的未过滤压缩记录，可能难以鉴定真实的长期改变。图33.单次i.p.剂量的神经元结合抗体(rhigm12)改善慢性感染sjl小鼠的水平活动。在90dpi将3组(5只sjl小鼠)放入accuscan活动监测箱。在8天时间内收集基线测量。在治疗后，在8周内连接监测小鼠。小图a、c和e对应于水平活动，b、d和f对应于垂直活动。a、b)作为每天的箱(bins)提供的平均夜间活动，表明仅在rhigm12治疗组的水平活动有改善；c)高斯滤波(gb＝2天)和e)标准化z值的6阶多项式拟合得出rhigm12治疗小鼠中清楚明显的改善。b、d和f)垂直活动不受任何治疗影响。活动(垂直标度)是每小时光束中断次数。参数gb可解释为半高时滤波器半宽的值(以天计)。随着gb值增加，标准差降低。给出每天的逐点95％置信带。图34.通过使用预测模型值在90dpi的3种治疗的比较。在治疗之前和之后每天进行统计分析。与对照igm治疗和盐水治疗小鼠相比，在治疗后第7天(p＝0.045)和第11天(p＝0.042)，rhigm12治疗小鼠的水平夜间活动分别显著偏离/改善(用黑色箭标示)。给出每天的逐点95％置信带。图35.当在疾病早期施用时rhigm12改善sjl小鼠的水平和垂直两种活动。在45dpi将5只sjl小鼠3组放置在accuscan活动监测箱中。在8天时间内收集基线测量。在治疗后，在8周内连接监测小鼠。小图a、c、e和g对应于水平活动，b、d、f和h对应于垂直活动。a、b)水平和垂直活动的原始未滤过记录；c、d)作为每天的箱(bins)提供的平均夜间活动；e、f)高斯滤波(gb＝2天)；和g、h)标准化z值的6阶多项式拟合显示rhigm12治疗组中水平和垂直两种活动皆改善。对照igm治疗组和盐水治疗组显示整个研究中运动活动水平相似。给出每天的逐点95％置信带。图36.通过使用预测模型值在45dpi的3种治疗的比较。在治疗之前和之后每天进行统计分析。a、c)与对照igm治疗和盐水治疗小鼠相比，治疗后第13天(p＝0.015)和第9天(p＝0.036)，rhigm12治疗小鼠的水平夜间活动分别显著偏离。b、d)治疗后第14天(p＝0.019)和第6天(p＝0.037)，rhigm12治疗小鼠的垂直(直立(rearing))活动分别偏离/改善。黑色箭头表示开始显著改善的日期。给出每天的逐点95％置信带。图37.正常未感染sjl小鼠具有不受任何治疗影响的高度可变的自发活动。将5只未感染sjl小鼠3组放入accuscan活动监测箱。在8天时间内收集基线测量。在治疗后，在8周内连接监测小鼠。任何治疗都不引起水平(a、c、e和g)或垂直(b、d、f和h)活动改变。给出每天的逐点95％置信带。图38.单剂量的人抗体延长sod1g86r突变体转基因小鼠的存活。在55日龄时，小鼠用单剂量的rhigm12或pbs治疗。一些小鼠则未治疗。跟踪小鼠直到濒死，然后处死用于病理学。一些小鼠死于疾病。所有小鼠在死亡前都有极度的体重减轻。使用kaplan-meir曲线绘制存活率，使用非参数mantel-cox检验确定统计显著性。与pbs治疗或未治疗小鼠相比，用rhigm12治疗的小鼠中存活率提高，p＝0.008。所有分析和治疗以不知情方式进行，使得做出处死小鼠决定的研究人员不了解治疗组。在该分析中研究了共45只小鼠。同窝野生型sod+/+小鼠具有正常的存活率且无体重减轻(数据未显示)。图39表示在50日龄时施用单次200μg剂量的rhigm12的小鼠与施用pbs的对照小鼠中，g86rsod1小鼠的体重减轻作为时间的函数。施用rhigm12的小鼠显示在单次抗体注射后，在60天时间内较少体重减轻。图40.sod1g86r突变体转基因小鼠中单剂量的人抗体减少脊髓轴突变性。在55日龄时，小鼠用单次250μg剂量的rhigm12或pbs治疗。一些小鼠则未治疗。在位于胸正中水平的脊髓中，统计变性轴突特有的髓磷脂螺环(whorl)的数目。与pbs治疗(p＝0.003，t检验)和未治疗小鼠相比，用rhigm12治疗的sod1突变体小鼠的变性轴突数减少。注意，与sod1+/+突变体小鼠相比，野生型sod-/-小鼠脊髓中的变性轴突数最少。在处死时，小鼠用trump固定液(4％甲醛，0.1％戊二醛(gluataraldehyde))灌注，将脊髓切成1mm块。将块包埋在araldite塑料中，将来自t6水平的1微米切片用对苯二胺染色以显现髓磷脂环绕(wrapping)。显示野生型sod-/-(右上)和sod1+/+突变体(右下)的脊髓切片。图41.单剂量的人抗体保护sod1g86r突变体转基因小鼠脊髓中的前角和后角神经元两者。在55日龄时，小鼠用rhigm12或pbs治疗。一些小鼠则未治疗。在胸正中水平处脊髓的石蜡切片中，统计用特异性标记神经元的抗neun抗体染色的前角和后角细胞数目。rhigm12治疗小鼠中前角和后角细胞的数目比用pbs治疗的小鼠或未治疗小鼠显著更多(p＝0.0025和p＝0.018，通过t检验)。用rhgm12治疗的sod突变体小鼠的前角和后角细胞的数目与野生型sod-/-小鼠中观察到的数目类似。图42.重组人抗体rhigm12与各物种的神经元结合。小鼠皮质神经元(a、b、c、d)、小鼠海马神经元(e、f)和人皮质神经元(g、h)用rhigm12(a、c、e和g)活染，相同细胞用抗神经丝抗体(b、d)或β微管蛋白(f、g)共标记。rhigm12用带荧光标签的第二抗体检测。图43.cd-1小鼠中的脑缺血。a.显示24h时脑缺血区域(高信号区域)的dwi-mri图像扫描。b.脑缺血之后小鼠脑上的缺血性损伤(脑右半球上的灰白圆形区域)。c.显示受损组织(黑色突出显示)的x4h&e切片。图44.神经元结合抗体(rhigm12)的单次i.p.剂量改善经受光血栓形成脑缺血的cd1小鼠中的水平(a)和垂直(b)活动。小鼠用200μgrhigm12(n＝5)或pbs(n＝5)的单次剂量治疗。rhigm12治疗组中的活动从第三天改善。c.在小动物mri系统中扫描小鼠，以测量图中表示为mm3的脑缺血的总体积。图45.mt-mri量度表明改善结果。使小鼠经受脑缺血并用rhigm12或pbs治疗。缺血性损伤后三天，计算脑的缺血(红色轮廓)和对侧(绿色轮廓)半球的mtr图(a小图)。与用pbs治疗的组相比，用rhigm12治疗的组表明中风roi内mtr的相对增加(小图b，蓝色条代表在对照侧上计算的值)和中风体积的降低(小图c)。图46.在聚-d-赖氨酸上生长5天且在缺氧条件(2.7％o2，5％co2)下孵育4-44小时的皮层神经元(cn)的western印迹分析。显示与对照(44小时，在印迹中孵育0小时)相比缺氧处理4小时、21小时和44小时之后裂解的胱天蛋白酶-3的水平的代表性印迹。图47描绘了显示来自使用髓鞘标志物mbp和凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3的三次独立实验的western印迹的定量分析的条形图。使混合胶质细胞培养物在含有fbs(10％)的培养基中生长4天，并在具有促进髓鞘再生的igmrhigm22、再生的mabrhigm12、同种型对照shigm116(各10μg/ml)的化学定义的培养基或仅培养基中处理7天。每两天更换具有新鲜抗体的培养基。在4天结束时，使用western印迹评价培养物的mbp或胱天蛋白酶-3，通过od/面积定量，并绘图。图48提供了显示各种蛋白和标志物的水平的代表性western印迹：少突胶质细胞祖细胞(opc)标志物pdgfαr、髓鞘标志物cnpase和mog、小胶质细胞标志物cd68和lyn、增殖标志物ki-67和组蛋白h3、凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3和细胞周期标志物prbs795。将opc-小胶质细胞共培养物在具有促进髓鞘再生的mabsa2b5、o4、o1、78.09、94.03、rhigm22，再生的mabrhigm12，同种型对照(leaf、5a5、chrompureigm、rhigm42、shigm14、shigm24、shigm26)(各10μg/ml)的星形胶质细胞条件培养基或培养基中培养，如所示。图49描绘了显示来自使用标志物cd68(用于活化的小胶质细胞)和lyn激酶(小胶质细胞中的高丰度激酶，在opc中程度较低，但在星形胶质细胞中不存在)的三次独立实验的western印迹的定量分析的条形图。混合培养物(opc小胶质细胞共培养物)用如上对于图48所述的抗体处理并标明。图50提供了代表性免疫荧光图像，其显示在mab处理之前培养第4天和用rhigm12、rhigm22和同种型对照shigm24(各10μg/ml)处理7天之后培养第11天混合胶质细胞培养物中cd68(绿色)和核标志物dapi(蓝色)的水平。图51提供了显示缺氧诱导因子1(hif1α)、少突胶质细胞标志物ng2、pdgfα、olig-2、髓鞘标志物mbp和cnpase、星形胶质细胞标志物gfap、小胶质细胞标志物cd68、细胞周期标志物prbs795和凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3的水平的代表性western印迹，其中β肌动蛋白用作上样对照。使混合胶质细胞培养物在含有fbs(10％)的培养基中生长4天，并在缺氧条件(3％o2)(与常氧条件(21％o2)相比)下在化学定义的培养基中处理直至额外7天。如所示在第1、3、5和7天通过western印迹评价蛋白。图52描绘了图51的western印迹的定量分析，以提供蛋白标志物的表达的定量值和蛋白标志物的缺氧和常氧条件的比较。图53提供了增殖标志物ki-67、小胶质细胞标志物iba-1、cd68和inos、凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3、星形胶质细胞标志物gfap、细胞周期标志物prbs795和prbs80、少突胶质细胞标志物pdgfαr、ng2、olig-1和olig-2和髓鞘标志物mbp的代表性western印迹。使混合胶质细胞培养物在常氧条件下在含有fbs(10％)的培养基中生长4天，随后在缺氧(3％o2)下在具有人再生抗体rhigm12的化学定义的培养基或仅培养基中处理1-7天。图54提供了显示在常氧和缺氧条件下生长且用rhigm12或rhigm22抗体处理(相比于单独的培养基)的第7天混合培养物中小胶质细胞标志物iba-1和cd68、细胞凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3、星形胶质细胞标志物gfap、少突胶质细胞标志物pdgfαr、ng2、olig-2和髓鞘标志物mbp和cnpase的水平的代表性western印迹。将混合胶质细胞如前所述培养，并在缺氧或常氧条件下在具有rhigm12、rhigm22的化学定义的培养基或仅培养基中处理7天。图55提供了来自p13的缺氧和常氧c57/b16新生小鼠的皮层的各种标志物的rt-pcr分析。c57/b16新生小鼠通过cd1母兽(dams)交叉培育，并从p3至p7暴露于缺氧(10％o2)4天。随后将小鼠暴露于室内空气，持续额外6天，并在p13处死。从两个处理组的皮层中分离rna，并探测髓鞘标志物plp1、mog、mbp1、少突胶质细胞祖细胞标志物pdgfαr和olig-1、星形胶质细胞标志物gfap、神经元标志物巢蛋白和β3-微管蛋白、缺氧诱导因子1α和肌长蛋白蛋白sspn。表达水平通过rt-pcr分析，并将结果针对β肌动蛋白的水平均一化。图56提供了表明如各小图中所注来自对照(假操作)和中风小鼠(孟加拉玫瑰红方案)的各种组织中放射性标记的rigm12抗体(如所示通过放射性测量为cpm/100μl)的量的图。在中风后30至40min，将500ul体积盐水中10百万cpm的35s标记的rhigm12(约60ugigm)腹膜内施用于每只小鼠。在igm处理后6、12和24小时，从小鼠收集血液，用30ml生理盐水洗涤脉管系统，并快速收集组织。对于中风组织中放射性标记的分析，将含有病变区域的脑右前皮质去除，作为75mg组织块(在小图中表示为脑)。去除一部分其他组织，称重并处理。cb＝小脑，cord＝脊髓。发明详述根据本发明，可采用本领域技术人员所掌握的常规分子生物学、微生物学和重组dna技术。此类技术在文献中有完整解释。参见例如sambrook等人，″molecularcloning；alaboratorymanual″(1989)；″currentprotocolsinmolecularbiology″vdumesi-iii[ausubelr.m.，ed.(1994)]；″cellbuology：alaboratoryhandbook″volumesi-iii[j.e.celis，ed.(1994))]；″currentprotocolsinimmunology″volumesi-iii[coligan，j.e.，ed.(1994)]；″oligonucleotidesynthesis″(m.j.gaited.1984)；″nucleicacidhybridization″[b.d.hames&s.j.higginseds.(1985)]；″transcnptionandtranslation″[b.d.hames&s.j.higgins，eds.(1984)]；″animalcellculture″[r.i.freshney，ed(1986)]；″immobilizedcellsandenzymes″[irlpress，(]986)]；b.perbal，″apracticalguidetomolecularcloring″(1984)。因此，下列术语如果在本文中出现，则将具有如下给出的定义。a.术语术语“特异性结合成员”描述了彼此具有结合特异性的一对分子的成员。特异性结合对的成员可以是天然来源的或者完全或部分合成产生的。该分子对的一个成员在其表面上具有区域或腔，或其表面上具有组分，其与分子对的另一个成员的特定空间和极性组构特异性结合，因此与分子对的另一个成员的特定空间和极性组构互补。因此该对的成员具有彼此特异性结合的性质。特异性结合对的类型的实例为抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本申请涉及抗原-抗体型反应。术语“抗体”描述了不管是天然的还是部分或完全合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖具有结合结构域的任何多肽或蛋白质，所述结合结构域是抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源。该术语还考虑cdr移植抗体。“抗体”是任何免疫球蛋白，包括结合特定表位的抗体及其片段。该术语包括多克隆、单克隆和嵌合抗体，最后提及的更详细描述于美国专利号4,816,397和4,816,567。该术语“抗体”包括野生型免疫球蛋白(ig)分子，一般包含4条全长多肽链，2条重(h)链和2条轻(l)链，或其等同的ig同源物(例如只包含重链的骆驼(camelid)纳米抗体)；包括其保持ig分子的基本表位结合特征的全长功能性突变体、变体或衍生物，并且包括双重特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和双重可变结构域抗体；免疫球蛋白分子可为任何类别(例如igg、ige、igm、igd、iga和igy)或亚类(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。还包括在术语“抗体”含义内的有任何“抗体片段”。“抗体片段”意指包含至少一个不是全长的多肽链的分子，包括(i)fab片段，其是由可变轻链(vl)、可变重链(vh)、恒定轻链(cl)和恒定重链1(ch1)结构域组成的单价片段；(ii)f(ab′)2片段，其是包含在铰链区通过二硫桥连接的2个fab片段的二价片段；(iii)fab(fd)片段的重链部分，其由vh和ch1结构域组成；(iv)可变片段(fv)片段，其由抗体单臂的vl和vh结构域组成，(v)结构域抗体(dab)片段，其包含单一可变结构域(ward，e.s.等人.，nature341,544-546(1989))；(vi)骆驼抗体；(vii)分离的互补决定区(cdr)；(viii)其中vh结构域和vl结构域通过肽接头连接的单链fv片段，所述接头允许两个结构域结合形成抗原结合位点(bird等人，science，242，423-426，1988；huston等人，pnasusa，85,5879-5883，1988)；(ix)双体(diabody)，其是二价双特异性抗体，其中vh和vl结构域在单一多肽链上表达，但是使用太短的接头使得在相同链上的两个结构域之间无法配对，从而迫使结构域与另一条链的互补性结构域配对，并产生两个抗原结合位点(wo94/13804；p.holliger等人proc.natl.acad.sci.usa906444-6448,(1993))；和(x)线性抗体，其包含串联fv区段对(vh-ch1-vh-ch1)，它与互补性轻链多肽一起形成抗原结合区对；(xi)多价抗体片段(scfv二聚体、三聚体和/或四聚体(power和hudson，jimmunol.methods242：193-2049(2000))；以及(xii)单独或以任何组合的重链和/或轻链的其他非全长部分或其突变体、变体或衍生物。因为抗体可以多种方式修饰，因此术语“抗体”应解释为涵盖任何特异性结合成员或具备具有所需特异性的结合结构域的物质。因此，该术语涵盖抗体片段、衍生物、抗体的功能性等同物和同源物，包括包含不论是天然还是完全或部分合成的免疫球蛋白结合结构域的任何多肽。因此包括包含与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达描述于ep-a-0120694和ep-a-0125023和美国专利号4,816,397和4,816,567。“抗体结合位点”是由轻链或特异性结合抗原的重链和轻链可变区和超变区构成的抗体分子的结构部分。本文所用的呈其不同语法形式的短语“抗体分子”考虑完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分两者。示例性的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、基本完整的免疫球蛋白分子和含有互补位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域已知的那些部分，如fab、fab′、f(ab′)2和f(v)，所述部分优选用于本文所述治疗方法。抗体还可以是双特异性的，其中抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合成员，另一个结合结构域具有不同的特异性，例如募集效应子功能等。本发明的双特异性抗体包括其中抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合成员(包括其片段)，另一个结合结构域是截然不同的抗体或其片段，包括截然不同的抗癌或抗肿瘤特异性抗体的结合结构域。另一个结合结构域可以是识别或靶向特定细胞类型的抗体，如神经或神经胶质细胞特异性抗体。在本发明的双特异性抗体中，本发明抗体的一个结合结构域可与识别特定细胞受体和/或以特定方式调节细胞的其他结合结构域或分子组合，所述其他结合结构域或分子例如免疫调节剂(例如白介素)、生长调节剂或细胞因子(例如肿瘤坏死因子(tnf)，特别是2002年2月13日提交的u.s.s.n.60/355,838所示tnf双特异性形式，该文献以其整体结合到本文中)或毒素(例如蓖麻毒蛋白)或抗有丝分裂剂或抗凋亡剂或因子。因此，本发明的抗fap抗体可用来使药剂、标记、其他分子或化合物或抗体导向或靶向间质部位，特别是伤口愈合、炎症、癌症或肿瘤的区域。呈其不同语法形式的短语“单克隆抗体”是指只具有一种能够与特定抗原进行免疫反应的抗体结合位点的抗体。因此单克隆抗体通常对与之起免疫反应的任何抗原显示单一结合亲和力。单克隆抗体还可含有具有多个抗体结合位点的抗体分子，其对不同的抗原各为免疫特异性；例如双特异性(嵌合)单克隆抗体。术语“抗原结合结构域”描述了包含与抗原的部分或全部特异性结合和互补的区域的抗体部分。如果抗原大，则抗体可只与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。可通过一个或多个抗体可变结构域提供抗原结合结构域。优选抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。本发明的免疫缀合物或抗体融合蛋白(其中用于本发明的抗体、抗体分子或其片段与其他分子或药剂缀合或连接)还包括但不限于与以下缀合的此类抗体、分子或片段：化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性剂、化疗剂、抗微生物剂或肽、细胞壁和/或细胞膜破碎剂或药物。术语“特异性的”可用来指其中特异性结合对的一个成员对不是其特异性结合伴侣的分子将不显示任何明显结合的情形。在例如抗原结合结构域对多种抗原携带的特定表位有特异性时，该术语同样适用，在此情况下携带抗原结合结构域的特异性结合成员将能够与携带所述表位的各种抗原结合。术语“包含”一般以包括的含义使用，也就是说允许一种或多种特征或组分存在。术语“基本由……组成”是指不与较大产物共价连接的限定残基数的产物，特别是肽序列。然而，在上述本发明的肽的情况下，本领域技术人员应当理解，可考虑肽的n端或c端的少量修饰，例如添加保护基等的末端化学修饰，例如c端的酰胺化。术语“分离的”是指其中本发明的特异性结合成员或编码此类结合成员的核酸根据本发明可呈现的状态。成员和核酸将不含或基本不含它们与之天然结合的物质，例如它们与之存在于其天然环境或其中制备它们的环境(例如细胞培养)(当此类制备通过体外或体内实施的重组dna技术时)中的其他多肽或核酸。成员和核酸可用稀释剂或辅助剂配制，并且仍用于待分离的实际目的——例如如果用来包被微量滴定板，成员通常将与明胶或其他载体混合以用于免疫测定法，或当用于诊断或治疗时，将与药学上可接受的载体或稀释剂混合。本文所用“pg”意指皮克，“ng”意指纳克，“ug”或“μg”意指微克，“mg”意指毫克，“ul”或“μl”意指微升，“ml”意指毫升，“1”意指升。本文可使用术语“抗体”、“神经元结合性抗体”、“igm12抗体”、“igm42抗体”、“抗体12”、“抗体42”、“shigm12”、“shigm42”、“rhigm12”、“rhigm42”和未特别列出的任何变体，并且如整个本申请和权利要求书所用的是指蛋白质性物质，包括单一蛋白质或多种蛋白质，并延伸至具有本文所述和图5和图6提供的氨基酸序列数据及本文和权利要求书中所示的活性概况的那些蛋白质。特别是igm12抗体、抗体12、rhigm12具体是指包含图5所示序列的多肽或抗体或片段，特别是重组抗体或片段。igm12抗体、抗体12、rhigm12具体是指包含seqidno：31-33所示重链可变区cdr序列和seqidno：34-36所示轻链可变区cdr序列的多肽或抗体或片段，特别是重组抗体或片段。igm12抗体、抗体12、rhigm12包括具有seqidno：1的重链可变区序列和seqidno：11的轻链可变区序列的抗体。特别是igm42抗体、抗体42、rhigm42具体是指包含图6所示序列的多肽或抗体或片段，特别是重组抗体或片段。igm42抗体、抗体42、rhigm42具体是指包含seqidno：37-39所示重链可变区cdr序列和seqidno：40-42所示轻链可变区cdr序列的多肽或抗体或片段，特别是重组抗体或片段。igm42抗体、抗体42、rhigm42包括具有seqidno：17的重链可变区序列和seqidno：27的轻链可变区序列的抗体。因此，同样考虑显示基本等同的活性或改变的活性的蛋白质。这些修饰可以是有意的，例如通过位点定向诱变获得的修饰，或可以是意外的，例如在是复合体或其指定亚基的产生者的宿主中通过突变所获得的修饰。此外，术语“抗体”、“神经元结合性抗体”、“igm12抗体”、“igm42抗体”、“抗体12”、“抗体42”、“shigm12”、“shigm42”、“rhigm12”、“rhigm42”在其范围内欲包括本文明确记载的蛋白质以及所有基本同源的类似物和等位基因变异。本文所述氨基酸残基优选呈“l”异构体。然而，呈“d”异构体的残基可取代任何l-氨基酸残基，只要多肽保持免疫球蛋白-结合所需的功能性质。nh2是指存在于多肽氨基端的游离氨基。cooh是指存在于多肽羧基端的游离羧基。与标准多肽命名j.biol.chem.，243：3552-59(1969)一致，下面显示氨基酸残基的缩写。对应表：对应表应注意，全部氨基酸残基序列在本文通过其左-右方向呈氨基端到羧基端的常规方向的化学式提供。此外，应注意，氨基酸残基序列开始或结束时的破折号表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列的肽键。提供上表，以将三字母和一字母标记法(在本文中可交替出现)关联。“复制子”是起体内dna复制自主单元作用即能够在其自身控制下复制的任何遗传元件(例如质粒、染色体、病毒)。“载体”是另一dna区段可与之连接使得所连接的区段复制的复制子，例如质粒、噬菌体或黏粒。“dna分子”是指脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)呈其单链形式或双链螺旋的聚合形式。该术语仅仅是指分子的一级结构和二级结构，并不将其限于任何特定的三级形式。因此，该术语包括尤其存在于线性dna分子(例如限制片段)、病毒、质粒和染色体中的双链dna。在论述具体双链dna分子的结构时，本文可根据只给出沿dna非转录链的5′-3′方向的序列(即具有与mrna相应的序列的链)的通常惯例，来描述序列。“复制起点”是指参与dna合成的那些dna序列。dna“编码序列”是当置于合适的调节序列的控制下时在体内转录和翻译成多肽的双链dna序列。编码序列的边界取决于5′(氨基)端的起始密码子和3′(羧基)端的翻译终止密码子。编码序列可包括但不限于原核序列、真核mrna的cdna、真核(例如哺乳动物)dna的基因组dna序列和甚至合成dna序列。多腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3′。转录和翻译控制序列是供编码序列在宿主细胞中表达的dna调节序列，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子等。“启动子序列”是能够结合细胞中的rna聚合酶并启动下游(3′方向)编码序列转录的dna调节区。出于限定本发明的目的，启动子序列在其3′端以转录起始位点为界，并延伸到上游(5′方向)，来包括以超过背景的可检测水平开始转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内，将存在转录起始位点(适宜通过用核酸酶s1作图来界定)以及负责rna聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核启动子将常常但不总是含有“tata”框和“cat”框。除-10和-35共有序列以外，原核启动子还含有shine-dalgamo序列。“表达控制序列”是控制和调节另一dna序列转录和翻译的dna序列。当rna聚合酶将编码序列转录为mrna，mrna然后翻译成由编码序列编码的蛋白质时，该编码序列在细胞中“在转录和翻译控制序列的控制下”。在编码序列之前可包括“信号序列”。该序列编码多肽n端的信号肽，其与宿主细胞通讯将多肽引导至细胞表面或将多肽分泌进入培养基，在蛋白质离开细胞前，该信号肽被宿主细胞切除。可发现信号序列与对原核生物和真核生物而言是天然的各种蛋白质连接。在本文中提及本发明的探针使用的术语“寡核苷酸”，定义为由两个或更多个核糖核苷酸(优选多于3个核糖核苷酸)构成的分子。其确切大小将取决于许多因素，所述因素进而取决于寡核苷酸的最终功能和用途。本文所用术语“引物”是指寡核苷酸，其不论是作为纯化的限制酶切消化物天然存在的还是合成产生的，当置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时，即在核苷酸和诱导剂(例如dna聚合酶)存在时且在合适的温度和ph下，能够用作合成起始点。引物可以是单链或双链的，且必须足够长以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多个核苷酸，但是它可含有更少核苷酸。选择与特定靶dna序列的不同链“基本上”互补的本文引物。这意味着引物必须充分互补以与其相应链杂交。因此，引物序列不一定反映模板的确切序列。例如，非互补核苷酸片段可与引物5′端连接，其中引物序列的其余部分与该链互补。或者，可将非互补碱基或较长序列散布在引物中，条件是引物序列同与之杂交的链的序列具有充分互补性，从而形成用于延伸产物合成的模板。本文所用术语“限制性内切核酸酶”和“限制性内切酶”是指细菌酶类，其每一种在特定核苷酸序列处或附近切割双链dna。当外源或异源dna被导入细胞内时，细胞被此类dna“转化”。转化性dna可或可不整合(共价连接)到构成细胞基因组的染色体dna中。例如在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化性dna可保持在附加型元件(例如质粒)中。对于真核细胞，稳定转化的细胞是其中转化性dna已整合至染色体使得它由子细胞通过染色体复制遗传的细胞。通过真核细胞建立由含有转化性dna的子细胞群构成的细胞系或克隆的能力来证实这种稳定性。“克隆”是通过有丝分裂来源于单细胞或共同祖先的一群细胞。“细胞系”是能够体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。当至少约75％(优选至少约80％、最优选至少约90或95％)的核苷酸在限定长度的dna序列内匹配时，两个dna序列“基本同源”。可应用序列数据库中可获得的标准软件，通过对序列进行比较，或在例如针对该特定系统定义的严格条件下的dna杂交实验中，来鉴定基本同源的序列。定义适合的杂交条件为本领域技术人员所掌握。参见例如maniatis等人.，同上；dnacloning，vols.i&ii，同上；nucleicacidhybridization，同上。应当理解，同样属于本发明范围的有编码本发明的特异性结合成员(抗体)的dna序列，其编码例如具有与图2或图10提供的相同氨基酸序列，或包含本文或图10所示的cdr结构域区序列但对其为简并的抗体。所谓“简并的”意味着使用不同的三字母密码子以指定特定的氨基酸。本领域众所周知，下列密码子可互换使用以编码各个具体的氨基酸：应当理解，上述指定的密码子是针对rna序列。dna的相应密码子用t代替u。可在编码氨基酸、抗体片段、图5或图6所示的cdr区序列的序列中，或者在图5或图6所示的核酸序列中进行突变，使得将特定密码子变成编码不同氨基酸的密码子。一般通过进行尽可能最少的核苷酸改变，来进行此类突变。可以非保守方式(例如通过从属于具有特定大小或性质的氨基酸组别的氨基酸到属于另一组别的氨基酸来改变密码子)或以保守方式(例如通过从属于具有特定大小或性质的氨基酸组别的氨基酸到属于相同组别的氨基酸来改变密码子)进行此类取代突变，以改变所得蛋白质中的氨基酸。此类保守改变一般导致所得蛋白质结构和功能的较少改变。非保守改变更可能改变所得蛋白质的结构、活性或功能。本发明应视为包括含有不显著改变所得蛋白质的活性或结合性质的保守改变的序列。以下是氨基酸的各个组别的一个实例：具有非极性r基团的氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸具有不带电荷的极性r基团的氨基酸甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺具有带电荷的极性r基团的氨基酸(在ph6.0下带负电荷)天冬氨酸、谷氨酸碱性氨基酸(在ph6.0下带正电荷)赖氨酸、精氨酸、组氨酸(在ph6.0下)。另一组别可为具有苯基的那些氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。另一组别可根据分子量(即r基团的大小)：特别优选的取代为：-lys取代arg且反之亦然，使得可保持正电荷；-glu取代asp且反之亦然，使得可保持负电荷；-ser取代thr，使得可保持游离-oh；和-gln取代asn，使得可保持游离nh2。示例性的和优选的保守氨基酸取代包括以下任一个：谷氨酰胺(q)取代谷氨酸(e)且反之亦然；亮氨酸(l)取代缬氨酸(v)且反之亦然；丝氨酸(s)取代苏氨酸(t)且反之亦然；异亮氨酸(i)取代缬氨酸(v)且反之亦然；赖氨酸(k)取代谷氨酰胺(q)且反之亦然；异亮氨酸(i)取代甲硫氨酸(m)且反之亦然；丝氨酸(s)取代天冬酰胺(n)且反之亦然；亮氨酸(l)取代甲硫氨酸(m)且反之亦然；赖氨酸(l)取代谷氨酸(e)且反之亦然；丙氨酸(a)取代丝氨酸(s)且反之亦然；酪氨酸(y)取代苯丙氨酸(f)且反之亦然；谷氨酸(e)取代天冬氨酸(d)且反之亦然；亮氨酸(l)取代异亮氨酸(i)且反之亦然；赖氨酸(k)取代精氨酸(r)且反之亦然。还可引入氨基酸取代以取代具有特别优选性质的氨基酸。例如，cys可引入用于与另一cys形成二硫桥的潜在部位。his可作为特定“催化”部位(即his可起酸和碱的作用，并且是生化催化中最常见的氨基酸)引入。由于其特殊的平面结构可引入pro，其引起蛋白质结构中的β转角。当至少约70％的氨基酸残基(优选至少约80％、最优选至少约90或95％)相同或表示保守取代时，两个氨基酸序列“基本同源”。当一个或多个氨基酸被类似或保守氨基酸取代，且其中一种/多种抗体具有本文公开的igm12或igm42的一个或多个的结合和活性概况时，两种抗体的cdr区基本同源。dna构建体的“异源”区是发现不与天然的较大分子结合的较大dna分子内的dna的可鉴定区段。因此，当异源区编码哺乳动物基因时，该基因侧翼将通常是这样的dna，其不在来源生物基因组中哺乳动物基因组dna侧翼。异源编码序列的另一个实例是其中编码序列本身不是天然存在的构建体(例如其中基因组编码序列含有内含子的cdna，或具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。等位变异或天然存在的突变事件不会产生本文定义的dna异源区。当表达控制序列控制和调节dna序列转录和翻译时，该dna序列与该表达控制序列“可操作连接”。术语“可操作连接”包括在待表达的dna序列之前具有合适的起始信号(例如atg)并且保持正确读框以允许dna序列在表达控制序列控制下表达并产生由该dna序列编码的所需产物。如果需要插入重组dna分子的基因不含合适的起始信号，则可将此类起始信号插入该基因前。术语“标准杂交条件”是指盐和温度条件对于杂交和洗涤两者基本上相当于5xssc和65℃。然而，本领域技术人员应当理解，此类“标准杂交条件”取决于具体条件，包括缓冲液中钠和镁的浓度、核苷酸序列长度和浓度、错配百分比、甲酰胺百分比等。同样在决定“标准杂交条件”中重要的是两个杂交序列是rna-rna、dna-dna还是rna-dna。本领域技术人员可根据众所周知的公式，容易地确定此类标准杂交条件，其中如有需要，杂交通常低于预计或已确定的tm10-20℃，以较高严格性洗涤。术语‘药剂’意指任何分子，包括多肽、抗体、多核苷酸、化合物和小分子。具体来讲，术语药剂包括化合物，例如试验化合物或药物候选化合物。术语‘激动剂’是指以最宽泛意义刺激配体结合的受体的配体。术语‘测定法’意指用于测量化合物的特定性质的任何方法。‘筛选测定法’意指根据化合物集合的活性用来表征或选择化合物的方法。术语‘预防(preventing)’或‘预防(prevention)’是指在可能暴露于疾病引发因素或在疾病发作前易患疾病的受试者中降低获得或发生疾病或病症的风险(即，使疾病的至少一种临床症状不发生)。术语‘预防法(prophylaxis)’涉及并包括在术语‘预防(prevention)’中，是指其目的是预防而不是治疗或治愈疾病的措施或程序。预防措施的非限制实例可包括施用疫苗；将低分子量肝素施用具有由例如固定所致的血栓形成风险的住院患者；以及在访问其中疟疾是地方性的或感染疟疾的风险高的地理区域之前，施用抗疟疾药例如氯奎。‘治疗有效量’意指可引起正被医生或其他临床医生寻求的受试者的生物学或医学反应的药物、化合物、药剂、抗体或药剂的量。具体而言，对于神经疾病或病况，术语“有效量”欲包括将引起疾病的临床相关参数产生生物学上有意义的改变的化合物或药剂(例如抗体或其片段)的有效量。这可包括在成像时可观察或可评价的神经损害或死亡的量的改变；功能参数例如运动、言语或认知的改变；或在风险或易感性条件下此类改变的不存在或降低。本文使用的短语“治疗有效量”意指在可测量或可评价现象、或病理的特征、或功能的评价中，足以改善或防止和优选减轻达至少约20％、至少约30％、更优选达至少50％、更优选达至少70％、更优选达至少80％、最优选达至少90％的临床显著改变的量。在一个实施方案中，术语任何疾病、病况、损伤或感染的‘治疗’或‘医治’是指改善疾病、病况、损伤或感染(即阻止细胞或组织死亡或损伤，或减轻其至少一种临床症状的表现、程度或严重性)。在另一个实施方案中，‘治疗’或‘医治’是指改善至少一个身体参数(physicalparameter)，其可能不被受试者识别。在又另一个实施方案中，‘治疗’或‘医治’是指身体上(例如可识别症状的稳定)、生理上(例如身体参数的稳定)或在两方面调节疾病、病况、损伤或感染。在进一步的实施方案中，‘治疗’或‘医治’涉及减缓疾病的进程或降低细胞或组织损伤、损害、死亡的量。短语“药学上可接受的”是指生理上可耐受的并且当施用于人时通常不产生变应性或类似的不利反应(例如胃不适、眩晕等)的分子实体和组合物。本文所用“pg”意指皮克，“ng”意指纳克，“ug”或“μg”意指微克，“mg”意指毫克，“ul”或“μl”意指微升，“ml”意指毫升，“l”意指升。b.详细公开内容神经保护剂的目的在于预防和治疗导致cns损害的并发症。具有神经保护能力的化合物或药剂应用于急性病症例如中风和神经系统损伤以及慢性疾病例如神经变性病症。神经组织损害的许多基本机制在这些病况中相似，神经保护化合物或药剂可用于多于一种病症。疾病包括脑血管病症、创伤性脑损伤、脊髓损伤、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化(als)、多发性硬化、癫痫、运动神经元疾病和缺血性神经病。其他应用包括麻醉和手术期间的神经保护。已针对神经保护作用对多种制品进行了研究，包括来自自由基清除剂、抗兴奋性毒性剂、细胞凋亡(程序性细胞死亡)抑制剂、抗炎剂、神经营养因子、金属离子螯合剂、离子通道调节剂和基因疗法类别的制品。若干神经保护候选制品已达到临床试验，未能显示显著性，包括nmda拮抗剂和减少神经递质释放的药剂。clarkwm等人(2000)stroke31(6)：1234-9；sarcori等人(2001)jama285(13)：1719-28；albers，gw等人(2001)jama286(21)：2673-82)。神经保护剂的一个挑战是特异性和靶向使得药剂的作用针对损伤或受损害/受损的神经元而没有针对正常细胞的明显活性，从而没有不良的、甚至可能有害的副作用。本发明现在提供能够穿过血脑屏障和靶向损伤、受损或受损害区域以实现保护的特异性和可耐受的药剂，其对正常神经元具有最少的不良作用。本发明总体提供这样的特异性结合成员，特别是抗体，其显示神经元结合，用作神经保护剂以用于诊断、监测、改善和治疗其中神经元或神经细胞受损的疾病和病况，包括神经变性病况、神经细胞死亡和损伤。本发明的抗体具有某些独特和引人注目的性质，这使得它们特别可用于并适用于神经保护和/或神经再生以及神经疾病和病况的诊断和治疗。本文证实本发明的新抗体，特别是重组抗体，有效穿过血脑屏障而无任何修饰，以保护神经元免于细胞死亡并且靶向神经病变和cns的损伤部位。抗体改善慢性轴突损伤和脱髓鞘动物模型的神经功能和维持轴突。如动物模型中的评价，抗体在动物中具有最小毒性，并且不会加重自身免疫病况。本发明总体提供这样的特异性结合成员，特别是抗体，其显示神经元结合，用作单独或与其他或备选神经活性剂组合的治疗剂，用以改善和治疗其中神经元或神经细胞受损的疾病和病况，包括神经变性病况、神经细胞死亡和损伤。本申请提供本发明的抗体(包括igm12)在神经疾病或缺陷动物模型中的能力和治疗相关活性的证据。具体而言，本文提供的研究证实了在tmev模型中，在公认的运动神经元疾病(特别是als)动物模型中的能力和活性，并提供在脊髓损伤模型中的研究。具体而言，本申请提供了本发明的抗体(包括igm12)在中风和脑血栓形成或脑缺血的动物模型中的能力和治疗相关活性的证据。本文提供的研究证实了在公认的中风和脑缺血的动物模型中的能力和活性。提供用于改善或治疗任何此类疾病或在受损害或受损风险的情况下用于预防神经损害或保护神经的组合物。之前用igm12和igm42的研究已表明在体外研究中，血清来源的抗体与cns神经元结合，支持抗体包被的基质上的神经突延伸，克服cns髓磷脂的神经突延伸抑制(warringtona等人(2004)jneuropathexpneurol63(5)：461-473)。给tmev动物注射shigm12的研究表明，自发性夜间活动增加，然而，在动物中未评价病毒效价，并且可能未测定可能的抗病毒作用(rodriguesm等人(2009)neurology72：1269-1276)。本文所述研究提供完全人重组12和抗体42的序列以及重组rhigm42。现在提供研究，证实了这些血清来源的抗体和重组抗体在动物和疾病动物模型的显著神经保护和治疗相关作用及其特异性结合/靶向神经损害部位。具体而言，使用脑缺血和中风的动物模型的研究证实了这些血清来源和重组抗体(具体地重组igm12，rhigm12)在中风、脑缺血和脑或cns中细胞中的血流或向脑或cns中细胞的血流的损失的病况或由其导致的病况中的治疗相关效果。抗体和组合物自体反应性人mab归入人天然自身抗体(natab)的分类(coheni.r.(2007)jautoimmun29：246-249)。natab是我们人类免疫球蛋白库的一部分(cohen，i.r.，和m.schwartz(1999)journalofneuroimmunology100：111-114)，该库由我们自己的基因自然制备，通常没有体细胞突变，并可起刺激细胞过程或除去细胞碎片的作用(lutz，hu(2007)jautoimmun29：287-294)。natab与自身抗原起反应，而常规ab与外源抗原起反应。natab具有相对低的亲和力，通常是多反应性的，并且通常为igm。这些人igm的作用机制似乎类似，通过膜微结构域(microdomain)起作用。natab按定义是多反应性的，因此针对特定的体内功能鉴定相关抗原可能是个挑战。虽不受理论束缚，但目前了解的是，这些igm与细胞表面上的膜微结构域交联分子结合。通常不在该情境下的分子(moleculesnotnormallyincontext)一起装配信号传导复合体(rodriguez，m.，a.e.warrington，和l.r.pease(2009)neurology72：1269-1276)。因此，通过从携带高浓度的mab而无ab介导的疾病的个体血清中筛查自体反应性人单克隆抗体(mab)，来鉴定治疗分子。在不考虑抗原的情况下针对与神经系统细胞表面的结合，对此类mab进行测试。然后针对调节疾病模型的能力对mab进行测试。这种鉴定具有生物功效的mab的方法不同于制药行业常用的方法(rodriguez，m.，a.e.warrington，和l.r.pease(2009)neurology72：1269-1276)。已证实某些人igm可促进髓鞘再生(warringtonae等人(2000)procnatlacadsciusa97：6820-6825)。例如，一个此类的igm是促进髓鞘再生的重组人单克隆rhigm22(mitsunagayb等人(2002)fasebj16：1325-1327)。在病毒和毒素诱导的ms模型中，抗体rhigm22与少突胶质细胞和髓磷脂结合并促进cns髓鞘再生(warringtonae等人(2000)procnatlacadsciusa97：6820-6825；bieberaj等人(2002)glia37：241-249)。在单次低剂量的rhigm22后诱导脊髓髓鞘再生(warringtonae等人(2007)jneuroscires85：967-976)。引人注目的是，在几乎没有内在自发性修复的ms模型中，用短寿分子(小鼠中估计半衰期为15小时)的一次腹膜内(i.p.)治疗在5周内促进最大组织修复。在外周注射后，rhigm22穿过血脑屏障(bbb)，并在脱髓鞘小鼠的脑和脊髓病变内蓄积。通过mri在体内病变中检测到铁蛋白珠标记的rhigm22(pirkoi等人(2004)fasebj18：1577-1579)。还描述了具有髓鞘再生能力的另一种血清人igm抗体shigm46，及其重组对应物rhigm46。血清来源的抗体shigm22和shigm46及其重组形式和用于髓鞘再生的方法描述于例如wo0185797。例如，美国专利7,473,423和7,807166涵盖了rhigm22抗体及其方法。本发明提供人抗体，包括单克隆抗体，特别是重组抗体，其证实在中枢神经系统的神经元的促进、刺激、保护和/或再生中具有活性。本发明的抗体，包括其片段，在中枢神经系统中，在神经保护、神经元和轴突保存和再生、在防止或减少损伤介导的神经细胞死亡中显示活性。抗体可适用于治疗或减轻疾病或病况，或可适用于防止或减少与疾病或病况(特别是其中神经受损害、受损伤或另外受损)有关的神经细胞缺陷和神经细胞死亡或细胞凋亡。使用或应用本发明的抗体的病况或疾病包括其中涉及神经元的结构、功能或存活丧失或与神经元的结构、功能或存活丧失有关时的情况，包括脑损伤或创伤、脊髓损伤(sci)、神经损伤、头损伤、其中脑供血减少或受损的病况、脑感染性疾病、神经变性疾病。示例性的此类疾病或病况包括脊髓损伤(sci)、肌萎缩性侧索硬化(als)、多发性硬化(ms)、阿尔茨海默病、中风、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、产前缺氧/围产期缺血和/或大脑性麻痹、脑病、脊髓病和运动神经元疾病。本发明的神经调节剂或抗体具有以下一个或多个特征：它们保护和/或稳定神经元；它们靶向cns或神经细胞损害、受损或损伤的部位；和/或阻止细胞死亡，例如过氧化氢诱导的细胞死亡。本发明提供本发明的神经元结合性单克隆抗体，所述抗体能够促进神经突延伸和保护神经元免于损害用于中枢神经系统的诊断和治疗目的。具体而言，提供重组抗体，其中所述抗体识别并能够结合神经元，包括皮质神经元、海马神经元、小脑颗粒细胞和视网膜神经节细胞。本发明提供示例性抗体或其片段、抗体12和抗体42、特别是血清来源的或重组的igm12或igm42。在更具体的方面，本发明的抗体包含包括图5和/或图6所示的抗体12或42的氨基酸序列。本发明的重组抗体igm12包含图5所示的可变重链(seqidno：1)和轻链序列(seqidno：11)。本发明的重组抗体igm42包含图6所示的可变重链(seqidno：17)和轻链序列(seqidno：27)。在本发明的一个方面，提供包含图5和图6所示的可变区cdr序列的重组或合成神经元结合性抗体。抗体12包含图5所示的重链cdr序列cdr1ggsvslyy(seqidno：31)、cdr2gyiyssgst(seqidno：32)和cdr3arsasirgwfd(seqidno：33)及轻链cdr序列cdr1qsissy(seqidno：34)、cdr2aas(seqidno：35)和cdr3qqsyhtpw(seqidno：36)。抗体42包含图6所示的重链cdr序列cdr1gftfstya(seqidno：37)、cdr2invggvtt(seqidno：38)和cdr3vrrsgpdrnsspadf(seqidno：39)及轻链cdr序列cdr1qgig(seqidno：40)、cdr2tts(seqidno：41)和cdr3qkynsaprt(seqidno：42)。可针对各种性质，即亲和力、同种型、表位、稳定性等，筛选能够识别神经元、特别是人神经元的重组抗体或其片段的组，包括fab片段或噬菌体展示文库。特别感兴趣的是这样的抗体，其模拟示例性抗体igm12和igm42的活性，并且具有结合神经元和保护神经元免于细胞死亡或损伤(例如过氧化物介导的细胞死亡)的能力。可在特异性结合和活性测定法中容易地鉴定和/或筛选此类抗体。可产生包含本发明的抗体igm12和/或igm42的抗原结合区或重链和/或轻链cdr区的重组抗体，并针对活性进行筛选。总体而言，可在结构中带有包含基本如图5和图6所示的cdr区的氨基酸序列的cdr区，这允许cdr区与神经元、特别是哺乳动物神经元、特别是人、猴、狒狒、大鼠和/或小鼠神经元的表面结合或在其表面上结合。所谓“基本如……所示的”是指本发明的可变区序列和/或特别是cdr序列将与图5和图6指定的区域相同或高度同源。所谓“高度同源”考虑仅少数取代，优选1-8个、优选1-5个、优选1-4个或1-3个或1或2个取代可在可变区序列和/或cdr序列中进行。该术语“基本如……所示的”具体包括不会实质上或明显影响本发明抗体的特异性和/或活性的保守氨基酸取代。取代可在cdr以外的可变区序列中进行使得保持cdr序列。因此，可引入或利用可变区序列或备选的非同源或覆盖(veneered)可变区序列中的变化，使得保持cdr序列，而可变区序列的其余部分可被取代。或者，取代特别可在cdr中进行。本文(包括图5和图6)给出和描述了本发明抗体的cdr序列。抗体12包含图5所示的重链cdr序列cdr1ggsvslyy(seqidno：31)、cdr2gyiyssgst(seqidno：32)和cdr3arsasirgwfd(seqidno：33)及轻链cdr序列cdr1qsissy(seqidno：34)、cdr2aas(seqidno：35)和cdr3qqsyhtpw(seqidno：36)。抗体42包含图6所示的重链cdr序列cdr1gftfstya(seqidno：37)、cdr2invggvtt(seqidno：38)和cdr3vrrsgpdrnsspadf(seqidno：39)及轻链cdr序列cdr1qgig(seqidno：40)、cdr2tts(seqidno：41)和cdr3qkynsaprt(seqidno：42)。选择具有上文描述和考虑的取代的本发明抗体以保持与示例性抗体(包括抗体igm12和igm42)相当的活性和特异性，且具有本文和权利要求书中所示的性质。携带本发明的cdr的结构一般将具有抗体重链或轻链序列或其基本部分，其中cdr区位于相当于由重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的vh和vl抗体可变结构域的cdr区的位置。可参见以下文献确定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置：kabat，e.a.等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.4thedition.usdepartmentofhealthandhumanservices.1987，及其更新，目前可获自互联网(immuno.bme.nwu.edu)。可变结构域可来源于任何种系或重排的人可变结构域，或可以是基于已知人可变结构域的共有序列的合成可变结构域。可利用重组dna技术，将前一段定义的本发明的cdr来源的序列引入缺乏cdr区的可变结构域库中。例如，marks等人(bio/technology，1992，10：779-783)描述了产生抗体可变结构域库的方法，其中定位在可变结构域区域5′端或在其附近的共有引物与人vh基因的第3构架区的共有引物联用，以提供缺失一个/多个cdr的vh可变结构域库。marks等人进一步描述了该库如何与具体抗体的cdr组合。该库然后可在合适的宿主系统(例如wo92/01047的噬菌体展示系统)中展示，使得可选出合适的特异性结合成员。该库可由104个个别成员上升至例如106-108或1010个成员中的任意个组成。stemmer(nature，1994，370：389-391)也公开了类似的改组或组合技术，他描述了与β-内酰胺酶基因有关的技术，但发现该方法可用于产生抗体。另一个备选方法是使用例如abvh或vl基因的随机诱变以产生整个可变结构域内的突变，来产生携带本发明的cdr来源的序列的新的vh或vl区。gram等人(1992，proc.natl.acad.sci.，usa，89：3576-3580)描述了使用易错pcr的此类技术。另一种可采用的方法是引导vh或vl基因的cdr区诱变。此类技术公开于barbas等人，(1994，proc.natl.acad.sci.，usa，91：3809-3813)和schier等人(1996，j.mol.biol.263：551-567)。所有上述技术是本领域本身已知的。技术人员能够采用本领域的常规方法，采用此类技术以提供本发明的特异性结合成员。免疫球蛋白可变结构域的基本部分将包含至少3个cdr区及其间插构架区。优选该部分还可包括第一和第四构架区的任一个或两个的至少约50％，其50％为第一构架区c端50％和第四构架区的n端50％。可变结构域的基本部分的n端或c端上的其他残基可以是通常不与天然存在的可变结构域区结合的残基。例如，通过重组dna技术进行的本发明的特异性结合成员的构建可导致引入接头编码的n端或c端残基，以利于克隆或其他操作步骤。其他操作步骤包括引入使本发明的可变结构域与其他蛋白质序列连接的接头，其他蛋白质序列包括免疫球蛋白重链、其他可变结构域(例如在双体的产生中)或本文提供的和/或本领域技术人员已知的蛋白质标记。虽然在本发明的一个优选方面，优选包含基于基本由图5和/或图6所示的序列的结合结构域对的重组抗体，但基于这些序列任一个的单一结合结构域构成本发明的进一步的方面。在基于基本上由图5和/或图6所示的序列的结合结构域的情况下，此类结合结构域可用作cns神经元、特别是神经损害或损伤部位的靶向药剂，因为已知免疫球蛋白vh结构域能够以特异性方式结合靶抗原。本发明的特异性结合成员还可包含抗体恒定区或其部分。例如，基于图5和图6的vh和vl序列的重组抗体可在其c末端与抗体轻链恒定结构域连接，所述抗体轻链恒定结构域包括人cκ或cλ链、优选cλ链，包括不同于图5或图6所示的各个恒定结构域的恒定结构域或其变体。同样地，基于图5或图6的序列的重组抗体可在其c末端与来源于任意抗体同种型(例如igg、iga、ige、igd和igm)和任何同种型亚类(特别是igg1、igg2b和igg4)的免疫球蛋白重链的全部或部分连接，然后测试以证实或确定相当的和/或合适的活性和能力。优选igm。抗体或其任何片段可与任何细胞毒素、细菌或其他毒素(例如假单胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白或白喉毒素)缀合或重组融合。所用毒素的部分可以是整个毒素或毒素的任何特定结构域。此类抗体-毒素分子已成功用于不同癌症种类的靶向和疗法，参见例如pastan，biochembiophysacta.1997oct24；1333(2)：c1-6；kreitman等人.，nengljmed.2001jul26；345(4)：241-7；schnell等人.，leukemia.2000jan；14(1)：129-35；ghetie等人.，molbiotechnol.2001jul；18(3)：251-68。双特异性和三特异性多聚体可通过不同scfv分子的结合来形成，并且已被设计成t细胞募集至肿瘤的交联试剂(免疫疗法)、病毒重新靶向(viralretargeting)(基因疗法)和作为红细胞凝集试剂(免疫诊断学)，参见例如todorovska等人.，jimmunolmethods.2001feb1；248(1-2)：47-66；tomlinson等人.，methodsenzymol.2000；326：461-79；mccall等人.，jimmunol.2001may15；166(10)：6112-7。本发明的抗体可用可检测标记或功能标记进行标记。可检测标记包括但不限于放射性标记例如同位素3h、14c、32p、35s、36cl、51cr、57co、58co、59fe、90y、121i、124i、125i、131i、111in、117lu、211at、198au、67cu、225ac、213bi、99tc和186re，其可采用抗体成像领域已知的常规化学法与本发明的抗体连接。标记还包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、德克萨斯红)和mri-ct成像领域常规使用的标记。它们还包括酶标记，例如辣根过氧化物酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(glucoronidase)、β-半乳糖苷酶、脲酶。标记还包括可通过与特异性关联可检测部分(例如标记的抗生物素蛋白)结合来检测的化学部分例如生物素。功能标记包括设计为靶向受损、损害或损伤的部位以提供神经组织的保护或引起神经组织的破坏的物质。此类功能标记包括细胞毒性药物(例如5-氟尿嘧啶或蓖麻毒蛋白)和酶(例如细菌羧肽酶或硝基还原酶)，其能够在所述部位将前药转化成活性药物。考虑了本发明的免疫缀合物或抗体融合蛋白，其中抗体及其片段与其他分子或药剂缀合或连接，所述其他分子或药剂还包括但不限于与化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性剂、化疗剂或药物缀合的结合成员。当使用放射性标记时，可利用已知目前可得到的计数程序鉴定和定量测定特异性结合成员。在标记是酶的情况下，可通过本领域已知的目前所采用的比色技术、分光光度技术、荧光分光光度技术、电流测量技术或气体定量技术的任一种来实现检测。技术人员可利用导致cns损害(包括神经细胞损伤或损害)的并发症或神经变性病况的体内动物模型进一步或额外地筛选、评价和/或验证本发明抗体或其片段、其变体或其组合或其与其他cns反应性抗体的组合。此类动物模型包括但不限于与神经细胞损害、受损、改变、死亡、损伤或变性相关的病况或疾病的模型。模型包括中风、脑损伤、缺血、ms、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、帕金森病、痴呆、脑炎、脑膜炎、als或运动神经元疾病的模型或者模拟以上疾病方面的模型。利用灵长类动物(例如狒狒、猴或猕猴)大脑中动脉闭塞的中风模型是本领域已知的，并可能是合适的(younga等人(1997)stroke28：1471-1476；delzoppogj等人(1986)stroke17：1254-1265；marshall和ridley91996)neurodegeneration5：275-286)。ms模型例如tmev是已知的，本文予以描述和使用。als和运动神经元疾病的sod小鼠模型是已知的，本文予以描述和使用(gurneyme等人(1994)science264：1772-1775)。中风和治疗方法本文提供的实施例和研究表明本文中提供、描述和考虑的抗体在中风、缺血模型和脑或神经细胞缺氧的情况下的功效和应用。因此，在一个具体方面，本发明涉及在中风、脑缺血、疑似或推测中风、短暂性缺血发作(tia)或小中风相关的干预中，或处于中风或脑缺血事件或脑缺氧事件的高风险的个体中使用抗体。在中风或疑似中风的事件中，快速治疗是重要的，因为由于中风的最严重损害通常发生在前几个小时内。更快的治疗导致更低的初始和永久或长期损害。治疗取决于中风的性质或病因，是否由于血块(缺血性)而恢复缺血性中风的血流，或通过控制出血性中风的出血。ct扫描和mri用于评价或诊断中风的类型或程度。急性缺血性中风的当前治疗包括iv血栓溶解治疗，特别是用组织型纤溶酶原激活剂(tpa)，和血管内治疗，包括动脉内血栓溶解治疗和使用凝块取出装置。然而，tpa具有有限的治疗窗口，且通常在中风发作的3小时内施用。保护脑缺血后受损神经元是一种限制永久残疾的有希望的策略。尽管调节炎症反应的治疗可具有神经保护特性，但目前存在很少直接作用于神经元以保护它们的药物。可以帮助高危患者(特别是已经具有先前短暂性缺血发作(tia)或微中风的患者)预防中风的许多药物是可用的。这些药物分为两大类-抗凝血剂和抗血小板剂。抗凝血剂的实例包括肝素、香豆素、华法林、希美加群和exanta。这些药物通过使血液变稀起作用来帮助防止凝血，包括深静脉血栓和肺栓塞的情况下，并且非常有效地帮助预防房颤患者中的中风。抗血小板剂包括阿司匹林、潘生丁、双嘧达莫、plavix和氯吡格雷。这些药物防止或减少血小板聚集，从而减少血块或凝块形成，且可以降低已经具有tia或以前缺血性中风的患者中中风的风险。尽管可获得血栓溶解治疗，但中风仍然是美国死亡的第三大原因和成人残疾的最常见原因。科学家和医师继续寻求实现中风患者中更好功能恢复的方法。神经保护剂已经产生强烈的兴趣，并且具有使脑不易受到中风的损伤性影响的潜能。在评价和评估中风的程度和影响时，临床医生和医务人员审查并考虑患者的能力和功能的各个方面。除了鉴定和定位中风或凝块和缺血区域的成像技术以外，患者使用中风评价量表和功能评价量表来评价。众多量表被接受或利用，并且是临床医生和本领域技术人员将认识和知道的。功能评价量表包括例如berg平衡量表、日常生活的lawton器具活动(iadl)量表、rankin或改良rankin量表和nih中风量表(nihhs)。这些量表评价和确定几个或许多不同参数，包括上下肢运动功能、肢体共济失调、感觉功能、语言、声音清晰度、注意力、注视和视觉功能、手臂、手和腿部力量和运动。患者可以刚在中风或缺血事件之后，事件之后，治疗之前和之后在一个或多个量表上来评价，用于评价试剂的可能或候选治疗，用于比较治疗或药剂，且随着时间，包括数天、数周、数月、数年。包含本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体可用于治疗、预防或诊断人或动物体的方法，例如哺乳动物的神经保护方法，特别是在确立、疑似或可能的中风或脑缺血的情况下，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的本发明的抗体、其片段和重组抗体。包含本发明的cdr结构域区序列的重组抗体或其片段可用于此类方法。本发明的药剂，特别是重组抗体或其片段可用于确立、疑似或可能的中风或脑缺血的情况下，包括用于预防、治疗或减轻能够、可能或的确导致cns损害的神经损伤、损害或受损和并发症的方法中用作神经保护剂。当涉及神经元的结构、功能或存活丧失或与其有关时，包括脑损伤或创伤、脊髓损伤(sci)、神经损害、头损伤、其中脑供血或供氧减少或受损的病况，本发明的方法可适用。根据本发明的方法治疗、预防或改善的示例性的此类疾病或病况包括中风、tia、脑缺血、产前缺氧/围产期缺血和/或大脑性麻痹。本发明的药剂，特别是重组抗体或其片段可用作用于预防、治疗或减轻中风或脑缺血的方法中的药剂。本发明提供了治疗或减轻中风或脑缺血的方法，包括施用本发明的抗体，特别是重组抗体，特别是抗体igm12或重组igm12，包括抗体或其片段，其包含重链cdr序列cdr1ggsvslyy(seqidno：31)、cdr2gyiyssgst(seqidno：32)和cdr3arsasirgwfd(seqidno：33)，和轻链cdr序列cdr1qsissy(seqidno：34)、cdr2aas(seqidno：35)和cdr3qqsyhtpw(seqidno：36)，如图5中所示。本发明提供治疗或减轻其中神经受损、损伤或损害的哺乳动物中或者其中神经或神经元易于受损、损伤或损害或者有受损、损伤或损害的风险情况的情形中的疾病或病况的方法，所述方法包括施用选自igm12和igm42的重组抗体或完全人抗体或其片段。本发明的方法可包括施用多于一种抗体或片段，包括抗体igm12和42的组合。在又一个此类方法中，抗体igm12和/或抗体igm42的一种或多种可与另一种cns活性抗体组合，特别包括抗体rhigm22和/或rhigm46的一种或多种。抗体的组合可在不同的时间，以不同的量或浓度共同或连续施用。因此，可通过联合施用或通过相隔短的持续时间或较长持续时间(包括数小时、数天或数周)的连续施用，将抗体12和/或42与抗体22和/或46组合施用。可通过联合或连续施用用于治疗或减轻涉及神经变性的疾病或病况(且特别包括脱髓鞘)，将抗体12和/或42具体与抗体22和/或46(shigm22、rhigm22、shigm46或rhigm46)组合施用。在一个此类方法中，通过联合或连续施用，将抗体12和/或42与抗体22和/或46组合施用用于治疗或减轻脱髓鞘疾病或病况，特别包括多发性硬化(ms)。seqidno：43和seqidno：44中分别给出抗体igm22的可变重链和轻链序列。seqidno：45和seqidno：46中分别给出抗体igm46的可变重链和轻链序列。抗体igm12和/或抗体igm42的一种或多种可与一种或多种包含以下的髓鞘再生抗体组合：(a)包含cdr1序列ssgmh、cdr2序列v(i)isydgsrkyyadsvkg和cdr3序列gvtgsptldy的重链可变区cdr和包含cdr1序列sgsssnignnfvs、cdr2序列ditkrps和cdr3序列g(e)twdsslsavv的轻链可变区cdr：或(b)包含cdr1序列sgftfssyw、cdr2序列ikkdgsek和cdr3序列arpncggdcylpwyfd的重链可变区cdr和包含cdr1序列qsvlyssnnkny、cdr2序列ywas和cdr3序列qqyyntpqa的轻链可变区cdr。本发明的方法可包括施用单独本发明的抗体或施用本发明的抗体组合有、与其连续施用或随后施用中风或缺血剂，包括一种或多种溶栓剂、抗血小板剂、血压调节剂、抗高血压药、消炎药、改变兴奋性氨基酸或它们的受体的药剂、细胞内钙调节剂、通道调节剂自由基清除剂。在一个具体方面，将抗体或其活性片段，特别是抗体igm12和/或igm42，与溶栓剂和/或抗血小板剂施用。在一个方面，将抗体可以与溶栓剂(诸如tpa)施用或在溶栓剂(诸如tpa)之后施用。与…施用可以包括在约同时，之后不久，之后几分钟，之后长达一小时，之后几小时，之后一天。抗体，单独(特别是作为抗体igm12或igm4)或以组合方式或与其他药剂的施用，可以是在记录或疑似中风或脑缺血事件之后对于tpa或溶栓剂施用的3小时、4小时、5小时、6小时、长达9小时治疗窗口之内或之后。抗体可以以单次剂量或多次剂量施用。通过实例而非限制的方式，抗体可以在记录或疑似中风或脑缺血事件之后3小时内、3个小时后、长达4小时、长达5小时、长达6小时、长达8小时、长达12小时、长达24小时、长达一天、长达2天、长达3天、长达数天、长达一周或更长时间施用。通过实例而非限制的方式，抗体可以最初在记录或疑似中风或脑缺血事件之后3-6小时内施用，随后在最初或任何后续施用之后长达一天、2天、3天、4天、5天、6天、一周、多于一周、2周、多于2周或以后额外施用一种或多种抗体。剂量可以基于患者的响应或功能来调节。例如，可以在初始施用抗体之前或之后，之前和之后，或之后例如使用中风量表诸如nihss评价患者，并且可以基于此类量表或其他患者的神经或运动评价调整或持续或改变抗体施用。在本发明和本方法的具体方面，抗体有效改善中风量表量度或其他神经或功能量表，特别是当与未施用抗体、施用单独的tpa或其他试剂相比，或相比于替代药剂，包括替代抗体或神经保护剂。因此，如本文中在中风的动物模型中所表明，施用本发明的抗体的动物显示出改善的功能活性。本发明的抗体通过中风或脑缺血后其施用有效改善自发运动活动，包括改善水平运动功能。缺血性损伤或中风之后，临床缺陷相关的失能主要是由于神经元的功能障碍。功能恢复的缺乏部分归因于再生和神经可塑性的限制(walmsley，a.r.，和mir，a.k.(2007)currentpharmaceuticaldesign13：2470-2484)。中风可以导致改变的运动功能，诸如在身体一侧不能移动一个或多个肢体，认知效果，诸如不能理解或组织说话，或其他缺陷，包括视觉效果，诸如不能看到视野的一侧。在本发明和其方法的方面，本发明的抗体有效预防或逆转中风相关的神经缺陷。因此，本发明的抗体可以减轻中风或脑缺血的情况下的一种或多种神经症状或缺陷。本发明的抗体有效减轻中风的事件或情况下的神经影响或损伤，特别是cns中。所述抗体用于减少神经损害或神经元细胞死亡的方法中，且有效地保持或保护中风或脑缺血的事件中的神经元。在本发明的一个方面，包含根据本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体，可以用于方法中或以组合物施用用于在其中神经受损、损伤或损害的情况下，特别是中风或脑缺血事件过程中、之后或以后，或其中神经或神经元易于受损、损伤或损害或处于受损、损伤或损害的风险中的情形下，改善或稳定神经功能或运动功能。在一个具体方面，抗体或其片段在疾病、创伤或病况(诸如中风或疑似中风)的早期或初始阶段利用或施用，或在疾病、创伤或病况的过程或持续时间中重复，诸如中风之后重复，以便促进或维持神经功能或运动功能(包括或选自运动，诸如步行)或认知功能(诸如回忆或识别)的改善或稳定。可通过任何合适的途径，包括通过腹膜内注射到血流或csf，或直接注射至损伤或受损部位，而将本发明的抗体施用于需要治疗的患者。本发明示例性抗体的特别优势是它们穿过bbb，因此甚至在i.p.施用时都可靶向cns。确切剂量将取决于多个因素，包括抗体是用于诊断还是用于治疗、损伤的大小或程度以及损伤的位置、抗体的精确性质(是否是完整抗体、片段、双体等)以及与抗体连接的任何可检测标记或功能标记的性质。如果放射性核素用于治疗，则合适的最大单剂量可为约45mci/m2至最大约250mci/m2。优选的剂量范围为15-40mci，其更优选的剂量范围为20-30mci或10-30mci。此类疗法可能需要骨髓或干细胞置换。一般以mg的量施用临床上获批准的裸抗体，其成人剂量为20-2000mg蛋白质/剂、20-1500mg蛋白质/剂、或20-1000mg蛋白质/剂、或20-500mg蛋白质/剂、或20-100mg蛋白质/剂。临床上获批准的注射用单克隆抗体以mg的量、3-5mg/kg、5-10mg/kg/剂、300-400mg/剂、300-500mg/剂施用(newsomebw和ernstoffms(2008)brjclinpharmacol66(1)：6-19；herceptin.net、tysabri.net、avastin.net、remicade.com)。值得注意的是，已证实髓鞘再生抗体igm22在相对显著较少的剂量(在μg的范围)是有效的，并且能够穿过bbb，甚至对于单剂量的抗体在cns中都有活性(wo2004/110355；warringtonae等(2007)jneuroscires85(5)：967-976)。本文表明重组igm12抗体在动物模型中，在μg范围的单次i.p.剂量时具有治疗相关活性。因此以单剂量或多剂量和/或周期性剂量，以μg/剂或μg/kg剂量的范围，或以低的mg/剂(100μg-1mg，小于1mg、1mg-5mg、1mg-10mg、5mg-15mg、10mg-20mg/剂)的本发明的抗体的剂量，可能是适用的和有效的。成年患者单次治疗的剂量可按比例调整以用于儿童和婴儿，还可与例如分子量成比例调节用于其他抗体形式。可根据医师的判断，以每日、每周两次、每周一次或每月一次的间隔重复治疗。示例性抗体的一个优势是它们穿过bbb并靶向损害或损伤部位，因此利于使用较低和可能较少的剂量以达到适当的效果。药物组合物和治疗组合物本发明的抗体或片段通常可以药物组合物的形式施用，除本发明的抗体或片段以外，所述药物组合物还可包含至少一种组分。因此除活性成分以外，本发明的药物组合物和根据本发明使用的药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他物质。此类物质应是无毒的，且不应干扰活性成分的功效。载体或其他物质的确切性质将取决于施用途径，其可为口服、或通过注射(例如静脉内注射)、或通过沉积在肿瘤部位。用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂或液体形式。片剂可包含固体载体，例如明胶或辅助剂。液体药物组合物一般包含液体载体，例如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇类，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。对于静脉内注射或在受损部位注射，活性成分可呈胃肠外可接受的水溶液的形式，其不含致热原并且具有合适的ph、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如等渗媒介物(例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸化林格注射液)，制备合适的溶液。如有需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。可根据待治疗的病况，单独或与其他治疗法、治疗剂或药剂组合，同时或序贯地施用组合物。考虑了包含本文所述的一种或多种重组抗体或其片段的组合的组合物。另外，本发明考虑和包括包含本文所述抗体或其片段和其他药剂或治疗剂的组合物，所述其他药剂或治疗剂例如神经活性剂或治疗剂、抗炎剂、神经递质释放调节剂、神经受体配体或激动剂或拮抗剂、钙通道药剂、免疫调节剂或其他cns反应性抗体。考虑了包含本文所述的一种或多种重组抗体或其片段的组合的组合物。其他治疗法或治疗剂可包括施用合适剂量的止痛药物例如非甾体抗炎药(例如阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬或酮洛芬)或阿片制剂(例如吗啡)或镇吐药。另外，组合物可与刺激免疫应答和减少或根除癌细胞或肿瘤的免疫调节剂(例如白介素)、肿瘤坏死因子(tnf)或其他生长因子、集落刺激因子、细胞因子或激素(例如地塞米松)一起施用。组合物还可与其他cns反应性抗体、特别包括髓鞘再生抗体、包括rhigm22和/或rhigm46一起施用，或者可包括连同其他cns反应性抗体、特别包括髓鞘再生抗体、包括rhigm22和/或rhigm46的组合。本发明进一步考虑可用于实施本发明的治疗方法的治疗组合物。主题治疗组合物包括以混合物的药学上可接受的赋形剂(载体)和作为活性成分的本文所述的一种或多种抗体、其多肽类似物或其片段。在一个优选的实施方案中，组合物包含能够调节本发明结合成员/抗体与靶细胞特异性结合的抗原。含有作为活性成分的抗体、多肽或活性片段的治疗组合物或药物组合物的制备是本领域众所周知的。通常，将此类组合物制备成作为液体溶液或混悬液的注射剂。然而，还可制备适于在注射前溶于或混悬于液体中的固体形式。也可将制剂乳化。活性治疗成分常常与是药学上可接受的并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，如有需要，组合物可含有提高活性成分的有效性的少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂。抗体或活性片段可配制成作为中和的药学上可接受的盐形式的治疗组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽或抗体分子的游离氨基形成的盐)，和与无机酸(例如盐酸或磷酸)或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等这样的有机酸形成的盐。由游离羧基形成的盐也可来源于无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等这样的有机碱。按惯例腹膜内或静脉内施用含有治疗性抗体或活性片段的组合物，如通过注射单位剂量。术语“单位剂量”当用于提及本发明的治疗组合物时，是指适于作为人用单一剂量的物理独立单位，每单位含有经计算与所需稀释剂(即载体或媒介物)联合时产生所需治疗效果的预定量的活性物质。以与剂型相容的方式并以治疗有效量施用组合物。待施用的量取决于待治疗的受试者、受试者的系统利用活性成分的能力和所需神经元结合能力的程度或神经损伤范围。待施用的所需要的活性成分的精确量取决于从业人员的判断，并且对于每个个体而言是独特的。初期施用和继续施用的合适方案也是可变的，可包括初期施用，接着为按一个或多个小时、天、周或月的间隔通过后续注射或其他施用的重复剂量。或者，考虑了足以维持血液、cns或所需治疗部位中的适当和足够的浓度的连续输注或施用。施用时机可改变，可由技术人员或医学从业人员根据本说明书的教导、患者或受试者的临床参数、病况或疾病的状况或严重程度、神经损害、牵涉、或受损的程度或性质来决定。因此，神经功能的改善或使神经元免于例如死亡或受损的保护的提高，可通过在疾病发病或临床表现早期施用而加强，从而使神经损害或受损的程度减到最小。在一个方面，施用时机与神经系统功能评价、状态确定和/或其他临床评价相协调，从而使神经系统病损或损害的疾病进程最小化或者减缓神经系统病损或损害的疾病进程。诊断测定法本发明还涉及各种诊断应用，包括用于检测或测定神经细胞损害、损伤或受损的方法。本发明的抗体和片段可以体外或体内用于评价、定量测定、靶向神经元和/或使神经元成像。本发明的抗体(包括其片段)和调节特异性结合成员、抗体和/或其亚基的产生或活性的药物可具有某些诊断应用，并可例如用于检测和/或测量涉及神经元受损、变性、损伤、损害或死亡的病况或疾病的目的。包括其片段的本发明的抗体具有某些诊断应用，且可例如用于检测和/或测量涉及脑缺血(包括中风或脑损伤，包括创伤性脑损伤)的病况或疾病的目的。标记的(包括放射性标记的)抗体及其片段可用于体外诊断技术和体内放射性成像技术和放射性免疫疗法。在体内成像的情况下，本发明的抗体或片段可与成像剂而不是与放射性同位素缀合，包括但不限于磁共振成像增强剂，其中例如抗体分子通过螯合基加载巨大量的顺磁离子。螯合基的实例包括edta、卟啉、聚胺冠醚和聚肟(polyoximes)。顺磁离子的实例包括钆、铁、锰、铼、铕、镧、钬和铽(ferbium)。在本发明的又一个方面，放射性标记的抗体及其片段，特别是放射性免疫缀合物，可用于放射性免疫疗法，特别作为放射性标记的抗体用于细胞疗法。在更进一步的方面，放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，可用于放射免疫导向手术技术，其中它们可鉴定和表明受损或损害的神经元的存在情况和/或位置或神经损伤部位，在手术期间或之后靶向或除去此类细胞或者将细胞移植或施用这些特定部位。放射性免疫疗法(rait)已进入临床，并且使用各种抗体免疫缀合物证实了功效。已在结肠直肠癌中对131i标记的人源化抗癌胚抗原(抗cea)抗体hmn-14进行了评价(behrtm等人(2002)cancer94(4suppl)：1373-81)，且在甲状腺髓样癌中对具有90y标记的同一抗体进行了评价(steinr等人(2002)cancer94(1)：51-61)。还针对非霍奇金淋巴瘤和胰腺癌，对使用单克隆抗体的放射性免疫疗法进行了评价和报告(goldenbergdm(2001)critrevoncolhematol39(1-2)：195-201；golddv等人(2001)critrevoncolhematol39(1-2)147-54)。用特定抗体的放射性免疫疗法还描述于美国专利6,306,393和6,331,175中。放射免疫导向手术(rigs)也已进入临床，并证实了功效和有用性，包括使用抗cea抗体和针对肿瘤相关抗原的抗体(kimjc等人(2002)intjcancer97(4)：542-7；schneebaums等人(2001)worldjsurg25(12)：1495-8；avitals等人(2000)cancer89(8)：1692-8；mcintoshdg等人(1997)cancerbiotherradiopharm12(4)：287-94)。放射性标记的抗体及其片段，可用于体外诊断技术和体内放射性成像技术。抗体及其片段，特别是放射性免疫缀合物，可用于放射性免疫疗法，特别作为用于神经损害修复、神经变性恢复、癌症或cns肿瘤疗法的放射性标记的抗体，或在某些情况下，备选地用于受损害神经组织或神经元的切除。在体内方面，抗体或其神经元结合片段是标记的，并在手术或手术技术之前、期间或之后施用于动物，包括立体定位术(stereotactic)或最小侵入性技术，用于定位神经损伤或评价其余受损害或受损伤的神经组织的目的。在一个此类方面，放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，可用于放射免疫导向手术技术，其中它们可在靶向、鉴定或除去此类细胞的手术之前、期间或之后，鉴定和表明受损、受损害、受损伤或濒死神经细胞或神经元或神经组织的存在情况和/或位置。本发明的抗体及其片段的诊断应用包括对技术人员是众所周知的和标准的并且基于本说明书的体外和体内应用。可利用体外评价和评估神经元或神经组织的诊断测定法和试剂盒，诊断、评价和监测患者样品，包括已知患有或疑似患有其中神经细胞受损、受损害或受损伤的神经病况或疾病或者确定细胞死亡或损伤或者cns肿瘤或癌症的程度的患者样品，包括患者或受试者的样品。神经疾病状态的评价和评估还可用于确定患者对药物临床试验或对施用特定神经治疗药或化学治疗药或本发明的抗体(包括其组合)相对于不同药剂或抗体的适合性。本发明包括可以以试验试剂盒的形式制备的测定系统用于定量分析例如受损害、受损或受损伤的神经元的存在程度或定量测定样品中的神经元。系统或试验试剂盒可包含通过本文论述的放射性和/或酶技术之一使标记与抗体偶联而制备的标记的组分和一种或多种其他的免疫化学试剂，其中至少一种是待测定的游离或固定的组分或其结合配偶体。在本发明的进一步的实施方案中，可根据上文制备适于医学专家使用的市售试验试剂盒以测定样品中神经元的状态。根据上文论述的试验技术，此类试剂盒的一个类别可含有至少该标记的抗体或其结合配偶体(例如对其有特异性的抗体)和使用说明(当然这取决于所选择的方法，例如“竞争性”、“夹心”、“dasp”等)。试剂盒还可含有辅助试剂(peripheralreagent)例如缓冲剂、稳定剂等。因此，可制备试验试剂盒以表明存在情况或测定神经元的状态，其包括：(a)预定量的至少一种标记的免疫化学反应性组分，所述组分通过本发明的抗体或其片段或特异性结合配偶体与可检测标记直接或间接连接获得；(b)其他试剂；和(c)所述试剂盒的使用说明。可制备试验试剂盒以表明神经细胞损伤、损害或受损的存在情况，其包括：(a)预定量的至少一种标记的免疫化学反应性组分，所述组分通过本发明的抗体或其片段或特异性结合配偶体与可检测标记直接或间接连接获得；(b)其他试剂；和(c)所述试剂盒的使用说明书。核酸本发明还提供编码本发明的抗体、特别是重组抗体、特别是完全人抗体的分离的核酸。核酸包括dna和rna。在优选的方面，本发明提供编码如上定义的本发明的多肽(包括图5或图6所示的多肽)或能够编码其cdr区的核酸。本发明还提供包含至少一种上述多核苷酸的呈质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体。本发明还提供包含一个或多个上述构建体的重组宿主细胞。编码所提供的任何抗体或片段的核酸构成本发明的一个方面，产生特异性结合成员的方法也构成本发明的一个方面，所述方法包括由其编码核酸进行表达。可通过将含有核酸的重组宿主细胞培养在合适条件下，方便地实现表达。在通过表达产生后，可采用任何合适的技术分离和/或纯化特异性结合成员，然后在适当时使用。可提供这样的本发明的抗体和编码核酸分子和载体，其例如从其天然环境分离和/或纯化，呈基本纯的或均质形式，或在核酸的情况下不含或基本不含除编码具有所需功能的多肽的序列以外的核酸或基因来源。本发明的核酸可包含dna或rna，并且可以是完全或部分合成的。用于在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域可获得的用于异源多肽表达的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、hela细胞、幼仓鼠肾细胞、癌细胞、卵巢癌细胞和许多的其他细胞。常用的优选细菌宿主是大肠杆菌(e.coli)。在原核细胞例如大肠杆菌中表达抗体和抗体片段是本领域充分确立的。可选择或构建含有合适调节序列的合适载体，所述调节序列包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化信号、增强子序列、标记基因和适当时的其他序列。载体可以是质粒、病毒例如噬菌体或适当时的噬菌粒。有关更多详情参见例如molecularcloning：alaboratorymanual：2ndedition，sambrook等人.，1989，coldspringharborlaboratorypress。用于核酸操作，例如在核酸构建体制备中、诱变、测序、dna导入细胞和基因表达以及蛋白质分析的许多已知技术和方案详细描述于shortprotocolsinmolecularbiology，secondedition，ausubel等人.eds.，johnwiley&sons，1992。sambrook等人和ausubel等人的公开内容通过引用结合到本文中。因此，本发明的其他方面提供含有本文公开的核酸的宿主细胞。还有更多方面提供包括将此类核酸导入宿主细胞的方法。导入可采用任何可得到的技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、deae-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用反转录病毒或其他病毒例如牛痘病毒或用于昆虫细胞的杆状病毒的转导。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。导入后可接着是例如通过将宿主细胞培养在用于基因表达的条件下而引起或允许从核酸中表达。本发明还提供包括在表达系统中使用上述构建体以表达上述特异性结合成员或多肽的方法。本发明的另一个特征是本文公开的dna序列的表达。如本领域众所周知的一样，可通过使dna序列与合适表达载体中的表达控制序列可操作连接，并使用该表达载体转化合适的单细胞宿主，来表达所述dna序列。可使用各种各样的宿主/表达载体组合来表达本发明的dna序列。例如，有用的表达载体可由染色体、非染色体和合成dna序列的区段组成。合适的载体包括sv40的衍生物和已知的细菌质粒，例如大肠杆菌质粒colel、pcr1、pbr322、pmb9及其衍生物，质粒例如rp4；噬菌体dna，例如噬菌体λ的多种衍生物(例如nm989)和其他噬菌体dna，例如m13和丝状单链噬菌体dna；酵母质粒例如2u质粒或其衍生物；可用于真核细胞的载体，例如可用于昆虫或哺乳动物细胞的载体；来源于质粒和噬菌体dna的组合的载体，例如已经修饰以利用噬菌体dna或其他表达控制序列的质粒等。各种各样的表达控制序列(控制与之可操作连接的dna序列的表达的序列)的任一种可用于这些载体以表达本发明的dna序列。此类有用的表达控制序列包括例如sv40的早期或晚期启动子、cmv、牛痘病毒、多瘤病毒或腺病毒、lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、ltr系统、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如pho5)、酵母交配因子的启动子和已知控制原核或真核细胞或其病毒基因表达的其他序列，及其各种组合。各种各样的单细胞宿主细胞也可用于表达本发明的dna序列。这些宿主可包括众所周知的真核和原核宿主，例如大肠杆菌、假单胞菌属(pseudomonas)、芽孢杆菌属(bacillus)、链霉菌属(streptomyces)的菌株、真菌例如酵母和动物细胞例如cho、yb/20、nso、sp2/0、rl.l、b-w和l-m细胞、非洲绿猴肾细胞(例如cos1、cos7、bsc1、bsc40和bmt10)、昆虫细胞(例如sf9)及组织培养中的人细胞和植物细胞。应当理解，不是所有载体、表达控制序列和宿主都起同样好地表达本发明的dna序列的作用。也不是具有相同表达系统的所有宿主都起同样好的作用。然而，本领域技术人员将能够在不偏离本发明的范围的情况下选择合适的载体、表达控制序列和宿主而无需过度实验以实现所需要的表达。在选择表达控制序列时，通常应考虑各种因素。这些包括例如系统的相对强度、其可控性及其与待表达的特定dna序列或基因的相容性，特别是有关可能的二级结构。可通过考虑例如其与所选载体的相容性、其分泌性质、其使蛋白质正确折叠的能力及其发酵要求以及由待表达dna序列编码的产物对宿主的毒性和表达产物纯化简易性，来选择合适的单细胞宿主。考虑到这些因素和其他因素，本领域技术人员就能够构建可在发酵或大规模动物培养时表达本发明的dna序列的各种载体/表达控制序列/宿主组合。编码抗体或其片段的dna序列可经合成而不是克隆来制备。可用对特异性结合成员氨基酸序列是合适的密码子来设计dna序列。总体而言，如果序列将用于表达，则将选择对既定宿主是优选的密码子。由通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配完整序列，并且装配成完整的编码序列。参见例如edge，nature，292：756(1981)；nambair等人.，science，223：1299(1984)；jay等人.，j.biol.chem.，259：6311(1984)。合成dna序列可供方便地构建将表达特异性结合成员类似物或“突变蛋白”的基因。或者，可通过天然特异性结合成员基因或cdna的位点定向诱变来制备编码突变蛋白的dna，并且可直接使用常规的多肽合成来制备突变蛋白。可通过参照作为本发明的示例提供的下列非限制性实施例更好地理解本发明。提供下列实施例以更全面地说明本发明的优选实施方案，然而不应以任何方式解释为限制本发明的宽泛范围。具体实施方式可通过参照作为本发明的示例提供的下列非限制性实施例更好地理解本发明。提供下列实施例以更全面地说明本发明的优选实施方案，然而不应以任何方式解释为限制本发明的宽泛范围。实施例1：与自身神经系统细胞结合的天然自身抗体(natab)的鉴定通过针对具有高的igg或igm单克隆峰(spike)(血液中大于10mg/ml)的候选物而筛查mayoclinic血清库，鉴定与神经元结合的天然血清人igm，所述血清库含有在45年内收集的超过140,000个样品，然后针对与活大脑皮质和小脑切片结合的抗体来测试血清(31)。然后将此类igm从阳性样品纯化出来，并针对以下方面做进一步测试：1)与分离的原代神经元的表面结合，2)作为支持神经突延伸的基质，3)面临应激源分子时保护神经元免于细胞凋亡的能力。该筛查方案的依据是用于在ms模型中鉴定与少突胶质细胞结合并促进髓鞘再生的人igm(22，如wo0185797的描述)。识别合适组织或细胞的表面似乎是治疗性igm的重要限定特征。已鉴定出两种新的、不同的血清来源的人神经元结合性igm(shigm12和shigm42)。这些血清来源的抗体的某些性质列举于表1中。已表明血清来源的shigm12和shigm42最初在体外支持神经突延伸以及有效的基质层粘连蛋白，并克服cns髓磷脂的神经突增生抑制(23)。进一步的研究表明，血清来源的shigm12改善tmev感染小鼠的自发功能，这通过小鼠的平均每小时自发性夜间活动评价(21)。与之前鉴定的igmnatab(shigm22和shigm46)形成对比，shigm12和shigm42都不促进脊髓髓鞘再生。表1-治疗性人igm自身抗体常常被视为致病性的。相比之下，如本文所证实，抗神经元的自身抗体(shigm12和shigm42和以其为基础的重组抗体)不杀死神经元。相反这些igm保护神经元免于死亡，促进神经突延伸，体内提高naa，在tmev模型中体内保护轴突，并改善tmev患病小鼠的夜间自发功能。神经元结合性抗体igm12和igm42靶向cns病变的神经元，并可适用于逆转神经元损失和/或改善神经元损伤或疾病的作用。神经元结合性人igm代表新的治疗剂类别，其独特用于涉及神经变性、神经元损伤或神经元死亡的各种疾病和病况。此类疾病包括而不限于ms、脊髓损伤、als、阿尔茨海默病、创伤性脑损伤、脑血管事件或中风。当全身施用于动物时，这些人igm的抗原性最小。与多种类型的活神经元的表面结合的人igm的鉴定和表征：针对与活cns组织切片(皮质和小脑)的神经元层结合的ab筛查具有高浓度igg或igm(＞10mg/ml)的血清样品。152个测试血清中，组织切片上17个人血清为阳性(23)。抗体shigm12和shigm42与用神经元标志物神经丝或βiii微管蛋白共标记的各种各样的神经元表面结合。这些包括小脑颗粒细胞(23)、皮质神经元、海马神经元、人颞叶活检样品的神经元(图1)和视网膜神经节细胞(数据未显示)。rhigm12使海马神经元的体细胞(soma)、神经突和生长锥染色(数据未显示)。这种交叉反应性表明，人igm可作用于在多种神经病况/疾病(例如ms、肌萎缩性侧索硬化或中风)中受影响的cns细胞。本文数据表明，shigm12或shigm42与神经元表面结合是碳水化合物依赖性的。培养中神经元的唾液酸酶处理消除两种人igm与细胞表面结合，而用烟曲霉毒素(fumonisin)b1阻断鞘脂合成或用piplc除去gpi连接的蛋白质不消除igm结合(23)。神经节苷脂是这些人igm的抗原的候选物。在共标记实验中，rhigm12与gm1共定位于神经元膜(参见实施例11和图21c)。虽然它们共享某些功能性质例如诱导神经突增生，但是shigm12和shigm42的确显示出差异，并且是各自独特的抗体。这在结合和免疫荧光研究中是显然的；它们以截然不同的方式标记小脑颗粒细胞表面。在培养的大鼠小脑颗粒细胞的免疫荧光研究中，通过使用这两种抗体标记的神经元膜模式截然不同(图2)。神经突膜的短区被shigm12结合，导致点状模式。神经突膜的较大区被shigm42结合，导致更多的节段模式。实施例2：人igm保护皮质神经元免于过氧化物诱导的死亡已表明，促进髓鞘再生的人igm保护培养中的少突胶质细胞免于过氧化物诱导的胱天蛋白酶3(33)(一种活性细胞凋亡的标志物)活化。如本文所示，在类似的方案中对shigm12或shigm42进行了评价。分别将shigm12或shigm42和过氧化物一起加到原代小鼠皮质神经元的培养物中，24小时后，测定胱天蛋白酶3活化的程度(图3)。培养的神经元用rhigm12处理导致80％胱天蛋白酶3活化的保护。用shigm42处理神经元对于约40％胱天蛋白酶3活化也是保护性的。与对照人igm(其导致免于胱天蛋白酶3活化的保护小于10％)相比，这些结果有显著差异(p＜0.01)。因此，神经元结合性shigm12或shigm42保护皮质神经元免于被过氧化物诱导的细胞死亡。因此，当提供神经细胞损害(或死亡)的诱导物或药剂时，igm12和igm42独立而显著地防止损害(或死亡)发生。实施例3：来源于shigm12的重组抗体构建shigm12的两种重组形式。每种使用与之前用于重链和轻链的重组igm22抗体(rhigm22)相同的表达载体(22、28、wo0185797)。载体包括在sv40启动子控制下表达的可选择dhfr基因。如下初步构建具有小鼠j链的部分人重组igm12抗体形式，此后在人/小鼠杂交瘤系f3b6细胞中产生抗体。使用下文描述的引物，按类似于之前描述的方式(6)，通过插入来自核苷酸数据库的具有前导序列的重链可变区cdna和来自核苷酸数据库的具有连接的前导序列的完全轻链cdna，来进行重组igm12抗体(pad12)载体构建。图4中描绘了该载体。图5中显示用于重组人igm12抗体的重链和轻链序列，其中标注了可变区和恒定区。用以制备rhigm12vh并通过重叠延伸(hortonrm等(1989)gene77：61-68)将其与来自数据库(m29812)的具有内含子(小写字母)的前导序列剪接的引物如下：(1)具有bspei位点的5′引物：tccgcacggtccggga(2)tccggacggtccgggacctcctgtgcaagaacatgaaacatctgtggttcttccttctcctggtggcagctcccagatgtgagtatctcagggatccagaca(3)cagggatccagacatggggatathggaggtgcctctgatcccagggctcactgtgggtctctctgttcacaggggtcctgtcccaggtgcagctgcaggagtcgggcccaggac(4)具有paci位点的3′引物：ccttaattaagacctggagaggccattcttacctgaggagacggtgaccagggttc。用于制备rhigm12vk并通过重叠延伸(soe)将其与数据库(小写字母，登录号x59312)的前导序列剪接的引物如下：(1)soelym12vk-ck的5′-ck引物：cgaactgtggctgcac(2)具有xho1的3′ck引物：ccgctcgagtatctaacactctcccctgtt(3)具有nhei的5′lym12vk：agcattactagctagctcaagactcagcctggacatggacatgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctactaggctccgaggtgccagatgtgacatccagatgaccca。如之前的描述(6)，通过电穿孔将具有合成抗体基因的载体导入f3b6杂交瘤细胞，并进行甲氨蝶呤(mtx)扩增。简而言之，使8百万个f3b6小鼠/人异源杂交瘤(heterohybridoma)细胞(美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)：atcc)与用bglii在800μl无血清培养基中线性化10分钟的10μgpad12载体一起孵育，届时将其在bioradgenepulsertm(biorad，hercules，ca，usa)中以0.2v电穿孔。在冰上的10分钟孵育后，将细胞在含有10％胎牛血清(fc)(gibco，carlsbad，ca，usa)的rpmi-1640中稀释至24ml，接种于24孔板后，在37℃下孵育；48小时后，使用1μm甲氨蝶呤(calbiochem，lajolla，ca，usa)，选择含有载体的细胞。在2周孵育时间后，将集落挑出到新板中，使之生长直到汇合。此时，收获上清液，通过酶联免疫吸附测定法(elisa)测定人igm的存在情况。在2个月期间内，用范围为1μm-200μm的递增剂量的甲氨蝶呤，进一步选出阳性集落。按此方式，形成产生大于10μg/mligm的细胞。如上构建的第一重组抗体不是完全人抗体。为了产生完全人形式，将cho细胞(gibcobrl目录号11619)用在e1a启动子的控制下编码重组重链和轻链的载体和在pci(promega)中表达人j链的构建体共转染。用powercho1和含10％cosmic克隆的imdm的50/50混合物中的递增剂量的甲氨蝶呤选择细胞，将通过elisa测量产生最多抗体的两种克隆进行亚克隆。使亚克隆扩增，将小瓶冷冻。两种重组igm12形式保持血清分离igm的神经元结合性和体内功效特性，但在小鼠中具有较短的半衰期(这可能是由糖基化的差异所致)。使用相似和相当的程序在相当的载体中构建重组higm42抗体。图6显示人igm42抗体重链和轻链的序列，其中标明可变区和恒定区。实施例4：单次外周剂量的rhigm12改善ms的tmev模型中的神经系统功能鉴于rhigm12保护培养中的原代神经元，及多发性硬化(ms)的tmev模型中的失能与轴突丧失关联的事实(2)，用rhigm12对tmev感染的小鼠进行治疗，用以评价减慢神经缺陷进展的能力。tmev感染后90天(此时轴突开始丧失)，各组(5只小鼠)用单次100μg剂量的rhigm12或对照人igm治疗。每组随机选择5只感染的小鼠，治疗前功能记录用来确定基线活动在组间没有不同。使用活动箱，在几周内连续3天按组跟踪小鼠(34，35)。夜间行为的改变是tmev介导的疾病中神经缺陷的灵敏量度。活动箱是透明的丙烯酸塑料盒(acrylicbox)，且相对的红外光束穿过外壳形成记录全部水平和垂直运动的网格。该测定的灵敏度反映了测量直立和步行的能力。在tmev感染的小鼠中，后肢变僵硬，直立减少。然而，在笼内四处的自发性步行不受严重影响。对于有僵硬后肢的小鼠而言，行走比直立容易，甚至患晚期疾病的小鼠在夜间也可能极其活跃。每个治疗组随机组合，在治疗前72小时，然后在治疗后每周72小时关养在活动箱内。在72小时分析期内，在从6pm到6am的12小时内，计算水平和垂直活动的平均每小时光束中断。在日间水平或垂直活动方面治疗组间没有差异，这通常低于600次中断/小时(小鼠睡眠时)。然而，在rhigm12治疗组中，记录到相对于其治疗前基线，自发性夜间水平活动增加(p＜0.01，第3周至第7周)(图7)。不与细胞结合的对照人igm不改善活动。与用血清来源的shigm12以及目前另外用重组抗体rigm12观察到的作用形成对比，在类似研究中，在相同条件下，人抗体shigm42不改变tmev感染小鼠的夜间活动。在相同的测定方式中，shigm42的备选给药参数对夜间活动产生不同而更积极的结果。功能改善的一种可能解释是有效的igm干扰病毒负载，其导致较少疾病。然而，这似乎不能说明问题。患慢性tmev疾病的小鼠用单剂量的rhigm12、shigm42或对照igm治疗，5周后收获脑和脊髓，然后用针对病毒蛋白2(vira1protein2)的探针，通过pcr测量tmevrna基因组转录物的水平。病毒转录物在组间没有不同(p＜0.01)(数据未显示)。实施例5：患脊髓疾病的小鼠脑干内的naa水平-整个脊髓内轴突保护的非侵入性替代标志物naa是与神经元功能有关的代谢物(36，37)。naa是脑中第二丰富的氨基酸，并且几乎只限于神经元。脑干中naa水平的保持是通过我们的小组使用tmev小鼠模型所证实的总体脊髓轴突健康的量度(8)。在较低的脊髓水平下轴突受损害时，脑干中的细胞死亡，降低naa。通过mrs测量的naa水平主要反应神经元密度。naa在其他神经细胞中表达，但naa的主要表达是在神经元中。纯化cns细胞的mrs谱的研究表明，naa信号幅度在神经元中占优势，而少突胶质细胞或星形细胞的naa信号幅度分别为神经元信号的5％和10％(38)。为了进一步评价shigm12和igm42通过保护轴突功能而改善小鼠活动的能力，我们采用非侵入性成像测定和传统形态学评价脊髓轴突。在tmev介导的疾病中，采用逆行追踪以表明脱髓鞘后的脊髓轴突功能障碍(5)。测量到从胸水平轴突到脑干核(brainstemnucleic)的逆行标记显著下降。脑干是许多细胞体驻留的位置，其沿脊髓长度伸出长的轴突束。此后使用之前报告的方案(8)，在tmev感染小鼠中，通过磁共振波谱学(mrs)对脑干的n-乙酰基天冬氨酸(naa)水平进行了评价(图8)。我们观察到，在患tmev诱发性疾病的小鼠中，脑干naa随时间推移而降低(图9)。naa水平在感染最初45天内下降，并在感染后270天保持低下。在tmev感染的sjl小鼠中，脊髓脱髓鞘的程度在感染后90天达到平稳期(39)。在该模型中，正是在这个时间点通过组织学发现轴突丧失显著(2)。因此naa是轴突功能障碍的灵敏量度。在最后的mrs采集后，从t6水平的脊髓横切面内外观正常的白质的6个区域中系统地对轴突进行采样。选择该水平，因为这提供来自整个脊髓中多个随机分布的脱髓鞘病变的轴突丧失的总体代表(39)。我们发现与未感染对照相比，在270天tmev感染的sjl小鼠中有30.5％较少的轴突(p＜0.001)。发现在脊髓的t6水平上，在脑干naa水平和轴突计数之间存在正相关(r＝0.823)(8)。单剂量的神经元结合性人igm保持脑干和脊髓中的轴突上的naa水平：对人神经元结合性igm改变tmev感染小鼠中的naa水平或轴突计数的能力进行了评价。因此，发现当tmev感染小鼠在脊髓轴突开始下降(dropout)(感染后90天)，用单次100μg剂量的shigm12或shigm42神经元结合性igm治疗时，在10周后测量时，胸脊髓的正常白质中髓鞘化的轴突密度较大。感染后90天，各组(10-15只小鼠)用单次100μg剂量的shigm12、shigm42、对照人igm或盐水治疗(图10)。治疗前及5和10周后，将每只小鼠放在小孔磁铁中，在脑干上收集mrs。10周时，杀死小鼠，收集脊髓，塑料包埋，并在t6水平切取用对苯二胺(paraphenylamindiamine)染色的横切面以使髓鞘显现，每切片收集6张图像，包括400,000μm外观正常的白质，轴突经自动计数。与治疗前水平相比，在用两种神经元结合性igm(shigm12、shigm42)治疗的组中，naa水平在5和10周后均提高。对照igm治疗小鼠趋于较低，盐水治疗小鼠保持不变。shigm12和shigm42治疗组的naa水平分别提高至9.13和9.3mm，其每一组都远低于未感染小鼠的12.0mm水平。当跨治疗组比较t6水平的轴突时(表2)，用shigm12或shigm42治疗的小鼠含有比盐水治疗组多的轴突(较之于15,198个轴突，为17,303和17,771个轴突，p＝0.008和p＜0.001)，但小于未感染小鼠中统计的轴突数(21,284个轴突)。这些结果表明，shigm12和rhigm12抗体的每一种都通过轴突保护而改善功能，如tmev模型中所表明的一样。虽然在tmev模型中shigm42抗体保护轴突，但是在初期试验中未观察到夜间活动评价中可证实的变化。在剂量范围研究之后，在夜间活动试验中，发现shigm42还实现活动加强。利用脑干mrs评价脊髓疾病小鼠模型中的轴突状态进一步证实了本发明；因此脑干中的naa用作这些人抗体的临床试验应用的优秀终点。naa水平提高的shigm42和shigm12治疗的小鼠还在胸正中脊髓含有更多的轴突。在感染后90天，各组10-15只tmev感染的sjl小鼠用单次100μg剂量的rhigm22、shigm42、shigm12、对照shigm39和盐水治疗。治疗后10周，取出脊髓，胸正中切片用ppd染色以显现髓磷脂。从每只小鼠对包括400,000μm2白质的6个区域进行取样，对髓鞘化的轴突进行计数(1)。表2中列出髓鞘化的轴突的平均绝对数/t6横切面±sem。表2用神经元结合性igm治疗保持脊髓中的轴突计数治疗t6轴突的平均数比较shigm4217,771±436p＜0.001shigm1217,303±505p＝0.008对照igm15,508±627盐水15,198±484p＝0.701未感染小鼠21,284±829实施例6：在不促进髓鞘再生的情况下神经元结合性igm保护轴突己鉴定出与少突胶质细胞结合并促进髓鞘再生(22，40，41)的若干种人igm(例如shigm22和shigm46)。如下文所示，神经元结合性igm提高神经元数，并且在无明显髓鞘再生的情况下仍起作用。不受理论束缚，认为作用机制是因轴突的直接活化(保护、神经突延伸)所致和/或通过激活先天免疫系统或适应性免疫系统以分泌保护神经元的因子。上文提供的结果清楚表明，抗体对轴突/神经元具有直接作用。在其中测量shigm12和shigm42介导的轴突保护和/或再生长的同一脊髓内，跨治疗组间的整体脱髓鞘、髓鞘再生和炎症没有不同(图11)。通过对代表沿脊髓长度的样品的10个脊髓横切面(6)的象限分级，来量化这些属性。rhigm22治疗组(阳性对照)显示预期的髓鞘再生增加，而shigm12和shigm42治疗的小鼠几乎不含脊髓髓鞘再生。因此，在不需要显著髓鞘再生的情况下，神经缺陷在tmev模型中得到改善(例如igm12)；此外，在所检查的时间范围内，对于轴突保护和/或再生长，髓鞘再生不是必需的。实施例7：rhigm12(具有人j链)和shigm42的血清半衰期为了测定人igm、rhigm12(具有人j链)和shigm42的半衰期，将100μg含有人j链的rhigm12或200μl盐水中的100μgshigm42注射到正常cd-1小鼠尾静脉(图12)。在限定的间隔内(15分钟、1、4、8、24、48小时)，通过心脏穿刺，从各组(3只小鼠)中收集血液。收集血清，使用夹心elisa测定人igmμ链的存在情况。对于rhigm12，在15分钟第一次收集和在8小时收集之间的半衰期为3.8小时。对于shigm42，在15分钟第一次收集和在24小时收集之间的半衰期为20.5小时。这些值把促进髓鞘再生的rhigm22的半衰期归为一类，所述rhigm22的半衰期在小鼠中为15小时(29)，在兔中为90小时。应用公式kelim＝(ln(cpeak)-ln(clow))/tinterval和t1/2＝0.693/kelim计算半衰期。实施例8：放射性标记的单克隆人igm穿过血脑屏障通常认为，分子量接近1百万的igm可能太大以致不能从循环中穿过血脑屏障(bbb)，从而进入cns(42，43)。然而，有某些证据表明一些igm的确穿过bbb。测量了正常和tmev感染的sjl小鼠中35s标记的rhigm12的组织分布(图13)。i.p.施用50μgrhigm12(1x107cpm)。4或24小时后给小鼠灌注盐水，快速收获组织，切碎，溶于闪烁液中。未感染小鼠的脑和脊髓在两个时间点都含有放射性标记。tmev感染小鼠的cns在4小时时间点含有的放射性标记是未感染小鼠的2倍-这在24小时时增加到4x。还发现，rhigm12(含和不含人j链两者)和shigm42能够穿过正常小鼠和作为阿尔茨海默病模型的samp8小鼠的bbb。因此，i.v.注射125i标记的人igm，2小时后收集脑。这些抗体的每一种在正常和患病小鼠脑中蓄积。不论igm通过大脑内注射还是通过i.v递送，这些抗体还逆转阿尔茨海默病小鼠模型的认知缺损。实施例9：腹膜内递送的人神经元结合性igm进入脱髓鞘脊髓病变并定位于神经丝阳性轴突hunter(44)对同位素标记的促髓鞘再生小鼠igm即sch94.03的研究利用放射自显影以证实放射性标记体内定位于tmev感染小鼠的脊髓，尤其是在超微结构上鉴定为少突胶质细胞的细胞。用35srhigm12进行了类似放射自显影研究。使用传统免疫细胞化学，我们检测出脊髓病变内的神经元结合性人igm(图14)。因此，将1.0mgrhigm12(含人j链)、shigm42或市售对照人igm(jacksonimmunoresearch)腹膜内施用于患有慢性脱髓鞘的tmev感染小鼠。4小时后，小鼠用低聚甲醛灌注，脊髓经纵向冷冻切片，针对人igmμ链的存在进行免疫染色。在接受rhigm12或shigm42的小鼠中，人μ链以表明轴突纤维的平行束定位于脱髓鞘病变。在病变内或无病变脊髓中未发现对照人igm。因此，显然神经元结合性人igmrhigm12或shigm42穿过tmev感染小鼠的bbb。相邻脊髓切片然后用抗神经丝(nf)ab(smi-32和34，sternberger)进行免疫标记，接着用荧光第二ab抗人μ链-fitc和抗小鼠-tritc进行免疫标记。共聚焦显微术表明，rhigm12和shigm42在平行纤维束中共定位于病变内的nf+轴突，并作为轴突纤维束在末端切断(图15)。实施例10：当在疾病发作时施用，rhigm12或shigm42不加重mog肽诱导的eae为了解决将自体反应性cns结合性igm施用于具有活跃的自身免疫的动物可能加重疾病的顾虑，在患eae的小鼠中测试了rhigm12和shigm42的作用。静脉内施用于患mog肽诱导的(200μg)eae的各组(10只c57bl6小鼠)单次100μg剂量的rhigm12、shigm42、对照人igm或盐水。各个小鼠在其临床评分达到1(尾无力)时进行治疗。然后由对治疗组不知情的研究人员跟踪小鼠，每隔一天记录体重，并对临床评分分级，直到小鼠达到免疫后28天或濒死。在体重或平均临床评分方面，治疗组间没有差异(图16，p＝0.14)。另外，针对每个脊髓象限的脑膜炎和脱髓鞘存在情况，对包括每只小鼠整个脊髓的10个脊髓横切面进行盲法分级(6)。治疗组间，脑膜炎(p＝0.825)或脱髓鞘(p＝0.766)的象限百分比中没有差异(图17)。因此发现，在tmev模型中对保护轴突中有效的单剂量的神经元结合性人igm不会使eae临床缺陷恶化，不会加快缺陷进展或增加脊髓病理。参考文献1.howe，c.l，j.d.adelson，和m.rodriguez.2007.absenceofperforinexpressionconfersaxonalprotectiondespitedemyelination.neurobioldis25：354-359.2.mcgavem，d.b.，p.d.murray，c.rivera-quinones，j.d.schmelzer，p.a.low，和m.rodriguez.2000.axonallossresultsinspinalcordatrophy，electrophysiologicalabnomalitiesandneurologicaldeficitsfollowingdemyelinationinachronicinflammatorymodelofmultiplesclerosis.brain123pt3：519-531.3.jones，m.v.，t.t.nguyen，c.a.deboy，j.w.griffin，k.a.whartenby，d.a.kerr，和p.a.calabresi.2008.behavioralandpathologicaloutcomesinmog35-55experimentalautoimmuneenoephalomyelitis.joumalofneuroimmunology.4.rodriguez，m.，e.oleszak，和j.leibowitz.1987.theiler′smurineencephalomyelitis：amodelofdemyelinationandpersistenceofvirus.critrevimmunol7：325-365.5.ure，d.r.，和m.rodriguez.2002.preservationofneurologicfunctionduringinflarmmatorydemyelinationcorrelateswithaxonsparinginamousemodelofmultipesclerosis.neuroscience111：399-411.6.mitsunaga，y.，b.ciric，v.vankeulen，ae.warrington，m.pazsoldan，a.j.bieber，m.rodriguez，和l.r.pease.2002.directevidenoethatahumanantibodyderivedfrompatientserumcanpromotemyelinrepairinamousemodelofchronic-progressivedemyelinatingdisease.fasebj16：1325-1327.7.vankeulen，v.p.，b.cinc，s.radhakrishnan，k.l.heckman，y.mitsunaga，k.lijima，h.kita，m.rodriguez，和l.r.pease.2006.immunomodulationusingtherecombinantmonocionalhumanb7-dccross-linkingantibodyrhigm12.clinexpimmunol143：314-321.8.denic，a.，a.bieber，a.warrington，p.k.mishra，s.macura，和m.rodriguez.2009.brainstem(1)hnudearmagneticresonance(nmr)spectroscopy：markerofdemyelinationandrepairinspinalcord.annalsofneurology66：559-564.9.duncan，i.d.1996.glialcelltransplantationandremyelinationofthecentralnervoussyslem.neuropatholapplneurobiol22：87-10010.fernandez，m.，a.giuiani，s.pirondi，g.d′intino，l.giardino，l.alce，r.levi-montalcini，和l.calza.2004.thyrcidhormoneadministrationenhancesremyelinationinchronicdemyelinatinginflammatorydisease.procnatlacadsciusa101：16363-16368.11craig，c.g.，v.tropepe，c.m.morshead，b.a.reynolds，s.weiss，和d.vanderkooy.1996.invivogrowthfactorexpansionofendogenoussubependymalneuralprecursorcellpopulationsintheadultmousebrain.jneurosci16：2649-2658.12.rodriguez，m.2007.effectorsofdemyelinationandremyelinationinthecns：implicationsformultiplesclerosis.brainpathol17：219-229.13.pitt，d.，p.werner，和c.s.raine.2000.glutamateexcitoxicityinamodelofmultiplesclerosisnatmed6：67-70.14okuda，y.，s.sakoda，h.fujimura，和t.yanagihara.1997.nitricoxideviaaninducibleisoformofnitricoxidesynthaseisapossiblefactortoeliminateinflammatorycellsfromthecentralnervoussystemofmicewithexperimentalalergicenoephalomyelitis.journa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)、pdl与层粘连蛋白或rhigm12基质中，并在含有2％(v/v)b27的神经基础培养基(neurobasalmedia)上生长。在神经元接种后12小时，测定神经突增生。神经元用4％低聚甲醛固定，用抗β3-微管蛋白抗体染色。丝状肌动蛋白(f-肌动蛋白)用德克萨斯红鬼笔环肽标记，而核用dapi标记。应用neuronj软件测量神经突长度，用excel(microsoft)处理，并用prism(graphpad)进行统计分析。3期神经元定义为具有多个神经突的神经元，其中作为轴突通过tau1染色测定的最长神经突(dotti等，1988)是次最长神经突长度的至少2倍。tau1不对称地富集在轴突远部。相比之下，2期神经元具有多个对称神经突。原代培养的神经元的免疫染色、免疫沉淀反应和蔗糖密度梯度分级分离：1-3天体外(div)培养的海马神经元在用4％低聚甲醛固定后，用0.2％tritonx-100透化，接着进行免疫染色。图像使用olympus直立显微镜拍摄，使用photoshop(adobe)处理。在不连续蔗糖梯度中通过超速离心测定rhigm12分布。简而言之，让rhigm12在4℃下与活的div7皮质神经元结合30分钟，然后在冰冷的裂解缓冲液(50mmtris.hcl，ph7.4、150mmnacl、1mmedta、1％tritonx-100和蛋白酶抑制剂混合物)裂解30分钟。将神经元裂解物与等体积的100％(w/v)蔗糖混合。将混合物转移至离心管，依次覆盖8ml35％蔗糖和3.5ml5％蔗糖。在4℃下以2x105g离心20小时后，从梯度顶部收集6个级分(各2ml)。将每个级分和沉淀溶于sds-样品缓冲液中，进行western印迹法。对于rhigm12与细胞骨架蛋白质的免疫共沉淀，div7活皮质神经元在4℃下用rhigm12处理30分钟，在含有0.5％np-40的裂解缓冲液中裂解。rhigm12通过蛋白质l-琼脂糖珠粒俘获，而β3-微管蛋白通过g蛋白-树脂(thermo)俘获。对于双重标记，将活神经元在冰上用rhigm12染色，在固定后，用0.2％tritonx-100透化。活神经元提取和固定在含有60mmpipes、25mmhepes、5mmegta、1mmmgcl2、4％低聚甲醛和0.1％tritonx-100的缓冲液中进行。该实施例中的抗体和其他试剂：抗β3-微管蛋白(promega)；抗肌动蛋白、edta、聚-d-赖氨酸、甲基-β-环糊精和菲律宾菌素(sigma)；抗tau1、抗窖蛋白-1和抗转铁蛋白受体(millipore)；德克萨斯红-鬼笔环肽、霍乱毒素b、神经基础培养基和b27(invitrogen)；蛋白酶抑制剂片剂(roche)。重组人igm即rhigm12促进轴突形成：为了进一步了解igm对神经元分化和基本分子机制的作用，使用重组rhigm12，用培养的海马神经元进行了神经突增生测定法。海马神经元经历3个分化阶段形成轴突(dotti等，1988)。多重处理始于细胞体。快速生长的神经突之一分化成轴突，其他稍后分化成树突，这可分别通过tau1和map2的差别分布来鉴定(lewis等，1989；(kanai和hirokawa，1995)。我们发现rhigm12，当作为基质提供时，大大地促进神经元分化。接种后12小时内，在rhigm12上生长的海马神经元发育成多个神经突，其中之一与相邻神经突比较长得多。相比之下，接种在聚-d-赖氨酸(pdl)上的神经元具有多个对称神经突(图18a，b)。在测量神经突长度后，我们发现，接种在rhigm12(n＝86)的神经元相对于pdl(n＝74)具有显著较长的总神经突长度(195.8μm相对于150.7μm，p＝0.0056)(图18c)。最长神经突长度超过两倍(117.1μm相对于51.8μm，p＜0.0001)(图18d)，但是发现在次最长神经突长度上无显著差异(38.7μm相对于33.3μm，p＝0.0782)(图18e)。在rhigm12上生长的神经元带有较少初期神经突(2.9相对于4.1，p＜0.0001)(图18f)，其大部分为3期神经元表型(rhigm12上的72％相对于pdl上的18％)(图18g)。这些结果表明，rhigm12当作为基质提供时促进神经元分化。神经元分化的特有特征是极化轴突增生并与树突分开。我们观察到，rhigm12促进神经突延伸，具有一个显著较长的神经突。为进一步验证来自3期神经元的这些最长神经突发育成为轴突，将接种在不同基质上的海马神经元用抗tau1和map2抗体染色(图19)。在pdl中生长的神经元中tau1染色弱(图19a，d)，但在接种在pdl-层粘连蛋白(图19b，e)或rhigm12(图19c，f)上的神经元中强得多。层粘连蛋白是用于神经元分化和轴突形成的典型基质(chen等人.，2009)，并用作阳性对照。比较来自生长在pdl上的神经元的tau1强度(图19d)，tau1的分布不对称地富集在最长神经突的远部，并且在接种于pdl-层粘连蛋白(图19e)或rhigm12(图19f)上的神经元中大得多。相比之下，map2使所有神经突的近端部分染色(图19a2-c2)。该结果表明，来自生长在rhigm12和层粘连蛋白两者上的3期神经元的最长神经突为轴突。这些研究证实，rhigm12支持多种神经元类型的神经突增生，并且rhigm12驱动轴突形成。rhigm12诱导的神经元膜微结构域群聚生长在rhigm12作为基质的海马神经元显示分化增强(图18和19)。然而，当将rhigm12施用于浸泡(bath)培养基时，我们未观察到rhigm12诱导的神经突增生(数据未显示)。该观察表明，为发挥其功能，rhigm12需要作为胞外基质分子提供。为进一步了解rhigm12-神经元膜相互作用，活的神经元首先用rhigm12处理，然后固定，用菲律宾菌素或霍乱毒素b(ctb)(其分别结合胆固醇或神经节苷脂gm1)双染(shogomori和futerman，2001)。rhigm12、ctb和菲律宾菌素均匀地标记未处理对照神经元的细胞表面(图20a)。相比之下，用rhigm12于37℃处理30分钟诱导神经元膜重构(图20b，c)。首先，rhigm12在膜上聚集成“斑块”状结构(图20b1，c1)，这在未处理的神经元(图20a)或用不结合神经元膜的对照igm抗体处理的神经元中未观察到(数据未显示)。其次，在细胞体、神经突干和生长锥的神经元膜上形成胆固醇(图20b2)和gm1(图20c2)群聚物两者。第三，聚集的rhigm12与群聚的胆固醇(图20b3)或gm1(图20c3)共定位，尤其在生长锥中心域(图20b-c，高放大倍数)、但不在生长锥周围共定位。这些结果表明，浸泡施用的rhigm12诱导神经元膜重排，即使它不支持神经突/轴突延伸。有可能rhigm12当作为基质提供时，可将膜分子募集至rhigm12-神经元膜接触位点，并导致定向信号传导。rhigm12结合的脂筏基于在冷的条件下非离子去污剂提取的生物化学研究已被用来证实含有胆固醇和鞘糖脂的脂筏的存在(chichili和rodgers，2009)。然而，只有有限的关于脂筏的形态信息，因为纳米尺度大小超出光学显微镜的分辨率(lingwood和simons，2010)。rhigm12诱导膜群聚并与含有胆固醇膜域和含有gm1膜域共定位的观察结果(图20)提出了rhigm12与脂筏域结合的可能性。由于神经元膜富含胆固醇和鞘糖脂，其具有较高的熔化温度(tm)(samsonov等，2001)，因此膜温度降低到tm以下，可利于在37℃下更动态的脂筏及其结合分子显现。为了检验该假设，使活神经元冷却至4℃，接着rhigm12染色。与在37℃下固定的其中rhigm12均匀结合的神经元(图21a)形成对比，在4℃下rhigm12标记大得多的点状结构。另外，神经元生长锥收缩(图21b)。我们利用了脂筏是胆固醇依赖性膜域和胆固醇耗竭破坏其结构的事实(chichili和rodgers，2009)。培养的海马神经元首先用甲基-β-环糊精(mβcd)处理以消耗胆固醇(ko等，2005)，然后冷却至4℃，接着在固定后进行rhigm12和ctb染色。在胆固醇耗竭后，rhigm12与神经元膜中的点状结构结合，与ctb标记的gm1共定位(图21c)。因为gm1驻留在脂筏微结构域内且rhigm12诱导gm1群聚(图20)，因此我们得出结论，rhigm12结合含gm1的微结构域，这不依赖于神经元膜胆固醇。这些实验证实脂筏作为不同的形态结构存在，其均匀地插入膜内(图20a和图21a)或聚集形成较大域(图20b和c，图21b和c)。这些结果表明rhigm12结合在脂筏域与非脂筏域之间运输的分子，这取决于与其他分子的生物物理相互作用。我们进一步检验了rhigm12与脂筏结合的假设。由于脂筏在冷的温度下定位于耐非离子去污剂的膜(drm)中(samsonov等，2001)，因此对在4℃下制备的皮质神经元裂解物中rhigm12的定位进行了分析。神经元裂解物用抗人第二igm抗体的印迹显示在沉淀和上清液中都存在膜结合的rhigm12，但非神经元结合性对照igm抗体只存在于洗出液中(图22a)。这些观察结果表明，rhigm12被分成两个库，一个定位在上清液中的“去污剂可溶性”级分中，另一个与“去污剂不溶性”沉淀结合。在第二项实验中，皮质神经元首先用rhigm12标记，然后在4℃下通过蔗糖密度梯度分级分离。不同级分的印迹表明，rhigm12位于还含有窖蛋白-1(脂筏标志物)的较轻级分中，但不位于富含转铁蛋白受体的非脂筏级分中(图22b)。然而，即使在这种严格的分级分离过程中(1％tritonx-100，并在2x105g下超速离心)，仍在沉淀中检测到一些rhigm12，沉淀主要含有去污剂不溶性细胞骨架(图22b)。虽然微管蛋白(sorice等，2009)和肌动蛋白(levitan和gooch，2007)两者都存在于脂筏中，但在脂筏中仅检测到β3-微管蛋白，大部分的肌动蛋白进入非脂筏级分(图22b)。这些数据表明存在两个膜结合的rhigm12库，一个存在于脂筏中，另一个存在于沉淀中。rhigm12与微管结合我们的数据显示聚集的rhigm12定位于微管占优势的区域，例如细胞体、神经突干和生长锥中心域(图20)(forscher和smith，1988)。连同膜结合的rhigm12分成两者均含有β3-微管蛋白的脂筏和沉淀级分的事实(图22b)，这些研究结果表明rhigm12可与细胞骨架组分结合。为了检验该假设，海马神经元用rhigm12处理以诱导膜重排，然后同时固定，并在37℃下用含有0.1％tritonx-100的4％低聚甲醛提取。提取后，rhigm12标记的去污剂不溶性膜点与神经突干中的成束微管束对齐(图23a2)。在生长锥中，rhigm12主要定位于被不成束微管占据的中心域，但不位于富含f-肌动蛋白的生长锥周围(图23a3和a4)。这些结果表明，rhigm12可与微管结合。我们发现rhigm12与gm1共定位(图21c)。已表明gm1被膜微管蛋白锚定在小脑颗粒神经元中，并在交联后被抗微管蛋白抗体拉下(pulleddown)(palestini等，2000)。因此，可能rhigm12与含有微管蛋白的膜微结构域结合。为了进一步验证这个假设，用得自在4℃下rhigm12处理的活皮质神经元的细胞裂解物进行了改进的pull-down实验。我们发现rhigm12和β3-微管蛋白两者彼此间免疫共沉淀(图23b)，这就表明rhigm12和β3-微管蛋白作为复合体存在。igm分子具有五聚体结构，分子量约为900kda。为了排除rhigm12与微管蛋白结合或直接与神经元裂解物中的微管结合的可能性，pull-down测定法用不结合rhigm12但却的确表达β3-微管蛋白的n2a成神经细胞瘤细胞进行(图25a)。rhigm12既不与β3-微管蛋白结合，也不存在于沉淀中。它只在n2a成神经细胞瘤细胞裂解物的上清液中检测到(图25b)。这些结果总体上证实脂筏介导rhigm12、其抗原和微管间的结合。本文的数据证实，完全人重组igm即rhigm12当作为基质提供时，通过促进原代培养的海马神经元中的轴突增生，而驱动神经元极化(图18和19)。rhigm12在神经元表面上聚集，并诱导胆固醇和神经节苷脂gm1的群聚(图20)。rhigm12与gm1共定位(图21)。神经元裂解物的蔗糖梯度分级分离表明，膜结合的rhigm12被分成两个库：一个与脂筏结合，另一个与沉淀结合(图22)。通过用非离子去污剂提取活神经元，我们进一步表明，膜结合的rhigm12与微管共定位，并与β3-微管蛋白共免疫沉淀(图23)。上述内容表明，rhigm12与脂筏微结构域结合并与之相互作用，并且进一步表明rhigm12结合的脂筏域将信号传导传送至微管。结果是，rhigm12介导微管稳定，这驱动轴突增生。该实施例证实，rhigm12选择性地促进原代海马神经元的轴突增生(图18和19)。最近，我们表明人血清来源的igm即shigm12改善发生广泛轴突变性和丧失的多发性硬化动物模型的神经系统功能(rodriguez等人.，2009)。这些研究支持higm12通过促进轴突生长而发挥其功能的观点。神经元通过调节神经突延伸的受控的内在程序指定轴突。发育中的神经元启动多个神经突。神经突之一分化成轴突，其他成为树突。相邻神经突彼此竞争。最长神经突，也是具有最快延伸率的神经突，最先中断对称神经突延伸，发育成轴突，而其他神经突延伸得慢得多，稍后发育成树突(dotti等人.，1988；goslin和banker，1989)。f-肌动蛋白和微管是参与神经突延伸和轴突形成的两种主要的细胞骨架。我们对轴突规格的了解在逐步发展。主要位于生长锥周围的f-肌动蛋白，被视为起主要作用。在神经突干占优势并且限于生长锥中心域的微管，被认为次于f-肌动蛋白。最近发现微管在轴突生长中也起决定性作用。微管能够动态地探测(exploring)生长锥肌动蛋白网。微管稳定足以诱导轴突形成(witte和bradke，2008)。我们的结果，即rhigm12和β3-微管蛋白共免疫沉淀、rhigm12与微管共定位以及rhigm12在去污剂提取后存在于沉淀中，不仅仅支持微管作为中心作用者(player)。另外，该数据在本领域中提供微管与神经元膜直接相互作用的第一个证据。这些研究结果支持rhigm12与跨膜级联相互作用或结合的观点，所述跨膜级联将胞外信号传送至微管。微管在例如生长锥中生长和缩回的动态特性，使它们能驱动神经元膜运动(dent和kalil，2001)。稳定的微管锚定神经元膜。动态和稳定性微管的存在和/或这两种状态间的转换精心设计神经突增生的过程以指定轴突。因此，igm12通过实现微管稳定性而提高轴突延伸。脂质和蛋白质连续掺入细胞膜，然后分配到微结构域(所谓的脂筏)。膜筏一般定义为纳米尺度(10-200nm)、异质的和动态的富含甾醇和鞘脂的膜区室(lingwood和simons)。我们提出rhigm12与脂筏结合。首先，我们观察到，rhigm12在神经元膜上聚集，并诱导胆固醇或神经节苷脂gm1的群聚(图20)。这些结果表明rhigm12与含有胆固醇和gm1的脂筏域结合。小筏可与脂质和/或蛋白质相互作用。各个微小筏可稳定并融入整合信号和调节信号传导途径的强度和幅度的较大平台。具有五聚体结构的igm抗体，可通过交联邻近抗原(受体)和/或使抗原足够近以提高交联或相互作用，而放大信号。因此，可群聚交联的抗原和结合的信号传导分子。其次，我们表明当使海马神经元冷却至4℃时，rhigm12与神经元膜上大得多的点结合(图21)。胆固醇和鞘脂具有高的熔化温度(tm)。在低于tm的温度下处理神经元可降低膜动态，这利于聚集性脂筏的显现。连同甚至在胆固醇耗竭后rhigm12与gm1共定位的研究结果(图21)，这些结果表明rhigm12与同gm1共定位的神经元膜分子结合并相互作用。准确身份(identity)不明，但是我们之前的研究结果即唾液酸酶处理培养的大鼠小脑颗粒神经元破坏shigm12结合，表明shigm12结合的表位是碳水化合物(warrington等，2004)。第三，在神经元裂解物经蔗糖分级分离后，膜结合的rhigm12定位在较轻的级分，其还含有脂筏标志物窖蛋白-1。总之，我们的结果支持rhigm12与脂筏结合的假设。从神经元膜外叶到胞内细胞骨架的信号级联对轴突规格是最重要的。rhigm12聚集体分布于神经突干和生长锥中心域(图20)，其由微管占优势而不是丝状肌动蛋白占优势(图23)。一些rhigm12聚集体是去污剂不溶性的，在去污剂提取后定位于束状微管束中(图23a)。这些观察结果表明另一rhigm12结合的分子库的存在，这可能不同于结合脂筏的库。蔗糖分级分离研究进一步证实，存在定位于去污剂不溶性沉淀中的rhigm12结合的分子库(图22b)，其可以是如图23a检测到的与微管定位的库。这些结果证实一些rhigm12与细胞骨架组分(可能是微管)结合。与上清液中的“去污剂不溶性”分子结合的rhigm12(图22a和图23b)与β3-微管蛋白(图23b)共免疫沉淀的研究结果表明，rhigm12结合的分子和β3-微管蛋白可在脂筏中作为复合体存在。然而，rhigm12不可能与β3-微管蛋白直接相互作用，因为rhigm12不拉下rhigm12不结合的n2a成神经细胞瘤细胞中的β3-微管蛋白(图25)。因此细胞骨架和脂筏结合的rhigm12两者与定位在微管蛋白附近的分子结合。这种观点受到rhigm12与gm1共定位(图21c)，以及交联反应后抗微管蛋白抗体拉下gm1的观察结果的有力支持(palestini等人.，2000)。脂筏域中rhigm12结合的分子在神经突增生和轴突延伸的过程中可不断地掺入细胞骨架。这种假设受到以下研究结果的支持：在生长锥区rhigm12在中心域聚集(图3和6a)以及在37℃下是去污剂不溶性(图23a)。总之，公开了higm12与脂筏结合并影响脂筏的动态，这介导从higm12到微管的信号传导。f-肌动蛋白是否参与rhigm12诱导的信号传导尚不清楚。多个证据表明，肌动蛋白和肌动蛋白-结合蛋白两者与脂筏结合(levitan和gooch，2007)。肌动蛋白丝和微管在协调性细胞运动中积极地相互作用(rodriguez等，2003)，所述细胞运动还包括神经元。因此肌动蛋白也可能在rhigm12诱导的信号传导中起作用。与β3-微管蛋白一起，少量肌动蛋白被rhigm12拉下(图26b)。因此rhigm12结合含有肌动蛋白和β3-微管蛋白两者的脂筏。然而，rhigm12标记的点保持在生长锥的极边缘，而当在4℃下处理神经元时，f-肌动蛋白网从生长锥周围收缩(图26a)。在蔗糖梯度分级分离后，肌动蛋白主要定位于非筏级分，在去污剂不溶性沉淀中仅检测出少量肌动蛋白(图22b)。这些观察结果表明，f-肌动蛋白极具动态，且大部分在冷的条件下和/或通过去污剂提取而解聚。因此，肌动蛋白可参与rhigm12介导的信号传导。我们得出的结论是，人igmrhigm12结合并识别脂筏，微管是下游靶标之一。rhigm12当作为基质提供时促进轴突延伸。作为基质，rhigm12被固定，并在其与神经元膜的相互作用中受限。固定化的rhigm12可产生跨神经元膜的信号梯度，如通常在形态发生素诱导的信号传导所观察的一样(schmitt等，2006)。相比之下，rhigm12的浸泡施用只可促进随机的脂筏群聚(图20)，并且可能不足以中止对称神经突增生和增强轴突延伸。简而言之，我们的结果支持图24中提出的模型。神经元膜含有筏微结构域和非筏微结构域两者。有两个筏域库，其之一与微管结合(图24a)。2)rhigm12与筏域结合并使筏域群聚，这促进微管稳定并锚定膜(图24b)。3)在生长锥，rhigm12诱导的筏群聚可提高生长锥周围向中心域转换，中断对称神经突增生以指定轴突形成(图24c)。参考文献allenja，halverson-tambolira，rasenickmm(2007)lipidraftmicrodomansandneurotransmittersignalling.natrevneurosci8：128-140.barnesap，polleuxf(2009)establishmentofaxcn-dendritepolarityindevelopingneurons.annurevneurosci32：347-381.chenzl，haegeliv，yuh，stricklands(2009)corticaldeficiencyoflaminingammalimpairstheakt/gsk-3betasignalingpathwayandleadstodefectsinneuriteoutgrowthandneuronalmigration.devbiol327：158-168.chichiligr，rodgersw(2009)cytoskeleton-membraneinteractionsinmembraneraftstructure.cellmollifesci68：2319-2328.condec，caceresa(2009)microtubuleassembly，organizationanddynamicsinaxonsanddendrites.natrevneurosci10：319-332.deandafc，pollarolog，dasilvajs，camolettopg，feiguinf，dotticg(2005)centrosomelocalizationdeterminesneuronalpolaity.nature436：704-708.dentew，kalilk(2001)axonbranchingrequiresinteractionsbetweendynamicmicrotubulesandactinfilaments.jneurosci21：9757-9769.dentew，callawayjl，szebenyig，baaspw，kalilk(1999)reorganizationandmovementofmicrotubulesinaxonalgrowthconesanddevelopinginterstitialbranches.jneurosci19：8894-8908.dotticg，sullivanca，bankerga(1988)theestablishmentofpolaritybyhippocampalneuronsinculture.jneurosci8：1454-1468.forscherp，smithsj(1988)actionsofcytochalasinsontheorganizationofactinfilamentsandmicrotubulesinaneuronalgrowthcone.jcellbiol107：1505-1516.goalink，bankerg(1989)experimentalobservationsonthedevelopmentofpolaritybyhippocampalneuronsinculture.jcellbiol108：1507-1516.herdegent，skenep，bahrm(1997)thec-juntranscriptionfactor--bipotentialmediatorofneuronaldeath，survivalandregeneration.trendsneurosci20：227-231.higginbothanhr，gleesonjg(2007)thecentrosomeinneuronaldevelopment.trendsneurosci30：276-283.kanaiy，hirokawan(1995)sort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品。在40年内收集的115,000个血清样品，含有高浓度的来自患单克隆丙种球蛋白病的患者的单克隆抗体。我们合成并测试了重组人igm22，其在动物模型中具有促髓鞘再生活性(mitsunaga2002；warrington2000)。在一个实施方案中，本实施例产生gmp质量单克隆抗体，其在神经变性、神经损伤和/或损害，例如在人sci情况下或在暴露出cns神经元的脱髓鞘情况下，可用于治疗、预后、诊断和/或预防应用。这些研究对在创伤性sci后促进神经元存活从而导致保留神经系统功能的人igm抗体进行了进一步表征和评价。对在sci后的行为试验和轴突数的形态测量进行了评价，测定了神经系统功能的内源保留和抗体介导的保留间的差异。在sci后用轴突保护性抗体和轴突延伸性抗体的治疗与抗体对照的比较被用来针对特异性抗体介导的活性，对神经系统功能保留的差异进行表征。在生理条件下，自细胞分离含有质膜蛋白质-脂质双分子层的膜小泡。使用来自正常cns和脊髓受损组织的分离的神经元、胶质细胞、突触体和髓磷脂膜的微泡制备物包被spr传感器的纳米孔。筛查人单克隆抗体血清样品和重组抗体样品以测定特定膜类型的结合动力学。在sci后使用未冷冻未固定的“活的”病理组织，针对特异性结合，测试了在生理条件下与未冷冻未固定的“活的”细胞和组织(如使用spr传感器证实)的表面质膜特异性结合的人单克隆抗体。针对在sci后在啮齿动物治疗中的适用性和活性，对显示与脊髓病变结合的人单克隆抗体作进一步地表征。方案设计。使用改良的动脉瘤夹(fejota小鼠夹，3g或8g闭合力)，在10周龄雌性(18-22g)c57bl/6j小鼠(jacksonlaboratories)中，在t9水平产生压伤。该sci模型不仅包括最初的冲压(impact)，还包括持续的压迫阶段，其促进微囊泡空腔化(microcysticcavitation)、轴突变性和稳固的星形胶质增生，这些都是人创伤性sci的标志(joshi和fehlings2002)。在sci后使用大鼠的basso，beattie，bresnahan(bbb)运动评定量表和运动的basso小鼠量表(bassomousescale.bms)进行行为试验，测定以评价神经缺陷。该技术描述于图31。然后在啮齿动物脊髓压伤后，由病理病变制备活的未冷冻未固定的离体组织切片。使用保持在生理条件下经免疫荧光(if)染色的切片筛查人igm抗体结合的免疫反应性。在脊髓压伤后，腹膜内施用人抗体，包括rhigm12和shigm42或rhigm42，急速治疗小鼠。测量了人抗体促进轴突保护或组织修复的能力。使用bbb和bms量表的行为试验在sci后5周时间期间以有规律的间隔进行。在sci后30分钟，将单次0.5mg剂量的人抗体i.p.施用于小鼠。各组小鼠(15只小鼠)接受促进神经元保护、神经突增生的人抗体、不与细胞结合的对照人抗体或对照。将每只小鼠一周一次关养在自动红外活动箱中过夜(mikami等，2002)，记录自发性直立(后肢无力的量度)和水平活动(accuscaninc，ohio)。另每周收集传统bbb评分。盲法进行功能评价。治疗后4周，将荧光-金(fluoro-gold)和坚牢蓝在较低胸水平注射至4只小鼠的脊髓。一周后，给小鼠灌注，取出脑和脊髓。通过荧光显微术(ure和rodriguez2002)，统计组间脑干的网状核、前庭神经核和红核中逆行标记的细胞体。脑干(振动切片机切片)中标记的细胞体的数目反映在整个脊髓的功能性轴突的水平。对沿脊髓每1mm切取的组织横切面进行免疫细胞化学(针对β淀粉状蛋白蓄积)。切片中β淀粉状蛋白聚集体的数目反映出在该水平上的轴突转运受损和轴突功能障碍。损伤后5周，用甲醛/戊二醛给剩余小鼠灌注，取出脊髓。将每隔1mm的包含脊髓病变部位的切块包埋在环氧树脂塑料中，并切片(1微米)，用对苯(paraphenylene)染色以显现被髓磷脂环绕的受保护的轴突。使用microsuite软件(olympus)，测量病变横切面的面积、受保护的轴突数和病变免疫细胞浸润。测量轴突频率，进行组间比较(mcgavern等人.2000；rodriguez等人.1987)。在不知晓实验组的情况下，所有分析按编号的盲样品进行。受保护的轴突表示为受保护的轴突数/mm2病变。实验组和对照组间数据的成对比较应用mann-whitney秩和检验。参考文献rodriguezm，warringtonae，peaselr.humannaturalautoantibodiesinthetreatmentofneurologicdisease.neurology2009；72：1269-1276.imh，lesuffleura，lindquistnc，ohsh.plasmonicnanoholesinamultichannelmicroarrayformatforparalelkineticassaysanddifferentialsensing.analyticalchemistry.2009；81：2854-2859maynardja，lindquistnc，sutherlandjn，lesuffleura，warringtonae，rodriguezm，andohs-h.nextgenerationsprtechnologyofmembrane-boundproteinsforligandscreeningandbiomarkerdiscovery.jbiotech2009；4(11)：1542-1558nagpalp，lindquistnc，ohsh，norrisdj.ultrasmoothpatternedmetatsforplasmonicsandmetamaterials.science.2009；325：594-597.bieberaj，warringtona，asakurak，ciricb，kaverisv，peaselr，rodriguezm.2002.humanantibodiesacceleratetherateofremyelinationfollowinglysolecithin-induceddemyelinationinmice.glia37(3)：241-249.bregmanbs，kunkel-bagdene，schnelll，daihn，gaod，schwabme.1995.recoveryfromspinalcordinjurymediatedbyantibodiestoneuritegrowthinbibitors.nature378(6556)：498-501.caronip，schwabme.1988.antibodyagainstmyelin-associatedinhibitorofneuritegrowthneutralizesnonpermissivesubstratepropertiesofcnswhitematter.neuron1(1)：85-96.corseam，bilakmm，bilaksr，leharm，rotbsteinjd，kunclrw.1999.preclinicaltestingofneuroprotectiveneurotrophicfactorsinamodelofchronicmotorneurondegeneration.neurobioldis6(5)：335-346.ellezamb，bertrandj，derghamp，mckerracherl2003.vaccinationstimulatesretinalganalioncellregenerationintheadultopticnerve.neurobioldis12(1)：1-10.estevezag.spearn，manuelsm，radir，henddrsonce，barbeitol，beckmanjs.1998.nitricoxideandsuperoxidecontributetomotorneuronapoptosisinducedbytrophicfactordeprivation.jneurosci18(3)：923-931.festoffbw，ameenuddins，amoldpm，wonga，santacruzks，citronba.2006.minocyclineneuroprotects，reducesmicrogliosis，andinhibitscaspaseproteaseexpressionearlyafterspinalcordinjury.jneurochem97(5)：1314-1326.hemendingerra，armstrongej，3rd，persinskir，toddj，mougeotjl，volvovitzf，rosenfeldj.2008.huperzineaprovidesneuroprotectionagainstseveralcelldeathinducersusinginvitromodelsystemsofmotorneuroncelldeathneurotoxres13(1)：49-61.howecl，bieberaj，warringtonae，peaselr，rodriguezm.2004.antiapoptoticsignalingbyaremyelination-promotinghumanantimyelinantibody.neurobioldis15(1)：120-131.huangdw，mckerracherl，braunpe，davids.1999atherapeuticvaccineapproachtostimulateaxonregenerationintheadultmammalianspinalcord.neuron24(3)：639-647.joshim，fehlingsmg.2002.developmentandcharacterizationofanovel，gradedmodelofclipcompressivespinalcordinjuryinthemouse：part1.clipdesign，behavioraloutcomes，andhistopathology.jneurotrauma19(2)：175-190.mcgavemdb，murraypd，rivera-quinonesc，schmelzerjd，lowpa，rodriguezm.2000.axonallossresultsinspinalcordatrophy，electrophysiologicalabnormalitiesandneurologicaldeficitsfollowingdemyelinationinachronicinflammatorymodelofmultiplesclerosis.brain123pt3：519-531.mctiguedm，tripathir，weip.2006.ng2colocalizeswithaxonsandisexpressedbyamixedcellpopulationinspinalcordlesions.jneuropatholexpneurol65(4)：406-420.mikamiy，todam，watanabem，nakamuram，toyamay，kawakamiy.2002.asimpleandreliablebehavioralanalysisoflocomotorfunctionafterspinalcordinjuryinmice.technicalnote.jneurosurg97(1suppl)：142-147.mitsunagay，ciricb，vankeulenv，warringtonae，pazsoldanm，bieberaj，rodriguezm，peaselr.2002.directevidencethatahumanantibodyderivedfrompatientserumcanpromotemyelinrepairinamousemodelofchronic-progressivedemyelinatingdisease.fasebj16(10)：1325-1327.pannur，christiedk，barbosae，singhl，singhak.2007，post-traumalipitortreatmentpreventsendothelialdysfunction，facilitatesneuroprotection，andpromoteslocomotorrecoveryfollowingspinalcordinjury.jneurochem101(1)：182-200.pirkol，ciricb，gamezj，bieberaj，warringtonae，johnsonaj，hansondp，peaselr，macurasi，rodriguezm.2004.ahumanantibodythatpromotesremyelinationentersthecnsanddecreaseslesionloadasdetectedbyt2-weightedspinalcordmriinavirus-inducedmurinemodelofms.fasebj18(13)：1577-1579.rodriguezm，lennonva，benvenisteen，merrillje.1987.remyelinationbyoligodendrocytesstimulatedbyantiserumtospinalcord.jneuropatholexpneurol46(1)：84-95.warringtonae，asakurak，bieberaj，ciricb，vankeulenv，kaverisv，kylera，peaselr，rodriguezm.2000.humanmonoclonalantibocliesreactivetooligodendrocytespromoteremyelinationinamodelofmultiplesclerosis.procnatlacadsciusa97(12)：6820-6825.warringtonae，bieberaj，ciricb，peaselr，vankeulenv，rodriguezm.2007.arecombinanthumanigmpromotesmyelinrepairafterasingle，verylowdose.jneuroscires85(5)：967-976.warringtonae，bieberaj，vankeulenv，ciricb，peaselr，rodriguezm.2004.neuron-bindinghumanmonoclonalantibodiessupportcentralnervoussystemneuriteextension.jneuropatholexpneurol63(5)：461-473。实施例13：多发性硬化模型-剂量：反应评价在小鼠多发性硬化模型中，针对其促进功能改善和加强髓鞘再生、神经突增生的过程或两者的能力，对igm抗体进行了评价。该模型包括使用微小rna病毒泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒(tmev)诱导cns的持续性慢性进行性脱髓鞘病变，其特性类似于使用类似于warrington等人.，2007的方法在人ms中发现的特性。给雌性和雄性小鼠(约8w，sjl/j品系)注射泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒(2x105个蚀斑形成单位的daniel毒株，10μl脑室内)。在随机化用于治疗前，让小鼠恢复6个月的时间。然后检查小鼠的皮毛情况、步态和翻正反射，随机分配给治疗组(如治疗表中所示)。小鼠然后用单次静脉内注射媒介物(正常盐水)或重组人igm抗体(0.025-2.5mg/kg)治疗。治疗后2周、1个月和2个月，监测神经系统功能。功能终点包括根据皮毛情况、步态和转棒表现(rotarodperformance)评分。对于皮毛外观，评分如下：无疾病(0)；最少皮毛改变(1)；皮毛不整洁(2)；失禁和沾染皮毛(3)。在自动活动箱中定量测定活动改变。此外，采用数字步态采集(digigait)，使用步行速度＞90cm/s，对步态进行了分析。定量步态分析终点包括站立宽度和持续时间、步长和频率、爪角度(pawangle)以及摆动、制动和前冲步态持续时间。对自基线的步态改变进行了定量测定。在一系列试验中，对转棒表现(一种感觉和平衡协调的量度，通过动物在测量运动的转轴上步行的能力，根据在转轴上的速度和持续时间进行评价)进行了定量测定作为动物保留在旋转仪上的时间量。在完成实验后，通过过量暴露于co2使动物安乐死。取出脑和脊髓用于以下评估：1)髓鞘形成的程度(塑料包埋的低聚甲醛/戊二醛固定的锇酸化组织的电子显微镜分析)和2)神经突生长(通过体视学评价，评价神经突的密度)。在第一个实施方案中，按表3a和表3b中标明的3个剂量水平仅施用重组人抗体。表3a.治疗组和终点总结-各个重组igm抗体表3b.治疗组结果总结(*)x表明改善，x+表明更多的改善，x++表明甚至更多的改善。改善评分值相对于所施用抗体的剂量。因此对于相同的ab，x+的改善大于x的改善。一种ab的改善x不一定与另一种ab的x值相同；一种ab的x+值不一定与另一种ab的x+值相同，一种ab的x+++值不一定与另一种ab的x+++值相同。在该实施例中，发现重组抗体igm12、igm42、igm22和igm46各在不同的感觉运动终点产生统计上显著的剂量依赖性改善，包括皮毛情况、步态参数和转棒评分(与媒介物治疗相比各个终点p＜0.05)。在tmev损伤的6个月内，用媒介物治疗的动物在不同的感觉运动终点出现稳定的缺陷，包括皮毛情况、步态参数和转棒评分。发现各个ab在0.025-2.5mg/kg的剂量范围内，在感觉运动终点有显著的剂量依赖性改变，其中x为改善，且在低剂量下在感觉运动终点的改善x提高，用0.25mg/kg在感觉运动终点有较大改善x+提高，在2.5mg/kg剂量下在感觉运动终点有甚至较大改善x+++。对于以0.8的水平和0.05的α水平驱动的12只动物的组大小，观察到这种趋势。因此，与媒介物治疗相比，抗体igm12、igm42、igm22和igm46的每一种在不同的感觉运动终点产生统计上显著的剂量依赖性改善，包括皮毛情况、步态参数和转棒评分(各个终点的p＜0.05)。未发现基于性别的改善有区别。在该实施例中，发现与媒介物治疗的对照相比，igm12和igm42在来自tmev感染小鼠的脑和脊髓切片中，在神经突增生方面产生统计上显著的剂量依赖性增加，这通过体视学来评价。对于各ab，发现在0.025-2.5mg/kg的剂量范围内，在神经突增生方面有显著剂量依赖性改变，其中x为改善，且在低剂量下在神经突增生方面的改善x提高，用0.25mg/kg在神经突增生方面的较大改善x+提高，在2.5mg/kg剂量下在神经突增生x+++方面有甚至更大提高。对于以0.8的水平和0.05的α水平驱动的12只动物的组大小，观察到这种趋势。发现与媒介物治疗的对照相比，igm22和igm46在来自tmev感染小鼠的脑和脊髓切片中，在髓鞘再生方面产生统计上显著的剂量依赖性增加，这通过体视学来评价。对于各ab，发现在0.025-2.5mg/kg的剂量范围内髓鞘再生的显著剂量依赖性改变，其中x为改善，且在低剂量下在髓鞘再生方面的改善x提高，用0.25mg/kg在髓鞘再生方面的较大改善x+提高，在2.5mg/kg剂量下在髓鞘再生x+++中有甚至更大的提高。对于以0.8的水平和0.05的α水平驱动的12只动物的组大小，观察到这种趋势。实施例14：多发性硬化模型-ab组合在该实验中，按之前实施例中所述，在ms的tmev模型中，针对神经学结果的改善检查了重组igm抗体的固定剂量比的各种组合。暴露于tmev后6个月，在小鼠中开始用重组igm组合进行治疗。在这个系列的研究中，以单次静脉内施用(加药配液)，向小鼠施用仅媒介物，或igm的各种组合。如上监测感觉运动终点。对髓鞘形成和神经突生长进行了评价以检查由抗体组合产生的改变。评价中的组合见表4a和表4b。表4a.治疗组总结-重组igm抗体组合表4b.结果总结-重组igm抗体组合(*)x表明改善，x+表明更多的改善，x++表明甚至更多的改善。改善评分值相对于所施用抗体的剂量。因此对于相同的ab，x+是大于x的改善。一种ab的改善x不一定与另一种ab的x值相同；一种ab的x+值不一定与另一种ab的x+值相同，一种ab的x+++值不一定与另一种ab的x+++值相同。在该实施例中，与媒介物治疗相比，igm12+igm42、igm22+igm46、igm12+igm22、igm12+igm46、igm42+igm22和igm42+igm46的重组抗体组合在不同的感觉运动终点产生统计上显著的剂量依赖性改善，包括皮毛情况、步态参数和转棒评分(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)。未发现基于性别的改善有区别。此外，与预计的仅抗体的每一种的累加改善相比，用这些组合每一种的感觉运动终点改善的程度是以统计显著性剂量依赖性方式的超累加的(supra-additive)(显示协同作用)。此外，未发现基于性别的改善有区别。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，与媒介物对照相比，igm12+igm42的组合显著提高神经突增生(p＜0.05)。与单独施用每种抗体的累加效应相比，神经突增生的程度是超累加的。因此，要了解这些抗体通过截然不同的作用机制引导增生；这与这些抗体与神经组织的各自截然不同的结合模式一致。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，与媒介物治疗的对照相比，igm22+igm46的组合引起髓鞘形成的显著增加(p＜0.05)。此外，与预计的单独施用igm22或igm46的累加效应相比，髓鞘再生的程度是超累加的。虽不受理论束缚，但是这要理解为是旁分泌活性的结果。因此，当生长中的神经元和生长中的少突胶质细胞各自存在时，所述细胞分别引发正面影响评价中的其他细胞类型的旁分泌产生。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，在受损脊髓中与媒介物治疗的对照相比，igm12+igm22的组合引起髓鞘形成以及神经元生长的显著增加(p＜0.05)。此外，与分别以本文所用剂量单独施用的igm12或igm22的作用相比，神经元生长和髓鞘再生的程度是超累加的。虽不受理论束缚，但是这要理解为是旁分泌活性的结果。因此，当生长中的神经元和生长中的少突胶质细胞各自存在时，这些细胞分别引发正面影响评价中的其他细胞类型的旁分泌产生。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，与媒介物治疗的对照相比，igm12+igm46的组合引起髓鞘形成以及神经元生长的显著增加(p＜0.05)。此外，与分别以本文所用剂量单独施用的igm12或igm46的作用相比，神经元生长和髓鞘再生的程度是超累加的。虽不受理论束缚，但是这要理解为是旁分泌活性的结果。因此，当生长中的神经元和生长中的少突胶质细胞各自存在时，所述细胞分别引发正面影响评价中的其他细胞类型的旁分泌产生。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，与媒介物治疗的对照相比，igm22+igm42的组合引起髓鞘形成以及神经元生长的显著增加(p＜0.05)。此外，与分别以本文所用剂量单独施用的igm22或igm42的作用相比，神经元生长和髓鞘再生的程度是超累加的。虽不受理论束缚，但是这要理解为是旁分泌活性的结果。因此，当生长中的神经元和生长中的少突胶质细胞各自存在时，所述细胞分别引发正面影响评价中的其他细胞类型的旁分泌产生。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，与媒介物治疗的对照相比，igm46+igm42的组合引起髓鞘形成以及神经元生长的显著增加(p＜0.05)。此外，与分别以本文所用剂量单独施用的igm46或igm42的作用相比，神经元生长和髓鞘再生的程度是超累加的。虽不受理论束缚，但是这要理解为是旁分泌活性的结果。因此，当生长中的神经元和生长中的少突胶质细胞各自存在时，所述细胞分别引发正面影响评价中的其他细胞类型的旁分泌产生。实施例15：脊髓损伤模型在大鼠脊髓损伤模型中针对igm抗体促进功能改善和加强髓鞘再生、神经突增生的过程或两者的能力进行了评价。该模型包括侧面挤压改良的盖玻片(coverslip)钳刀片之间的脊髓，其中在15秒钟时间内钳的刀片宽度为2.5mm至0.9mm的预设置的刀片分隔。所致病变具有与人sci中发现的病变特性类似(gruner等人.，1995)。如上所述给雄性和雌性大鼠(约200-225g，longevans)进行手术以产生脊髓损伤。手术后10分钟，静脉内施用重组igm抗体或媒介物治疗。使用bbb运动评定量表，对后肢运动功能和步态进行评价达12周的时间(参见例如bassodm，beattiems，bresnahanjc，andersondk，fadenal，grunerjaholfordtr，hsucy，noblelj，nockelsr，perotpl，salzmanskyoungw(1996)mascisevaluationofopenfieldlocomotorscores：effectsofexperienceandteamworkonreliabilityjournalofneurotrauma，13：343-359；bassodm，beattiems，bresnahanjc.(1995)asensitiveandreliablelocomotorratingscaleforopenfieldtestinginrats.journalofneurotrauma，12：1-21)。在sci后1、3、5、7和10天、然后每周测试大鼠达9-12周，定量测定自基线的bbb改变。在完成实验后，通过过量暴露于co2使动物安乐死。取出脑和脊髓用于以下评估：1)髓鞘形成的程度(塑料包埋的低聚甲醛/戊二醛固定的锇酸化组织的电子显微镜分析)和2)神经突生长(通过体视学评价来评价神经突的密度)。实施例16：脊髓损伤模型中使用单个抗体在该实验中，按表5a和表5b标示的3个剂量水平单独施用重组人抗体。表5a.治疗组总结和终点-单个重组igm抗体表5b.治疗组结果总结(*)x表明改善，x+表明更多的改善，x++表明甚至更多的改善。改善评分值相对于所施用抗体的剂量。因此对于相同的ab，x+为大于x的改善。一种ab的改善x不一定与另一种ab的x值相同；一种ab的x+值不一定与另一种ab的x+值相同，一种ab的x+++值不一定与另一种ab的x+++值相同。在该实施例中，发现重组抗体igm12、igm42、igm22和igm46各自在具有改进的bbb参数的后肢运动功能方面产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)。在中度水平的脊髓损伤6周内，用媒介物治疗的动物出现稳定的bbb评分。对于各ab，发现在0.025-2.5mg/kg的剂量范围内bbb评分的显著剂量依赖性改变，其中x为改善，且在低剂量下bbb水平的改善x提高，用0.25mg/kg的bbb的较大改善x+提高，在2.5mg/kg剂量下有甚至更大的bbb改善x+++。对于以0.8的水平和0.05的α水平驱动的12只动物的组大小，观察到这种趋势。因此与媒介物治疗相比，抗体igm12、igm42、igm22和igm46的每一种在具有改善的bbb的后肢运动功能中产生统计上显著的剂量依赖性改善(各个终点的p＜0.05)，未发现基于性别的改善有区别。发现与媒介物治疗的对照相比，igm12和igm42在来自tmev感染小鼠的脑和脊髓切片中，在神经突增生方面产生统计上显著的剂量依赖性增加，这通过体视学来评价。对于各ab，发现在0.025-2.5mg/kg的剂量范围内在神经突增生方面有显著剂量依赖性改变，其中x为改善，且在低剂量下在神经突增生方面改善x提高，用0.25mg/kg在神经突增生方面较大改善x+提高，在2.5mg/kg剂量下在神经突增生x+++方面有甚至更大提高。对于以0.8的水平和0.05的α水平驱动的12只动物的组大小，观察到这种趋势。发现与媒介物治疗的对照相比，igm22和igm46在来自tmev感染小鼠的脑和脊髓切片中，在髓鞘再生方面产生统计上显著的剂量依赖性增加，这通过体视学来评价。对于各ab，发现在0.025-2.5mg/kg的剂量范围内髓鞘再生方面有显著剂量依赖性改变，其中x为改善，且在低剂量下在髓鞘再生方面改善x提高，用0.25mg/kg在髓鞘再生方面较大改善x+提高，在2.5mg/kg剂量下在髓鞘再生x+++中有甚至更大的提高。对于以0.8的水平和0.05的α水平驱动的12只动物的组大小，观察到这种趋势。实施例17：脊髓损伤-抗体组合在该实施例中，如本文实施例14中所述，在脊髓损伤模型中，针对神经学结果的改善检查了重组igm抗体的固定剂量比的不同组合。因此，损伤后10分钟，施用用igm抗体组合(作为加药配液)或媒介物对照的静脉内治疗。如上所述监测运动终点。此外，对髓鞘形成和神经突生长进行了评价以检查由抗体组合产生的改变。所评价的组合见表6a和表6b。表6a.治疗组总结-重组igm抗体组合表6b.治疗组总结-结果(*)x表明改善，x+表明更多的改善，x++表明甚至更多的改善。改善评分值相对于所施用抗体的剂量。因此对于相同的ab，x+为大于x的改善。一种ab的改善x不一定与另一种ab的x值相同；一种ab的x+值不一定与另一种ab的x+值相同，一种ab的x+++值不一定与另一种ab的x+++值相同。在该实验中，发现重组抗体组合igm12+igm42、igm22+igm46、igm12+igm22、igm12+igm46、igm42+igm22和igm42+igm46的每一种在后肢功能(运动终点)方面产生统计上显著的剂量依赖性改善，如bbb参数所见。未发现基于性别的改善有区别。此外，发现与相同剂量的单独的各抗体的改善相比，每种组合都以超累加的(即协同)方式改善运动功能。此外，未发现基于性别的改善有区别。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，与媒介物对照相比，igm12+igm42的组合显著提高神经突增生(p＜0.05)。与单独施用各抗体的累加效应相比，神经突增生的程度是超累加的。因此，要了解这些抗体通过截然不同的作用机制引发增生；这与这些抗体与神经组织的各自截然不同的结合模式一致。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，与媒介物治疗的对照相比，igm22+igm46的组合引起髓鞘形成的显著增加(p＜0.05)。此外，与预计的单独施用igm22或igm46的累加效应相比，髓鞘再生的程度是超累加的。虽不受理论束缚，但是这要理解为是旁分泌活性的结果。因此，当生长中的神经元和生长中的少突胶质细胞各自存在时，所述细胞分别引发正面影响评价中的其他细胞类型的旁分泌产生。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，与媒介物治疗的对照相比，igm12+igm22的组合在受损脊髓中引起髓鞘形成以及神经元生长的显著增加(p＜0.05)。此外，与分别以本文所用剂量单独施用的igm12或igm22的作用相比，神经元生长和髓鞘再生的程度是超累加的。虽不受理论束缚，但是这要理解为是旁分泌活性的结果。因此，当生长中的神经元和生长中的少突胶质细胞各自存在时，这些细胞分别引发正面影响评价中的其他细胞类型的旁分泌产生。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，与媒介物治疗的对照相比，igm12+igm46的组合引起髓鞘形成以及神经元生长的显著增加(p＜0.05)。此外，与分别以本文所用剂量单独施用的igm12或igm46的作用相比，神经元生长和髓鞘再生的程度是超累加的。虽不受理论束缚，但是这要理解为是旁分泌活性的结果。因此，当生长中的神经元和生长中的少突胶质细胞各自存在时，所述细胞分别引发正面影响评价中的其他细胞类型的旁分泌产生。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，与媒介物治疗的对照相比，igm22+igm42的组合引起髓鞘形成以及神经元生长的显著增加(p＜0.05)。此外，与分别以本文所用剂量单独施用的igm22或igm42的作用相比，神经元生长和髓鞘再生的程度是超累加的。虽不受理论束缚，但是这要理解为是旁分泌活性的结果。因此，当生长中的神经元和生长中的少突胶质细胞各自存在时，所述细胞分别引发正面影响评价中的其他细胞类型的旁分泌产生。除了与媒介物治疗相比，在不同的感觉运动终点(包括皮毛情况、步态参数和转棒评分)产生统计上显著的剂量依赖性改善(对于与媒介物治疗相比的各个终点p＜0.05)以外，与媒介物治疗的对照相比，igm46+igm42的组合引起髓鞘形成以及神经元生长的显著增加(p＜0.05)。此外，与分别以本文所用剂量单独施用的igm46或igm42的作用相比，神经元生长和髓鞘再生的程度是超累加的。虽不受理论束缚，但是这要理解为是旁分泌活性的结果。因此，当生长中的神经元和生长中的少突胶质细胞各自存在时，所述细胞分别引发正面影响评价中的其他细胞类型的旁分泌产生。实施例18：重组rhigm12抗体(一种人神经元结合性igm)保护脊髓轴突我们已证实，天然人血清抗体shigm12体外与神经元结合并促进神经突增生。我们生成了具有相同性质的重组形式rhigm12。易感小鼠品系的泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒(tmev)大脑内感染引起慢性脱髓鞘疾病，该病具有类似于多发性硬化进行性形式的进行性轴突丧失和神经系统功能障碍。用与少突胶质细胞结合的igm类抗体治疗该模型改善cns髓鞘再生(warrington等人(2007)jneuroscires85:967-976)。相比之下，与神经元结合的血清来源的人单克隆抗体(shigm12)，促进稳固的神经突增生到与层粘连蛋白相同的程度，并降低cns髓磷脂对神经突增生的抑制作用(warrington等人(2004)jneuropatholexpneurol63(5):461-473)。最近，生成了具有如上所述的相同生物学性质的人shigm12的重组形式(rhigm12)。为了研究rhigm12对脊髓轴突完整性的作用，我们进行了逆行标记，其是一种依赖于解剖学上连续的和功能上受保护的轴突的技术。方法逆行标记：使小鼠麻醉后，在较低胸椎(t10-11)处进行了背侧椎板切除术。将右侧的脊髓切下一半，对切部位用4％fluorogold的无菌溶液包裹。手术后一周，处死小鼠，取出脑。制备脑干的连续切片(40mm厚)，分析每隔三片的切片。用200x放大倍数，统计16个脑干切片的大的明亮荧光神经元。结果tmev模型为开发促进神经保护和防止轴突丧失的策略提供了平台。疾病早期包括炎症和脱髓鞘；晚期存在轴突丧失和功能缺陷。如之前实施例中的详述，在单次1mgi.p.注射后，rhigm12进入脊髓，定位于神经丝+(nf)轴突，这通过共聚焦图像证实(图15)。rhigm12还作为横切nf+纤维束共定位(图15d)。在动物研究中，rhigm12提高逆行标记的脑干神经元的数目。在感染后90天(dpi)将rhigm12或盐水施用于sjl小鼠。在治疗后9周进行脊髓手术用于逆行标记。手术后一周，处死小鼠，在连续脑干切片中定量测定荧光标记的神经元。与盐水对照相比，rhigm12提高逆行标记的脑干神经元的数目(数据未显示)。因此，与盐水治疗的对照相比，rhigm12治疗的小鼠具有更多的逆行标记的脑干神经元。实施例19：单剂量的神经元结合性人单克隆抗体改善脱髓鞘鼠模型的自发活动我们的实验室证实，天然人血清抗体shigm12体外与神经元结合并促进神经突增生。我们生成了具有相同性质的重组形式rhigm12。易感小鼠品系的泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒(tmev)大脑内感染导致慢性脱髓鞘疾病，其具有类似于多发性硬化进行性形式的进行性轴突丧失和神经系统功能障碍。为了研究rhigm12对tmev感染小鼠的运动功能的作用，我们在多周内监测了自发性夜间活动。夜间行为是啮齿动物神经系统功能的灵敏量度，因为预期最大活动改变发生在正常活动夜间监测期。治疗前8天将小鼠放入活动箱中以收集基线自发活动。治疗后，在8周内连续记录各组的活动。出于以下两个原因我们选择长的8周监测期：(1)我们之前证实，治疗后5周时存在igm诱导的髓鞘再生，和(2)tmev诱导的脱髓鞘疾病在该品系中进展得非常缓慢。由于长的观察期和大的数据集所致，研究原始未滤过记录可能难以评价治疗组间的差异。为了清楚描述高度波动的原始数据的变化，我们应用了3种不同的方法：(1)分箱(binning)，(2)应用高斯低通滤波器(gf)，和(3)多项式拟合。我们使用3种方法的每一种表明，与对照igm和盐水相比，用rhigm12的早期治疗诱导水平和垂直运动功能两者的改善，而后期治疗只改善水平活动。rhigm12不改变正常未感染小鼠的活动。这项研究支持以下假设：用神经元结合性igm治疗不仅体外保护神经元，而且还影响功能性运动改善。引言啮齿动物疾病模型中神经系统功能的长期监测和分析依然是一个挑战。夜间行为是啮齿动物神经系统功能的灵敏量度，因为预期最大活动改变发生在正常活动夜间监测期[1]。然而，在缓慢进行性疾病表现的动物模型中，监测常常延续超过数周。我们之前报导了少突胶质细胞结合性抗体(rhigm22)在治疗后5周提高髓鞘再生[2]。总之疾病的演变和修复两者是一个缓慢的过程，为了确保对活动的任何波动都加以考虑，我们用短期监测所使用的相同取样密度，对长期运动进行监测。这产生大且高度波动的数据集(图32a、c)。为了清楚描述治疗后改变并恢复长期活动的总体趋势，我们比较了数据分箱、高斯过滤和使用mathematica(wolframresearch，inc.)的多项式拟合的应用。易感小鼠品系的泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒(tmev)大脑内感染导致慢性脱髓鞘疾病，其具有类似于多发性硬化进行性形式的进行性神经功能障碍[3]。用与少突胶质细胞结合的igm类抗体治疗该模型改善cns髓鞘再生[4]。相比之下，血清来源的与神经元结合的人单克隆抗体(shigm12)促进稳固的神经突增生到与层粘连蛋白相同的程度，并降低cns髓磷脂对神经突增生的抑制作用[5]。最近，生成了具有相同生物学性质的人shigm12的重组形式(rhigm12)。我们之前表明，rhigm12具有3.6小时的半衰期，但仍能穿过血脑屏障，且与神经组织结合(观察结果未发表)。为了研究rhigm12对tmev感染小鼠的活动的作用，我们使用accuscan活动箱(accuscaninstruments，inc.，columbus，oh)，在几周内监测了自发活动。出于以下两个原因，我们选择相对长的8-周监测期：(1)治疗后5周时，存在igm诱导的髓鞘再生，和(2)与ms的纯粹的自身免疫eae模型相比，tmev诱导的脱髓鞘疾病在该品系中进展得非常缓慢[6]。由于与之前发表的研究(表7)相比的长观察期所致，通过目视检查原始数据来鉴定改变证实是困难的。表7-与本研究相比已发表研究中自发活动监测的长度材料与方法:小鼠：将sjl/j小鼠(jacksonlaboratories，barharbor，me)在mayoclinic动物护理设施中关养和培育。动物方案经mayo临床公共机构动物护理与使用委员会(mayoclinicinstitutionalanimalcareandusecommittee)批准。脱髓鞘泰勒氏病毒模型：在6-8周龄雌性小鼠中通过大脑内注射tmev诱发脱髓鞘疾病。27号针递送含有2.0x105噬斑形成单位的daniel毒株tmev。这导致＞98％极少致命性的感染发生率。全部动物均发生轻微脑炎，这在2周内能确定。动物在接下来的6-8个月，伴随慢性脊髓脱髓鞘疾病而恶化。轴突损伤和丧失在与神经功能障碍有关的感染后3个月开始[3]。抗体治疗：sjl小鼠(未感染、感染后45和90天)用单次200μg腹膜内剂量的溶于0.5mlpbs的抗体(rhigm12或同种型igm对照)治疗。第3组仅用0.5mlpbs治疗。自发活动监测：自发性自主活动用digiscan旷场(of)仪器(omnitechelectronics；columbus，oh)和versamax软件v.4.12-1afe(accuscaninstruments，inc.，columbus，oh)记录。该仪器由通过装有两组光电池的金属框支承的6个丙烯酸塑料笼(40x40x30.5cm)组成。该装置通过将投射红外光束中断数列表，来测量非连续的水平和垂直运动的次数。在所有的笼中，将小鼠暴露于相同的环境条件：(a)可任意获取食物和水，(b)正常的12小时光/暗周期，(c)70°f环境温度。在每个实验中，排除运动过强和在极少情况下体重超重动物，随机分配其余小鼠。将几组5只sjl小鼠放在各笼中央，在连续8天的时间内收集基线自发活动。在此时间后，具有最相似基线活动的3组小鼠用rhigm12、对照igm抗体或盐水治疗，然后在8周时间内进行监测。按每1小时时段光束中断的次数收集数据。使用versadat程序v.3.02-1afe(accuscaninstruments)记录总体水平活动和垂直活动。我们不能在每个活动箱放入5只以上的动物，因为这是公共机构动物护理与使用委员会(iacuc)允许的最多动物数目。数据分析：研究原始未滤过记录可能难以了解治疗组间的差异(图32a-c)。为了再现极其波动的原始数据的缓慢趋势，我们应用了3种不同的方法：1)分箱，2)应用高斯低通滤波器(gf)，和3)多项式拟合。数据分箱是最简单的方法，预选箱体内的一组数据点用其平均值代替。在我们的情况下，考虑到鼠活动在夜间达到高峰，因此我们选择夜间箱。因此，我们将所有夜间读数(12小时/天)用其平均值替换，见图33a、33b、35c、35d、37c和37d。对于其有效样品大小为12小时/治疗的平均值的差异，可通过简单的t检验进行各组的比较。虽然这些比较是简单的，但各个时间点上小的样品大小导致大的标准误差，且统计比较的应用有限。总的来说，数据分箱是用于观察噪声数据的有效方法，但对于统计测试的应用有限。高斯过滤(gf)(也称为低通滤波、数据平滑或灵敏度提高)是常用于傅里叶变换光谱学和图像处理的降噪程序[7]。gf用适当选择的按所需水平滤出高频波动的高斯展宽(gb，单位天)进行。滤波选择是任意的，可通过预期活动改变的速率引导。gf是根据高斯函数使用取自某一值两侧各点的信息，并使这些点的影响加权使得影响减弱的平滑方法。从计算上来讲，gf可以两种等同方式执行：1)数据的傅里叶变换(ft)，接着乘以高斯函数与乘积的傅里叶逆变换；和2)具有高斯内核的数据的直接卷积。在高级软件包(matlab(mathworks)或mathematica(wolfram))中，用最少的编程或无编程，用户便可获得高斯滤波器函数。伴随适当选择的gb，上文详述的gf方法使十分复杂的杂散数据能够被简化地显现。gf的一个限制是尽管它允许趋势容易显现，但统计比较因gb的选择而复杂化。出于比较并为了证实允许简化统计比较的方法，我们将多项式拟合至所述数据。这些模型允许多项式各项高达遍及任何级次(xn)，并分别估算对于每个治疗组的形状参数(交互项)。在探究几个选项后，我们对6次多项式的选择是任意的，但允许足够的灵活性以模仿随时间变化的非线性效应。因为使用不同次多项式对不同的治疗组进行最佳拟合，所以我们选择以允许高次灵活性(higherorderflexibility)。利用赤池信息量准则(akaikeinformationcriteria，aic)确定跨几个治疗组间的多项式曲线的“最佳拟合”[8]。aic是一种模型比较的方法，它通过增加额外项来平衡r2的增益，但处罚超集成度(即自由度的使用)。总体而言，三阶拟合足以俘获数据的趋向，对于某些情况，根据aic，二阶拟合或者甚至线性拟合是“最好的”。然而，我们主要的目标是比较所观察时间点的治疗组。因为大量的数据点，并且因为我们不使用多项式拟合预测(或推测)我们的观察数据以外的治疗值，因此“过度拟合”对结果的影响最小。多项式拟合的一个优点是治疗组的统计比较直截了当：可使用预测模型值和相应的标准误差，比较规定时间点的治疗。可在整个时间范围内以有规律的时间间隔进行治疗的直接成对比较，以确定治疗组何时显著偏离。最后，多项式拟合消除额外的中频和低频噪声，这在整个时间范围内使视觉注意力集中在总体趋势上。然而，在各个实验内，一些小鼠组具有略微不同的基线水平和垂直活动(8天)。因此，我们首先使用z-值以独立地使各组的基线活动标准化，然后进行高斯滤波或使多项式拟合至这些值。统计分析：通过利用编写于mathematica的宏(wolfram)，进行分箱数据和数据的高斯低通滤波器平滑。宏和指令可获自mayoresearch.mayo.edu/mayo/research/rodriguez_lab/software.cfm。利用基于z-统计值的预测模型值和相应的标准误差(sasinstitute，inc.)，进行了治疗组的多项式回归模型和统计比较。在整个时间范围内每天进行治疗的直接成对比较，并以典型的α＝0.05阈值确定统计显著性。未对多重比较做调整。结果当在90dpi施用时rhigm12改善sjl小鼠的水平活动在感染后90天(dpi)，将3组5只sjl小鼠放入活动箱，连续8天测量基线活动。2组小鼠用单次200μg剂量的rhigm12或同种型对照igm治疗。第3组用盐水治疗。在治疗后，在8周内连续记录自发活动。因为数据按1小时段收集，因此我们获得每个组约900个数据点。这种最初的原始数据(图32a-c)是十分波动的，所以可能难以评价治疗组间的差异。所有3种方法(分箱、高斯过滤和多项式拟合)显示，用rhigm12治疗的小鼠显示水平活动改善，而对照igm治疗和盐水治疗小鼠在8周时间内活动无改变(图33a、c和e)。多项式拟合后使用3种治疗的直接成对比较，我们确定rhigm12治疗小鼠中水平运动功能的改善在治疗后第7天(与对照igm相比)和第11天(与盐水相比)有统计学显著性(图34)。在rhigm12治疗动物的水平夜间活动中所观察的改善持续约30天，然后返回基线水平。盐水治疗组与对照igm治疗组的成对比较表明第38-52天有统计显著性。然而，当与在rhigm12治疗组和对照间观察到的主要差异相比，我们认为对照组间的这些差异在生物学上不显著。另一个方面，垂直活动不显示重大差异，在所有3个组中类似(图33b、d和f)。当在45dpi施用时rhigm12改善sjl小鼠的水平和垂直活动之前研究使用垂直活动(直立行为)作为主要读数[1]。由于慢性tmev感染小鼠中轴突丢失，后肢逐步变虚弱和僵硬，因此直立减少。在本研究的第一项实验中，当在最多脱髓鞘(90dpi)和进行性轴突丧失开始时施用rhigm12，只改善水平活动。直立行为不受影响，并且在所有3个治疗组中相当。因此我们提出在较早时间点的治疗是否可更有益。在第二项实验中，各组5只小鼠在45dpi时用单次200μg剂量的rhigm12、同种型对照igm或盐水治疗。采用相同的实验设计；收集基线活动达8天，收集治疗后活动达8周。在该实验中，在治疗后2周左右开始，rhigm12治疗小鼠显示在水平和垂直活动两者中有明显改善。这在使用以下所有3种方法后显而易见：求数据平均值，应用高斯滤波器或多项式拟合(图35c-h)。对照igm治疗和盐水治疗小鼠显示在整个研究结束时有相似的活动水平。在rhigm12治疗小鼠中，水平活动的改善直到实验结束是明显的。另一个方面，垂直活动的改善持续4周左右，然后下降到基线值。3种治疗的直接成对比较表明，rhigm12治疗小鼠中水平运动功能的改善在治疗后第13天(与对照igm相比)和第9天(与盐水相比)显著偏离(图36a和c)。同样地，rhigm12治疗小鼠中的垂直运动功能在治疗后第14天(与对照igm相比)和第6天(与盐水相比)显著偏离(图36b和d)。对于水平或垂直活动，对照igm与盐水治疗组的比较不显示重大的生物学差异(图36e和f)。正常未感染小鼠中rhigm12不改变自发活动在前两项实验中，用rhigm12的治疗显示在有神经缺陷的感染小鼠中有明显的有益作用。为了排除这种抗体可能具有应激性性质并因此引起运动功能提高的可能性，我们用未感染小鼠进行了类似实验。3组年龄匹配的未感染小鼠用rhigm12、对照igm或盐水治疗。与感染小鼠的活动提高相比，rhigm12以及其他两种治疗不会引起正常小鼠运动功能的任何提高(图37)。所有3个组显示自发活动降低的趋势。该结果表明无一抗体对正常小鼠活动的提高有影响。论述对用于多发性硬化以及用于其他脱髓鞘和神经变性疾病的神经保护疗法的研发有极大的需求。尽管有一些可在炎性cns疾病期间直接导致轴突损害降低的抗炎药物，但是没有直接作用于神经元/轴突水平的药物。神经保护的主要目标是限制神经元功能障碍，并试图保持神经元和轴突的功能完整性。多年来，脱髓鞘(ms的病理标志)被视为永久性神经缺陷的原因。目前已清楚脱髓鞘是必需的，但不足以造成永久轴突丧失[9]。脱髓鞘仅使裸露轴突易遭受继发性损伤，所述继发性损伤由t细胞细胞毒性引起或由死亡少突胶质细胞所致丧失局部神经营养支持引起[10]。之前的神经元结合性抗体shigm12促进稳固神经突延伸的观察结果[5]代表清楚有益的体外反应。因为这种抗体的重组形式显示类似的体外性质，所以我们提出它是否影响患tmev诱导的脱髓鞘疾病的小鼠的运动活动。通过监测自发性夜间活动，进行了运动功能的分析。首先，我们在最多脱髓鞘和轴突丧失开始(90dpi)时治疗小鼠。在治疗后8周，rhigm12只改善水平运动活动，而垂直活动不受影响。然而，当在疾病早期(在45dpi)治疗小鼠时，rhigm12改善水平和垂直活动两者。在慢性tmev诱发性疾病中，直立行为(垂直活动)受到最严重的影响，似乎导致该活动的轴突的变性和丧失是不可逆的。相反地，当这些轴突并非不可逆受损时，疾病早期似乎是治疗的理想时间。jones等人利用eae模型，通过研究轴突丧失和运动功能，他们给出相同的范例；用神经保护药物治疗应开始于疾病早期，甚至在运动缺陷出现之前[11]。第二，因为功能改善发生在治疗后2周左右，在约25-30天后开始减弱，有可能重复治疗将是维持运动功能所必需的。遗憾的是，在我们的研究中，不可能试验多次剂量的人igm，因为小鼠中的抗人抗体免疫应答导致过敏反应。a2b5是一种同样促进神经突增生的小鼠单克隆抗体[5]，代表了测试单次施用与多次施用对功能结果及其作用持续时间的影响的有希望的候选物。最后，无一治疗对未感染正常动物的运动功能有影响。不考虑治疗，所有正常小鼠组显示自发活动逐渐下降，这可通过对环境的习惯来解释。正常动物中这种活动下降使得rhigm12诱导的患病小鼠活动的增加甚至更令人印象深刻。我们已证实炎性脱髓鞘疾病慢性进行性模型(其中一般非常难以防止神经缺陷发展)中运动功能的改善。因此，神经元结合性单克隆抗体rhigm12代表了不仅是治疗人ms，而且还是治疗其他脱髓鞘或神经变性病症的非常有前景的治疗剂。另外，因为有临床无症状的ms发作的实例[12，13]，我们和其他人提出，神经保护化合物应补充免疫调节剂[11]。我们提出免疫调节药物和rhigm12的联合治疗可导致轴突损伤后cns保持和修复的显著提高。总之，该研究的结果提供3个重要结论：1)施用治疗时疾病的病期是决定性的(早期治疗更有益)；2)为了进一步保持运动功能的改善，可能需要重复治疗，和3)rhigm12是无毒的，不影响正常未感染动物的运动功能。研究结果与以下假设一致：靶向神经元的重组抗体改善脱髓鞘慢性轴突模型的神经系统功能。参考文献1.mogavern，d.b.，等人，quantitativeassessmentofneurologicdeficitsinachronicprogressivemurinemodelofcnsdemyelination.expneurol，1999.158(1)：p.171-81.2.warrington，a.e.，等人，humanmonoclonalantibodiesreactivetooligodendrocytespromoteremyelinationinamodelofmultiplesclerosis.procnatlacadsciusa，2000.97(12)：p，6820-5.3.mcgavern，d.b.，等人，axonallossresultsinspinalcordatrophy，electrophysiologicalabnormalitiesandneurologicaldeficitsfollowingdemyelinationinachronicinflammatorymodeldmuftiplesclerosis.brain，2000.123pt3：p.519-31.4.warrington，a.e.，等人，arecombinanthumanigmpromotesmyelinrepairafterasingle，verylowdose.jneuroscires，2007.85(5)：p.967-76.5.warrington，a.e.，等人，neuron-bindinghumanmonoclonalantibodiessupportcentralnervoussystemneuriteextension.jneuropatholexpneurol，2004.63(5)：p.461-73.6.denic，a.，等人，therelevanceofanimalmodelsinmultiplesclerosisresearch.pathophysiology，2010.18(1)：p.21-9.7.hoch，j.c.anda.s.stem，nmrdataprocessing.1ed1996，newyork：wiley-liss，230.8.akaike，h.，anewlookatthestatisticalmodelidentification.ieeetransactionsonautomaticcontrol，1974.19(6)：p.716-723.9.howe，c.l.，j.d.adelson，andm.rodriguez，absenceofperforinexpressionconfersaxonalprotectiondespitedemyelination.neurobioldis，2007.25(2)：p.354-9.10.rodriguez，m.，afunctionofmyelinistoprotectaxonsfromsubsequentinjury：implicationsfordeficitsinmultiplesclerosis.brain，2003.126(pt4)：p.751-2.11.jones，m.v.，等人，behavioralandpathologicaloutcomesinmog35-55experimentalautoimmuneencephalomyelitis.jneuroimmunol，2008.199(1-2)：p.83-93.12.jacobs，l.，p.r.kinkel，andw.r.kinkel，silentbrainlesionsinpatientswithisolatedidiopethicopticneuritis.aclinicalandnuclearmagneticresonanceimagingstudy.archneurol，1986.43(5)：p.452-5.13.pohl，d.，等人，pediatricmultiplesclerosis：detectionofclinicallysilentlesionsbymultimodalevokedpotentials.jpediatr，2006.149(1)：p.125-7.14.mikami，y.，等人，asimpleandreliablebehavioralanalysisoflocomotorfunctionafterspinalcordinjuryinmice.technicalnote.jneurosurg，2002.97(1suppl)：p.142-7.15.mikami，y.，等人，lmplantationofdendriticcellsininjuredadultspinalcordresultsinactivationofendogenousneuralstern/progenitorcellsleadingtodenovoneurogenesisandfunctionalrecovery.jneuroscires，2004.76(4)：p.453-65.16.melnick，s.m.andd.l.dow-edwards，differentialbehavioralresponsestochronicamphetamineinadultmaleandfemaleratsexposedtopostnatalcocainetreatment.pharmacolbiochembehav，2001.69(1-2)：p.219-24.17.shen，h.，等人，inosinereducesischemicbraininjuryinrats.stroke，2005.36(3)：p.654-9.18.torres-reveron，a.andd.l.dow-edwards，prenatalcocainedampenedbehavioralresponsestomethylphenidateinmaleandfemaleadolescentrats.neurotoxicolteratol，2006.28(2)：p，165-72.19.zhu，n.，j.weedon，andd.l.dow-edwards，oralmethylphenidateimprovesspatiallearningandmemoryinpre-andperiadolescentrats.behavneurosci，2007.121(6)：p.1272-9.20.li，x.，等人，attenuationofbasalandcocaine-enhancedlocomotionandnucleusaccurnbensdopamineincannabinoidcb1-receptor-knockoutmice.psychophannacology(berl)，2009.204(1)：p.1-11.21.pivera-quinones，c.，etal.，absenceofneurologicaldeficitsfollowingextensivedemyelinationinaclassl-deficientmurinemodelofmultiplesclerosis.natmed，1998.4(2)：p.187-93。实施例20：用于治疗运动神经元疾病als的神经元保护性人mab肌萎缩性侧索硬化(als)是主要影响前角细胞和皮质脊髓束神经元的毁灭性的神经疾病。als是一种以脑和脊髓运动细胞的进行性变性为特征的运动神经元疾病。运动细胞(神经元)控制肌肉，这能够使个体来回移动、讲话、呼吸和吞咽。在无神经激活它们时，肌肉渐渐虚弱和消耗。尽管进行了广泛的研究，但这种病症的病因在很大程度上仍未知，并且没有有效的治疗。患罕见als遗传形式的少部分患者所涉及的基因提供这种病症的可能线索。[1]一种经鉴定的基因突变是cu/znsod(铜/锌超氧化物歧化酶)突变，该突变存在于小比例的患als遗传形式的患者中。[2]显然，与没有相关基因突变而自发出现该疾病的患者相比，携带sod突变的患者具有非常相似的神经学结果。[3]这种酶催化超氧化物成为氧和过氧化氢。sod1是与als有关的酶形式。似乎存在sod1功能的一个益处，其影响快速轴突转运。[4]家族性als中sod突变的频率从12％到23％不等，该基因通常作为常染色体显性遗传。鉴定基因可供开发具有als疾病特征的动物模型用于设计和测试新的药物。由于als的遗传和非遗传形式是类似疾病，因此基本病因可能相关。因此，在遗传性als小鼠模型中有效的药物也可在患有als更普遍的随机形式的人中起作用。具有人sod1基因和als的病理特征的转基因小鼠模型的可得性促进了用于该疾病的药物的开发。[5]这些转基因小鼠出现进行性运动神经元损失和神经缺陷。因为als的遗传和非遗传形式在临床上相似，运动神经元功能的基础缺陷可能相关。在sod1关联的als中有效的试剂也可有助于als的更普遍的偶发形式。目前市场上只有一种用于als的药物，谷氨酸阻断药(利鲁唑片剂)。然而，研究表明，该药物不改善患者生活质量，且只可延长平均2个月的生命。显然急切需要更有效的药物。实验室已开发出用于治疗脱髓鞘和中枢神经系统(cns)变性病症的新疗法[6]，并已鉴定出一系列与少突胶质细胞[7]或神经元[8]结合的人单克隆抗体(mab)，所述人单克隆抗体显示诱导cns中的修复。这些抗体已被克隆、测序[9]，并在gmp设备中大量生产用于未来临床试验。[10]重组人抗体igm12(rhigm12)来源于自瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症患者分离的抗体。[11]该抗体特异性地标记cns的神经元和轴突。[8]如上述实施例所示，尽管是igm抗体，但是igm12穿过血脑屏障，并与cns内的轴突和神经元特异性结合。体外rhigm12与多种多样的神经元结合，包括小脑颗粒神经元、皮质神经元、海马神经元和视网膜神经节细胞神经元。[12]体外实验证实，rhigm12保护神经元免于细胞死亡。单克隆抗体rhigm12在als(疾病的遗传形式和自发形式两种)早期施用于患者时，可起保护前角细胞并防止轴突损伤的作用，从而延迟失能的出现，并提高存活。结果我们进行了用人抗体rhigm12治疗带有g86rhsod1突变的小鼠[13](fvbtgsod1g86rm1jwg，jacksonlabs)的实验。g86r小鼠出生时显得正常。然而，自大约90-100日龄开始，它们经历了明显的体重减轻，出现明显的肌肉萎缩，在急剧体重减轻的数周内死于呼吸衰竭。ludolph在随机“盲法”试验中，这些小鼠在55日龄接受单次腹膜内剂量(200μg)的gmp纯化的rhigm12。相比之下，安慰组接受磷酸缓冲盐水(pbs)。几只小鼠未接受治疗以确定在没有人为处理的情况下该疾病的自然进程。因为pbs治疗和未治疗小鼠的数据类似，合并这些组用于统计分析。由我们的实验室的一名研究人员随机选择小鼠进行治疗，并由另一名“不知情”研究人员观察神经缺陷直到小鼠濒死。治疗研究人员和进行病理分析的另一名研究人员不了解随机选择方案，直到代码解开。每周给动物称重以确定用人mab治疗是否不仅可延长存活，而且还延迟体重减轻的发作。结果引人注目，表明与接受pbs的动物相比，接受rhigm12的动物存活有统计显著性延长。平均起来，研究人员记录到存活延长25-30天，通过kaplan-meier曲线(图38)，显示统计显著性(p＝0.008)。另外，用rhigm12治疗的小鼠具有较不明显的体重减轻(图39)，体重减轻是评价动物疾病进程中普遍评价的参数。[18]据我们所知，这是第一次证实针对神经元的完全重组人单克隆抗体在延长als表型动物的存活中是有效的。当动物达到濒死期，将其处死，用trump固定液灌注。取出脊髓，切成1mm小块，并包埋在环氧树脂塑料，得到1μm厚的切片。对这些切片进行组织学检查。因sod突变而出现als的动物在白质束中显示明显的轴突变性，使得在轴突破裂时，相对容易地鉴定出在脊髓白质出现的髓磷脂螺环。当在接受rhigm12与pbs的动物胸切片中定量测定脊髓螺环(变性轴突)的数目时，用单克隆抗体疗法治疗的动物中，髓磷脂螺环数在统计上显著性下降(图40)。另将脊髓切片用抗neun抗体染色，抗neun抗体是一种特异性标记cns的神经元并且极精确界定前角细胞以及后角中的神经元的标志物。定量测定接受rhigm12相对于pbs的动物中胸脊髓水平的前角细胞的数目(图41，左)。相对于pbs，在接受rhigm12的动物中，对于保持的前角细胞数增加，有极大的统计差异。对后角中神经元的类似分析同样显示用rhigm12治疗的小鼠的神经元显著增加(图41，右)。人抗体rhigm12与获自许多物种(包括小鼠、人(图42)、兔和灵长类动物)的许多类型的cns神经元表面结合。这就提供了rhigm12神经元信号传导在包括从小鼠到人的哺乳动物中受到保持的证据。我们在sod小鼠中的研究表明，保护前角和后角细胞免于死亡可导致较少的变性脊髓轴突和延长的动物存活。在之前用培养中的皮质神经元的实施例中，上述的实验证实，用rhigm12处理神经元防止其细胞死亡(参见图3)。将自新生期小鼠生长的皮质神经元暴露于极高浓度的过氧化氢以确定90％神经元死亡的浓度。将暴露于过氧化氢的神经元同时用rhigm12或另一种不与神经元结合的人igm处理。用rhigm12处理导致80％神经元的得到保持。相比之下，用对照igm处理导致在暴露于过氧化氢后90％神经元死亡。我们推测rhigm12通过保护神经元免于细胞死亡而延长患als的动物的寿命。还对人抗体作为基质在组织培养板上进行了测试，并对促进正常细胞突(cellprocess)自小脑或皮质神经元延伸的能力进行了比较。还对与神经元表面结合的抗体rhigm12和shigm42以及不与神经元结合的抗体rhigm22和shigm39支持胞外基质分子、层粘连蛋白的有效过程进行了比较。在人抗体rhigm12或shigm42基质上生长的神经元导致神经元增生显著延伸，与用层粘连蛋白所观察到的类似[8]。该研究还表明神经元在rhigm12存在下行为正常。一般公认的见解是分子量接近1百万的igm太大以致于不能从循环中穿过血脑屏障(bbb)而进入cns[15][16]。然而，有越来越多的证据表明某些抗体确实穿过bbb。我们在上文描述了在外周注射后在脊髓内检测到rhigm12。将1.0mgrhigm12或对照人igm腹膜内施用于患脱髓鞘脊髓病变的小鼠。4小时后，处死小鼠，针对人igmμ链和抗神经丝的存在情况对脊髓切片进行免疫染色。在接受rhigm12的小鼠中，共聚焦显微术显示脱髓鞘病变内在平行束中与抗神经丝(轴突的标志物)共定位的人μ链，并成束在末端切断(参见图15)。接受对照igm的小鼠的脊髓病变内未发现人igm。虽然所提供的研究是在动物模型中，但是在这些研究结果中有多个诱人的方面，其进一步表明这种新方法在人类患者中将是有效的。重要的是，本文所述和使用的igm12抗体是完全人单克隆抗体。因此，仅单剂量的该抗体可用于小鼠中。后续剂量引起动物对抗体产生免疫应答，导致rhigm12的中和或动物因过敏反应而死亡。然而，由于这些是“真实的”人抗体，因此人类患者用rhigm12治疗不可能对其产生免疫应答。此外，可能可以连续间歇性地将rhigm12施用于患者而无有害作用或发生抗体阻断反应。因为rhigm12是天然人自身抗体，所以不良副作用是不可能的，因此，我们预期这种药剂的毒性极小。有很多证据表明rhigm12在人中将是安全。在这些阳性结果前，如上文所述，在没有毒性的情况下，在几个神经疾病模型中测试了als模型中抗体shigm12的血清形式。在这些研究中，我们发现，1)在1mg剂量后在患病毒介导的脱髓鞘的小鼠中，cns病理无增加，2)在200μg剂量后，患活性eae的小鼠的临床评分严重性未提高，和3)300μg剂量后正常cd-1小鼠中清洁的血液化学和组织病理。虽然如此，值得注意的是，公认的als动物模型中小鼠的单次剂量得到引人注目的结果。根据fda准则，已将rhigm12在gmp设备中生长，而且依照fda准则，已产生稳定的转染细胞系，并在没有任何外膜感染(adventitialinfection)的情况下保存。针对＞50的一组感染性生物，对这些细胞系进行了测试，所有都为阴性结果。另外，细胞系在组织培养产生大量抗体(150μg/ml)。已确立了用于将rhigm12纯化至＞97％纯度而无外膜病毒、dna、rna或根据fda准则的其他外来材料的方法，为在未来初期临床试验在als早期患者中的rhigm12提供了强有力的临床前基础。进行中的研究上文已表明，重组人单克隆抗体(rhigm12)可通过防止前角细胞和轴突丧失而延长人als的转基因模型的存活，正在进行研究以通过药代动力学和毒理学产生临床前数据以进入als患者的i期临床试验。盲法研究与安慰剂ab：在具有als表型的两个sod小鼠品系(sod1g86r和g93a)中进行了最终的“盲法”安慰剂对照研究，测试了相对于同种型对照人抗体shigm39的重组人抗体rhigm12。测试了与200μg剂量的同种型对照人抗体shigm39相比，单次200μg剂量的重组人抗体rhigm12在g86r和g93asod1[14](b6cg-tgsod1g93a1gur，jacksonlabs)突变体转基因小鼠模型两者中减轻疾病的功效。根据发作前治疗的enmc建议，抗体治疗在55日龄时进行[18]，其结果反映出将rhigm12与pbs比较的试验性研究(图38-41)。主要终点是存活和防止体重减轻。各实验组由24只小鼠组成，根据上述数据，这足以检测出差异。另外，所有小鼠在处死后，使用neun的标记，检查了cns以测定胸正中脊髓中前角细胞的数目。统计由异常髓磷脂螺环所表明的变性轴突的数目。包括了g93asod1突变体模型(b6.cg-tg)sod1g93a)1gur/j#004435，jacksonlaboratory)，因为这是最早基于遗传的、最广泛使用和最佳表征的als模型，并且允许rhigm12的结果与治疗范例的大数据库相比较。g86r小鼠发病晚(7个月)，进展快；而g93a小鼠发病较快(3-4个月)，而进展较慢。该项研究控制外源蛋白质引入sod1小鼠，并且还涉及作用机制的概念。rhigm12的神经元结合特性是决定性的，不与神经元结合的igm将不会改善疾病。在该研究中，主要终点是存活延长(10％或更高，p＜0.05)和体重减轻降低(10％或更高，p＜0.05)。sod1小鼠的至少一个品系的改善被视为是成功。如果放倒在任一侧在15-30秒钟内它们自己不能翻正，则在此时处死所有小鼠。次要终点测量通过异常髓磷脂螺环所表明的变性轴突的数目和脊髓胸水平(t6)处neun阳性前角细胞的密度。如果用rhigm12治疗的小鼠出现以下情况，则被视为不良事件，1)与对照相比丧失20％以上体重，2)发生癫痫，3)具有大于对照20％的死亡率。剂量调整研究：根据上述研究的阳性结果，进行了剂量调整研究(在55日龄时施用每只小鼠0、5、50、100和250μg的单剂量)以确定保护sod1小鼠免于死亡所需要的最低剂量。利用小鼠脑干的mr光谱学来测量n-乙酰基天冬氨酸(naa)。我们表明，在其他神经疾病模型中，脑干中的naa是整个脊髓中轴突健康的优良的替代指示物。[17]mr光谱学数据有助于验证naa在使用rhigm12的潜在人体试验中作为抗体功效的替代标志物。在55日龄时，将单剂量的0、5、50、100和250μg腹膜内施用于各组20-24只sod1小鼠。主要终点和次要终点及不良事件与上文描述的相同，外加在脑干测量n乙酰基天冬氨酸(naa)的mr光谱学。在抗体治疗当天、100日龄和临处死前，收集每只小鼠的mr光谱学。100天或最终扫描时任何rhigm12治疗组的脑干naa浓度比盐水治疗小鼠提高10％(p＜0.05)被视为改善。药代动力学研究和bbb：采用已确立的在正常小鼠血液免疫球蛋白背景下特异性检测人igm的elisa检测系统，在单次200μg静脉内剂量之后，在50-70日龄的sod1g86r和g93a小鼠[18]中进行了研究。在施用后的不同时间点(0、15分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、5天和7天)，测量血液中的人igm。因为小鼠的血液体积小(总计＜1.5ml)，所以在每个采集点使用3只个别的小鼠。提出了rhigm12直接作用于神经系统，在外周注射后穿过血脑屏障与神经元相互作用以保护它们免于死亡。有可能但未必一定是，人抗体不穿过血脑屏障，但是刺激免疫应答的各方面，然后提供轴突保护。利用35s标记的rhigm12的体内跟踪以彻底解决这个问题。在50-70日龄的sod1小鼠，跟踪2个剂量水平的35s标记的rhigm12，250μg和上文已确立的最低有效剂量。在35s标记的rhigm12的静脉内剂量后，测定注射后4、8、24、48和72小时穿过血脑屏障和存在于脑/脊髓实质的35s的百分比。另外，使用已发表的放射自显影技术[19]，确定定位于脑/脊髓的35s部位。血清半衰期研究：在其中rhigm12显示有功效的sod1品系中使用200μg的剂量，进行了rhigm12的血液动力学研究。在每个时间点，对各组3只sod1小鼠进行了研究；在静脉内注射后7天内有13个采集点。在50-70日龄治疗sod1小鼠以了解在治疗时的抗体动力学。将测定rhigm12血清半衰期、暴露饱和度和中和性abigm的存在情况。跟踪同位素(35s)标记的rhigm12的研究需要确定上述最低有效剂量。施用50-70日龄的sod1小鼠250μg的单次静脉内剂量和rhigm12的最低有效剂量(含有至少1x107cpm)[19]以明确在治疗性治疗时rhigm12是否进入cns。在注射后4、8、24、48和72小时，迅速取出主要组织，包括脑、脊髓、肝、心脏、肺、胃、肠、肌肉、脾、肝、胰腺。取出150mg部分的组织，称重，溶于solvable(perkinelmer)，在闪烁液(ultimagold，perkinelmer)中测定cpm。使用放射自显影，同位素标记的rhigm12被定位于脊髓切片[19]。在该实验中，主要终点是在rhigm12注射后4、8、24、48和72小时与零时间点对照相比，35s同位素在小鼠脑或脊髓中的蓄积。在任何时间点上，全脑或脊髓的35s计数/mg增加50％(p＜0.05)均被视为显著和rhigm12可进入cns的证据。对于放射自显影研究，向小鼠施用标记的rhigm12，在其中rhigm12在cns中增加时取出脊髓。脊髓切片中在整个神经元中银粒/mm2增加50％被视为体内抗体靶向的有效证据。初期毒性研究：用rhigm12进行实验以确定抗体在正常cd-1小鼠和兔中是否有毒。向各组10只两种性别的正常cd-1小鼠施用上文确定的rhigm12的最低有效剂量1次(1x)、10次(10x)和20次(20x)或盐水静脉内一次或一日一次达7天。两周后，通过“整体”尸体剖检收集血液和组织，并进行分析。由具有毒理学评价专长的兽医病理学家“盲法”检查所有主要器官的组织切片。针对常用的一组毒理学筛选，包括肝酶、心脏酶、电解质和对血液学类型的作用的血液研究，在化学和血液学上对血液进行了表征。在非啮齿动物物种中进行了相同的暴露研究；在每个剂量下测试了每种性别的2只兔。另外，使用rhigm12的组织交叉反应性研究被用来确定抗体是否与任何其他组织或器官结合。一组来自小鼠、兔、灵长类动物和人(zymed)的石蜡包埋的组织切片用rhigm12或对照人igm进行免疫标记。使各组织内结合的强度和结构成像，与rhigm12和对照igm标记的用组织切片机切取的活组织切片进行比较[7]，因为这更接近地模拟体内情况。另外，根据fda的研究新药(investigationalnewdrug)申请的初步毒理学部分，在冷冻的人和灵长类动物组织中对rhigm12和对照抗体的结合进行了测试。组织交叉反应性研究提供有关在小鼠和兔暴露研究期间应特别监测哪一个器官的线索。组织结合：功效测定后，这些研究涉及对靶组织靶向和脱靶。市售可获得的组织阵列(zymed)及人和食蟹猴(cynomolgusmonkey)(charlesriver)的切片用10μg/mlrhigm12和对照人igmshigm39免疫标记。使用数字图像比较标记强度。将与固定的石蜡包埋的组织阵列及冷冻人和灵长类动物脑和脊髓结合的rhigm12与在活小鼠小脑切片中观察到的抗体结合进行比较。我们利用标准效能测定：与活的小脑切片结合的抗体，并进行首次筛选：其中鉴定出rhigm12的血清形式。引用的参考文献1.gurney，m.e.，等人，mutantcuznsuperoxidedismutaseinmotorneurondisease.jinhentmetabdis，1998.21(5)：p.587-97.2.morrison，b.m.andj.h.morrison，amyotrophiclateralsclerosisassociatedwithmutationsinsuperoxidedismutase：aputativemechanismofdegeneration.branresrev，1999.29(1)：p.121-35.3.siddique，t.，d.nijhawan，anda.hentati，familialamyotrophiclateralsclerosis.jneuraltransmsuppl，1997.49：p.219-33.4.cluskey，s，andd.b.ramsden，mechanismsofneurodegenerationinamyotrophiclateralsclerosis.molpathol，2001.54(6)：p.386-92.5.turner，b.j.andk.talbot，transgenics，toxicityandtherapeuticsinrodentmodelsofmutantsod1-mediatedfamilialals.progneurobiol，2008.85(1)p.94-134.6.bieber，a.j.，等人，humoralautoimmunityasamediatorofcnsrepair.trendsneurosci，2001.24(11suppl)：p.s39-44.7.warrington，a.e.，等人，humanmonoclonalantibodiesreactivetooligodendrocytespromoteremyelinationinamodelofmultiplesclerosis.procnatlacadsciusa，2000.97(12)：p.6820-5.8.warrington，a.e.，等人，neuron-bindinghumanmonoclonalantibodiessupportcentralnervoussystemneuriteextension.jneuropatholexpneurol，2004.63(5)：p.461-73.9.ciric，b.，等人，clonalevolutioninwaldenstrommacroglobulinemiahighlightsfunctionalroleofb-cellreceptor.blood，2001.97(1)：p.321-3.10.mitsunaga，y.，等人，directevidencethatahumanantibodyderivedfrompatientserumcanpromotemyelinrepairinamousemodelofchronic-progressivedemyelinatingdisease，fasebj，2002.16(10)：p.1325-7.11.rodriguez，m.，a.e.warrington，andl.r.pease，invitedarticle：humannaturalautoantibodiesinthetreatmentofneurologicdisease.neurology，2009.72(14)：p.1269-76.12.wnght，b.r.，等人，cellularmechanismsofcentralnervoussystemrepairbynaturalautoreactivemonoclonalantibodies.archneurol，2009.66(12)：p.1456-9.13.bruijn，l.i.，等人，als-linkedsod1mutantg85rmediatesdamagetoastrocytesandpromotesrapidlyprogressivediseasewithsod1-containirginclusions.neuron，1997，18(2)：p.327-38.14.gurney，m.e.，等人，motorneurondegenerationinmicethatexpressahumancu，znsuperoxidedismutasemutation.science，1994.264(5166)：p.1772-5.15.banks，w.a.，developingdrugsthatcancrosstheblood-brainbarrier.applicationstoalzheimersdisease.bmcneurosci，2008，9suppl3：p.s2.16.kozlowski，g.p.，l.sterzl，andg.nilaver，localizationpattemsforimmunoglobulinsandalbuminsinthebrainsuggestdiversemechanismsfortheirtransportacrosstheblood-brainbarrier(bbb).progbrainres，1992.91：p.149-54.17.denic，a.，等人，brainstem1hnuclearmagneticresonance(nmr)spectroscopy.markerofdemyelinationandrepairinspinalcord.annneurol，2009.66(4)：p.559-64.18.ludolph，a.c.，等人，guidelinesforthepreclinicalinvivoevaluationofpharmacologicalactivedrugsforals/mnd：reportonthe142ndenmcintemationalworkshop.amyotrophlateralscler，2007.8(4)：p，217-23.19.hunter，s.f.，d.j.miller，andm.rodriguez，monoclonairemyelination-promotingnaturelautoantibodysch94.03：pharmacokineticsandinvivotargetswithindemyelinatedspinalcordinamousemodelofmultiplesclerosis.jneurolsci，1997.t50(2)p.103-13。实施例21：使用神经元保护性人mab治疗脑缺血和中风缺血性中风的发病率随着年龄增长而增加。我们人口的老化导致每年越来越多中风，使我们的健康护理基础设施和家庭承担累积的负担。中风是美国长期残疾的主要原因。每年，接近800,000人患有中风。缺血性损伤之后，与临床缺陷相关的残疾主要是由于神经元的功能障碍。功能恢复的缺乏部分归因于再生和神经可塑性的限制(1)。目前不存在有效的治疗来预防或逆转中风相关的神经系统缺陷。天然存在的人单克隆igm类抗体已经得到鉴定并用于促进cns保护和修复，包括髓鞘修复和轴突/神经恢复(2)。我们鉴定了结合到神经元的表面的血清衍生的人单克隆igm。igm结合跨物种(包括人)的神经元，并促进神经突延伸。该igm在体外保护神经元免于细胞凋亡，并在体内保护脊髓轴突，如通过磁共振波谱和脊髓组织学所测量。已经合成了一种重组形式rhigm12，其保留血清衍生形式的特征。rhigm12的神经保护特性类似于用神经节苷脂gm1观察到的特性。神经节苷脂可以是抗体igm12和rhigm12的抗原。rhigm12与gm1、胆固醇和整合素β1共定位于神经元细胞膜上。gm1富含膜微结构域，其功能在于簇集细胞受体和信号转导分子。rh1gm12看起来通过簇集神经元膜结构域而模拟gm1的多效性作用。进行本研究以评价rhigm12在脑缺血损伤之后逆转神经缺陷的功效。这些研究目的在于将抗体应用于具有早期脑缺血损伤或患有中风的患者。中心假设是，抗体igm12和rhigm12介导的神经保护作用适用于治疗中以增加细胞和组织恢复，并促进从缺血性中风的整体恢复。脑缺血的治疗管理依赖于预防和减少危险因素，诸如血压升高、血栓形成和动脉粥样硬化。脑缺血的介入治疗仍然受限于通过使用重组组织纤溶酶原激活剂rtpa的酶促血栓溶解(3-5)，和经由直接插管介入去除血液凝块(6)。然而，rtpa具有短的3小时的治疗窗口，如果超过3小时时间期输注，则出血性脑缺血发病率增加(7，8)。保护脑缺血后受损神经元是一种限制永久残疾的有希望的策略。尽管调节炎症反应的治疗可具有神经保护特性，但目前存在很少直接作用于神经元以保护它们的药物。神经保护可以通过调节缺血区域中的神经毒性炎症环境来实现。先前使用抗体来治疗脑缺血的研究还没有产生潜在益处：细胞间粘附分子的拮抗剂用于大型多中心临床试验，当与安慰剂组相比时，治疗的受试者具有较高的死亡率和较差的后果(9)。脑缺血iii期临床试验中抗血小板抗体的使用导致小群患者中致命的出血(10)。多克隆人igg(ivig)的使用导致了脑缺血动物模型的改善(11)，然而临床试验报道了ivig施用后的血栓栓塞并发症，导致关于使用ivig来治疗脑缺血的混合观点(12，13)。一个目标是鉴定直接靶向神经系统的治疗性试剂。完全人抗体rhigm12的重组形式促进神经元存活，并且可以适用作恢复/神经保护治疗剂。在本实施例中的实验集中于抗体igm12，rhigm12在脑缺血小鼠模型中的治疗效果。利用的模型是使用光敏染料的非侵入性光血栓形成模型，因此比侵入性模型更加生理学。我们使用完全人单克隆抗体在脑缺血之后在动物中保护神经元和改善行为的方法既是原创的，又是创新的，并且所述抗体具有作为设计以在脑缺血和中风靶向和保护神经元的第一种药物的潜能。该分子的相关方面在下面列出：1)rhigm12结合于神经元的表面(参见图1)，并且保护神经元免于凋亡性细胞死亡(参见图3)。2)rhigm12是天然人自身抗体，且副作用是不可能的。3)rhigm12，尽管是igm，但在正常sjl小鼠和炎症动物中穿过血脑屏障(bbb)(参见图13)。4)本研究现在表明，当将rhigm12施用于诱导缺血性中风后的动物时，它导致动物功能的明显改善(图44)并保护组织完整性(图45)。结果和讨论利用一种独特方法来开发用于治疗中枢神经系统(cns)损伤的新型疗法(14，15)。已经鉴定了结合少突胶质细胞(16)或神经元(17)且可用于cns中的一系列人单克隆抗体。重组人抗体igm12(rhigm12)衍生自从患有瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom’smacroglobulinemia)的患者分离的抗体。该抗体特异性标记cns的神经元和轴突(17)。尽管是igm抗体，但它穿过血脑屏障(bbb)(参见图13)并特异性结合cns内的轴突和神经元。在体外rhigm12结合大量神经元，包括小脑颗粒神经元、皮质神经元、海马神经元和视网膜神经节细胞神经元。我们现有的关于修复性igm自身抗体的作用机制的假设是，它们在微结构域中交联分子，以刺激参与保护和修复的信号传导事件。脑缺血小鼠模型的标准化在我们实验室中在缺血性中风(光血栓形成脑缺血)的染料介导的光血栓形成模型中利用光敏染料(孟加拉玫瑰红，rb)。在1985年，watson等人引入脑pt作为局灶性脑缺血的简单模型(watsonbd，等人(1985)annneurol17：497-504)。为了实现血栓形成，全身注射光敏染料。随后通过完整颅骨的照明导致染料的局部活化与自由基形成和内皮的光过氧化作用。从而在照射血管中介导血块形成，且血管闭塞模拟脑缺血(dietrichwd，等人(1987)actaneuropathol72：315-325)。pt病变引发强烈、但延迟的炎症反应(schroeterm，等人(1997)stroke28：382-386)。该模型具有以下优点：缺血区域可以预先定义且高度局限，使得以立体定向精度凝结独特皮层区变得可能。通过尾静脉注射以10mg/ml溶解在pbs中的rb(0.02mg/g体重)。将连接至光源(150w卤素灯)的铰接光纤的孔(5mm)置于小鼠头部的标准位置。注射rb后一分钟，将脑通过完整颅骨暴露于恒定光(以活化rb)30秒。活化后，rb生成扰乱微脉管系统内的内皮细胞的自由基，这导致血小板聚集并触发凝固，导致小血管闭塞并引起血栓性脑缺血。我们在6周龄雌性小鼠中进行所有实验。在一项随机“盲法”试验中，小鼠在诱导脑缺血(模拟人临床病况的尝试)之后三十分钟接受gmp纯化的rhigm12，作为单次腹膜内剂量(i.p.500μl中200μg)。相比之下，安慰剂组接受磷酸盐缓冲盐水(pbs)。我们将脑缺血之后的缺血区可视化和定量的技术标准化(图43和45)。rhigm12改善了脑缺血之后动物中的功能活性，而没有弥散加权成像(dwi)定义的梗塞体积的显著差异使用accuscan开放视野设备计算功能缺陷。该设备由具有测量离散水平和垂直运动的光电池的单个丙烯酸笼组成。将5只cd-1小鼠组置于每个笼中并在诱导脑缺血前记录基线值1周。数据收集为每1小时区段的光束中断次数，并表示为距离基线的％水平(图44a)或垂直变化(图44b)。在第一天，诱导脑缺血之后，两组小鼠的自主活动存在类似缺陷。两种处理的直接成对比较显示，与pbs相比，在治疗后第3天，rhigm12治疗小鼠的水平运动功能的改善显著发散(p＜0.05)(图44a)。同样，与pbs相比，在治疗后第3天，rhigm12治疗小鼠的垂直运动功能显著发散(图44b)。改善持续长达30天，此时结束实验。利用dwi-mri来定义缺血体积，并将功能改善与梗塞面积的降低关联。在第1、3、7和21天在brukeravance300mhz(7特斯拉)小动物mri系统中扫描小鼠，并使用nihimagej软件定量获得的三维图像(图43a)。dwi没有显示在扫描的任何天在两组小鼠之间的统计显著性(图44c)，这表明在两组小鼠中脑缺血体积是相似的。据我们所知，这首次表明，针对神经元的完全重组天然人单克隆igm抗体在改善实验性脑缺血后动物的行为结果中是有效的。rhigm12治疗改善mt-mri度量并表明mt比率的显著差异dwi成像估计缺血性中风后水扩散上细胞毒性水肿的存在和程度。为了评价对组织完整性和损伤后的恢复更加敏感的mri量度，我们在随后的实验中在中风诱导后和用rhigm12治疗或pbs假治疗之后第3天在10只小鼠中利用磁化转移mri(mt-mri)。将获得的图像输入fsl(23，24)，并且在fslmaths中计算3d参数mtr图。我们使用标准公式100*((mo-mt)/mo)，其中mo是没有mt脉冲的3d图像，而mt是有mt脉冲的3d图像。将图像适当地缩放，以提供灰度百分位映射输出，值的范围为0至100(图45a)。在analyze11.0中使用标准3droi工具分析病变mt值，这允许分析缺血区域中的mt敏感组织损伤。对侧半球中的比较roi用来提供用于比较的对照值。rhigm12和pbs治疗组中对照侧的mtr值分别为(59.9±0.9)和(58.3±0.8)：如预期，统计分析没有揭示两组之间对照半球中的显著差异。有趣地，与用pbs的假治疗相比，rhigm12治疗导致中风亚体积中mtr值的相对增加(46.0±0.9相对于41.9+08，p＝0.01)。这显示抗体处理组中mt-mri可检测组织结构的相对正常化。此外，尽管没有达到统计学显著性(p＝0.39)，但与pbs治疗的对照组相比，在rhigm12治疗的小鼠中看到中风体积的降低(18.1±5.9mm3相对于26.1±6.6mm3)。mt-mri上的高度显著差异支持该抗体诱导的变化导致增强的组织修复，而不是中风体积的直接减少。rhigm12结合小鼠和人神经元并保护小鼠皮层神经元免于氧化损伤诱导的死亡假设rhigm12通过结合神经元保护缺血区的神经元。人抗体rhigm12结合至从小鼠和人获得的许多类型cns神经元的表面(参见图1)。这支持rhigm12介导的神经保护和功能改善将从小鼠到人是保留的。先前已经评价了rhigm12在体外是否保护神经元免于胱天蛋白酶-3(活性细胞凋亡的标志物)的过氧化物诱导的活化。原代小鼠皮质神经元的培养物用rhigm12或对照人igm和过氧化氢同时处理。24小时后，使用flica胱天蛋白酶-3测定试剂盒(immunochemistrytechnologies)测定胱天蛋白酶-3活化的程度(参见图3)。用rhigm12处理损伤的神经元使胱天蛋白酶-3活化降低80％。用对照igm处理损伤的神经元显示胱天蛋白酶-3活化少于10％降低。在不同的神经毒性测定中，使培养的皮层神经元直接经受缺氧条件(2.7％o2，92.3％n2，5％co2气氛4、21和44小时(44小时，非缺氧室细胞被认为是0小时对照)。胱天蛋白酶-3的水平通过western印迹测定(图46)，且发现胱天蛋白酶-3水平到4小时被上调，且在21小时达到峰值。到44小时，大多数细胞死亡，且胱天蛋白酶-3水平降低。这些测定将用于表明rhigm12在体外缺血样病况中是神经保护的。本研究中使用脑缺血性中风的小鼠模型来表明rigm12扭转之后神经缺陷且提供保护免于脑缺血损伤的能力。额外应用该模型以优化剂量配制，以确定抗体跨越血脑屏障的百分比，以及更好地理解rhigm12在体外保护培养的神经元免于缺血样病况。剂量和神经改善的生物标志物小鼠中使用rhigm12安慰剂对照的随机试验用于测定改善自发活动所需的最小剂量，并鉴定神经改善的生物标志物。上述数据表明，200μgrhigm12改善缺血性中风的小鼠模型中的神经功能。确定最小有效剂量与安全性研究的设计是相关的。在脑缺血之后的小鼠中进行rhigm12的剂量滴定研究。使用用染料rb的光血栓形成模型的雌性cd-1小鼠中的脑缺血用于施用研究中。在诱导脑缺血之后30分钟内，用5、50、100或500μgrhigm12，或用不结合神经元的市售对照人igm(jacksonimmunoresearch目录号009-000-012)，或用生理盐水i.p.处理5只小鼠组。在诱导脑缺血或治疗之前和在活动箱中每周测量神经功能。将5只小鼠组容纳在活动箱中，并记录自发垂直和水平活动。夜间水平活动是动物的功能能力的灵敏量度(25)。此外，所有小鼠都经历dwi-mri，以监测所有组中的梗塞面积。主要终点是通过监测自发活动评价运动改善。在rhigm12治疗组5天内与对照组相比经72小时记录的平均夜间活动的20％增加(2000光束中断/小时)(p＜0.05)被认为生物学上显著改善(25)。来自我们的实验室的建立方法(25)用于计算各组之间的统计学差异。使用analyze11.0(在mayoclinic开发的生物医学图像分析软件包(26，27))中的3droi分析工具以盲法方式进行dwi-mri分析。确定用rhigm12治疗之后神经功能的改善是否与保留的naa代谢物(与神经元功能相关的代谢物(28))相关，且是否与脑中mt-mri上的磁化转移率的相对正常化相关。mt是组织完整性的整体标志物，且已用作人缺血性中风中半影完整性的灵敏标志物(29)。这些测定用作脑缺血中rhigm12的人临床试验中的未来终点。基于对于mt-mri数据获得的功率计算，每组12只小鼠用于本实验中。先前将测量cns中n-乙酰基-天冬氨酸(naa)水平的技术标准化(30)。为了研究naa是否可以用作脑缺血之后rhigm12介导的功能改善的代谢物成像生物标志物，我们已经将三维像素标准化以在缺血区域进行mrs。在用最小有效剂量或同种型对照igm或盐水治疗的动物中测量naa代谢物。使用7t垂直孔nmr波谱仪和从置于在dwi和t2加权mri上鉴定的缺血区域内3x2x1.5mm三维像素获得的mrs数据进行mrs。对侧半球充当每只小鼠的适当对照。作为额外对照，其他组中的小鼠用对照igm或pbs治疗。在缺血性中风和随后用pbs或rhigm12治疗之前和之后，在有和没有总mt时间为270ms的mt脉冲(激发脉冲带宽为500hz，且抵消(offset)为1500hz)的情况下，通过用256x96x96矩阵大小，6.4x1.92x1.92cmfov，tr：1500，te：30，16的rare系数获取标准pd加权的rare序列而获得mt-mri数据。将每个实验重复三次，以确认使用成像生物标志物作为功能改善端点的再现性，本实验中总共108只小鼠(每组12只小鼠，共3组，重复3次)。使用brukerbiospin的topspin软件且经由lcmodel(31-34)定量mrs的谱。通过anova(30)计算组之间的统计学差异。使用fslmaths和analyze11.0软件计算mtr数据。与对照组相比，在rhigm12治疗组中测定mtr的相对正常化和naa水平的保留或相对增加。任何rhigm12治疗组中相比于对照组的保留naa的10％增加被认为是改善。已经报道兴奋性神经递质诸如谷氨酸和甘氨酸(35)在脑缺血之后以高水平存在。由于mrs光谱是一种通用技术，我们还定量其他代谢物诸如乳酸、肌醇、胆碱、肌酸、甘氨酸和谷氨酸。血脑屏障评价在光血栓形成rb中风模型中测定穿过血脑屏障(bbb)的rhigm12的比例。关于大igm分子是否可以进入cns存在争论。公认的教条是分子量接近1百万的igm太大而不能从循环穿过bbb进入cns(36，37)。然而，存在越来越多的证据证明一些igm可以穿过bbb。已经显示rhigm12可以进入正常未感染小鼠以及tmev感染小鼠的cns(参见图13)。35s标记的抗体用于确定穿过bbb的抗体的百分比，并进一步表明igm直接作用于缺血区中的神经元。我们评价脑缺血模型中i.v.注射后cns中的神经元结合。产生同位素标记的(35s)rhigm12，并验证其结合于神经元的表面。在诱导脑缺血之后的每个时间点，将有效剂量的rhigm12或同种型对照igm或对照非特异性iggi.v.施用于3只小鼠组。没有缺血的正常cd-1小鼠充当对照。使用总共144只小鼠实施该实验三次(3只小鼠/组，共5个时间点，和3组，加上3只未处理小鼠组，重复3次)。测定穿过bbb且在注射后4、8、24、48和72小时的脑/脊髓实质中发现的35s的百分比。此外，我们使用由我们实验室出版的放射自显影技术(38)确定脑/脊髓中35s定位的部位。我们已经提出，rhigm12直接作用于神经系统，外周注射后穿过bbb，以与神经元相互作用并保护它们免于死亡。神经元培养还在体外“缺血样”神经元培养测定法中评价rhigm12神经保护。表明体外环境中rhigm12保护神经元的功效将解决神经元结合性自身抗体可对神经元是毒性的担忧。我们通过用rhigm12或用对照抗体治疗正常、氧和/或葡萄糖剥夺皮质神经元之后分析胱天蛋白酶水平来解决这一点。此外，体外测定的开发将为将来的信号传导研究提供必要工具。脑缺血后的损伤可以通过几种不同机制发生。对于一种类型损伤神经保护的试剂不一定对所有类型都是保护的(39)。我们建立了使用葡萄糖剥夺(gd)、缺氧(od)以及组合的od和gd(ogd)损伤的神经毒性测定法，所述损伤类似于脑缺血之后观察到的损伤。我们已经使用过氧化氢(图3)和缺氧室(图46)实施类似测定，以评价rhigm12对小鼠皮质神经元的保护作用。gm1被用作阳性对照，因为rhigm12的神经保护特性让人想起对于gm1所观察到的特性。从16天cd-1小鼠胚胎建立新皮层片段的分离的细胞培养物。此类培养物中约95％的细胞是神经元，而其余细胞是星形胶质细胞。gd通过将神经元在无葡萄糖locke培养基中孵育24小时而诱导。具有95％n2、5％co2气氛的无氧室用于诱导od(神经元在常规培养基中孵育12小时)和ogd(神经元在无葡萄糖locke培养基中孵育12小时)。将神经元在单独培养基，或补充rhigm12(以有效剂量)的培养基，或对照igm或gm1存在的情况下孵育。在不同天使用编码处理一式三份独立地进行三次实验，以避免偏差。主要终点为神经元细胞活力，其通过使用alamar蓝溶液通过线粒体活性测定法来测定。使用flica凋亡检测试剂盒分析神经元培养物的活化胱天蛋白酶。使用两种不同的荧光检测方法：用于定性分析的荧光显微镜；和用于定量的96孔微滴定板荧光计。细胞存活通过将细胞与hoechst株孵育30min评价，并使用uv滤光器(在365nm激发和在480nm发射)读取。当通过荧光显微镜观察细胞时，凋亡细胞发红色荧光，而非凋亡细胞看起来大部分是未染色的。更晚期凋亡细胞的红色看起来早期细胞更亮。使用荧光板读数器(用黑色微量滴定板)，将凋亡定量为从结合至胱天蛋白酶的flica探针发射的红色荧光的量。anova用于比较组之间的显著差异。来自该实验的结果将帮助确定参与神经保护的下游信号传导事件。引用的参考文献1.walmsley，a.r.，andmir，a.k.2007.targetingthenogo-asignallingpathwaytopromoterecoveryfollowingacutecnsinjury.currentpharmaceuticaldesign13：2470-2484.2.rodriguez，m.，warrington，a.e.，andpease，l.r.2009.invitedarticle：humannaturalautoantibodiesinthetreatmentofneurologicdisease.neurology72：1269-1276.3.brott，t.g.，haley，e.c.，jr.，levy，d.e.，barsan，w.，broderick，j.，sheppard，g.l.，spilker，j.，kongable，g.l.，massey，s.，reed，r.，等人1992.urgenttherapyforstroke.parti.pilotstudyoftissueplasminogenactivatoradministeredwithin90minutes.stroke；ajoumalofcerebralcirculation23：632-640.4.haley，e.c.，jr.，levy，d.e.，brott，t.g.，sheppard，g.l.，wong，m.c.，kongable，g.l.，tomer，j.c.，andmarla，j.r.1992.urgenttherapyforstroke.partii.pilotstudyoftissueplasminogenactivatoradministered91-180minutesfromonsetstroke；ajoumalofcerebralcircutation23：641-645.5.group，t.n.i.o.n.d.a.s.r.-p.s.s.1995.tissueplasminogenactivatorforacuteischemicstroke.thenewenglandjoumalofmedicine333：1581-1587.6.gobin，y.p.，starkman，s.，duckwiler，g.r，grobelny，t.，kidwell，c.s.，jahan，r.，pile-spellman，j.，segal，a.，vinuela，f.，andsaver，j.l.2004.merci1：aphase1studyofmechanicalembolusremovalincerebralischemia.stroke：ajoumalofcerebralcirculation35：2848-2854.7.clark，w.m.，wissman，s.，albers，g.w.，jhamandas，j.h.，madden，k.p.，andhamilton，s.1999.recombinanttissue-typeplasminogenactivator(alteplase)forischemicstroke3to5hoursaftersymptomonsettheatlantisstudy：arandomizedcontrolledtrial.alteplasethrombolysisforacutenoninterventionaltherapyinischemicstroke.jama：thejoumaloftheamericanmedicalassociation282：2019-2026.8.hacke，w.，kaste，m.，bluhmki，e.，brozmen，m.，davalos，a.，guidetti，d.，larrue，v.，lees，k.r.，medeghri，z.，machnig，t.，等人2008.thrombolysiswithalteplase3to4.5hoursafteracuteischemicstroke.thenewenglandjoumalofmedicine359：1317-1329.9.investigators，e.a.s.t.2001.useofanti-icam-1therapyinischemicstroke：resultsoftheenlimomabacutestroketrial.neurology57：1428-1434.10.adams，h.p.，jr.，effron，m.b.，tomer，j.，davalos.a.，frayne.j.，teal，p.，leclerc，j.，oemar，b.，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ationof18metabolitesinshort-echo-time(1)hnmrspectraoftheratbrain.joumalofmagneticresonance141：104-120.35.cestillo，j.，davalos，a.，andnoya，m.1997.progressionofischaemicstrokeandexcitotoxicaminoacids.lancet349：79-83.36.banks，w.a.2008.devalopingdrugsthatcancrosstheblood-brainbarrier：，applicationstoalzheimer′sdisease.bmcneurosci9suppl3：s2.37.kozlowski，g.p.，sterzl，i.，andnilaver，g.1992.localizationpatternsforimmunoglobulinsandalbuminsinthebrainsuggestdiversemechanismsfortheirtransportacrosstheblood-brainbarrier(bbb).progbrainres91：149-154.38.hunter，s.f.，miller，d.j.，androdriguez，m.1997.monoclonalremyelination-promotingnaturalautoantibodysch94.03：pharmacokineticsandinvivotargetswithindemyelinatedspinalcordinamousemodelofmultiplesclerosis.jneurolsci150：103-113.39.ryu，b.r.，choi，d.w.，hartley，d.m.，costa，e.，jou，i.，andgwag，b.j.1999.attenuationofcorticalneuronalapoptosisbygangliosides.thejoumalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics290：811-816。实施例22：正常(常氧)和缺氧条件下的抗体活性和影响为了进一步评价神经活性抗体(特别是抗体igm12)在细胞中和相关和模拟中风、心肌梗塞或缺血的条件下的影响和能力，进行研究以评价在常氧和缺氧条件下的抗体。培养中的缺氧条件用来模拟临床情景中由中风和缺血导致的缺氧的方面。首先在混合胶质细胞培养物中评价常氧培养物的各种标志物。然后在有和没有神经活性和对照抗体的情况下在缺氧条件下评价相关标志物，以评价效果和能力。常氧条件为了评价正常或常氧条件，使混合胶质细胞在含有fbs(10％)的培养基中生长4天，并在具有促进髓鞘再生的igmrhigm22、再生的mabrhigm12、同种型对照shigm116(各10μg/ml)的化学定义的培养基或仅培养基中处理7天。每两天更换具有新鲜抗体的培养基。结果显示在图47中。条形图显示来自三次独立实验的western印迹的定量分析，其使用髓鞘标志物mbp、凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3和作为用于活化的小胶质细胞的标志物的cd68。这些结果显示，再生抗体rhigm12刺激混合胶质细胞培养物中少突胶质细胞祖细胞(opc)分化和存活。这些数据显示，再生抗体rhigm12，而非促进髓鞘再生的抗体rhigm22或同种型对照shigm116刺激opc分化，减少胶质细胞凋亡的水平并活化小胶质细胞。还没有确定从经历凋亡拯救的特定细胞类型。然后将opc-小胶质细胞共培养物在具有促进髓鞘再生的mabsa2b5、o4、o1、78.09、94.03、rhigm22，再生的mabrhigm12，同种型对照(leaf、5a5、chrompureigm、rhigm42、shigm14、shigm24、shigm26)(各10μg/ml)的星形胶质细胞条件培养基或培养基中培养。每两天更换具有新鲜抗体的培养基。图48中代表性western印迹显示opc标志物pdgfαr、髓鞘标志物cnpase和mog、小胶质细胞标志物cd68和lyn、增殖标志物ki-67和组蛋白h3、凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3和细胞周期标志物prbs795的水平。对于gsl结合的再生mab刺激星形胶质细胞条件培养基中的opc分化和存活，需要星形胶质细胞和小胶质细胞。上述常氧数据表明，(i)在opc/ol-小胶质细胞共培养物中，与同种型对照相比，促进髓鞘再生的mabs(a2b5、o4、o1、78.09、94.03)或再生mabrhigm12没有诱导opc分化和存活；(ii)星形胶质细胞条件培养基中的可溶性因子不足以刺激治疗组之间的差异；(iii)促进髓鞘再生和再生mab在星形胶质细胞不存在的情况下没有活化小胶质细胞(cd68,lyn)；(ⅳ)在igm治疗6天后，可溶性星形胶质细胞因子看起来足以介导rhigm22的opc增殖(ki-67，组蛋白h3)。在下一组常氧研究中，使混合胶质细胞培养物生长，并如先前所述处理(上文图47)。图49提供了来自使用标志物cd68(用于活化的小胶质细胞)和lyn激酶(小胶质细胞中的高丰度激酶，在opc中程度较低，但在星形胶质细胞中不存在)的三次独立实验的western印迹的定量分析的条形图。代表性免疫荧光图像在图50中提供，且显示在mab处理之前培养第4天和用rhigm12、rhigm22和同种型对照shigm24(各10μg/ml)处理7天之后培养第11天混合胶质细胞中cd68(绿色)和核标志物dapi(蓝色)的水平。这些数据表明，再生mabrhigm12增加混合胶质细胞培养物中cd68和lyn激酶的表达。western印迹中cd68的较高表达水平(图49)可以与通过免疫细胞化学法的活化的小胶质细胞的较高数量相关(图50)。因此，如这些研究中显示，促进髓鞘再生的抗体(示例性抗体a2b5和o1)和再生mabigm12活化混合胶质细胞培养物中的小胶质细胞(cd68)。缺氧条件然后将缺氧对混合胶质细胞培养物的分子影响与常氧培养比较。使混合胶质细胞培养物在含有fbs(10％)的培养基中生长4天，并在缺氧条件(3％o2)(与常氧条件(21％o2)相比)下在化学定义的培养基中处理额外7天。代表性western印迹(图51)显示缺氧诱导因子1(hif1α)、少突胶质细胞标志物ng2、pdgfα、olig-2、髓鞘标志物mbp和cnpase、星形胶质细胞标志物gfap、小胶质细胞标志物cd68、细胞周期标志物prbs795和凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3的水平。β-肌动蛋白用作上样对照。如图51中所示的暴露于缺氧和常氧的混合胶质细胞培养物的western印迹的定量分析从三次独立实验完成，并显示于图52。这些数据表明，与常氧条件相比，在缺氧条件下，混合胶质细胞培养物中，小胶质细胞和星形胶质细胞标志物表达水平降低，且髓鞘标志物的水平增加。缺氧下增加的hif1α表达显示了缺氧模型的验证。已经验证了缺氧模型，然后进行用再生抗体igm12处理缺氧培养物，以评价与中风、梗塞和缺血作用相关并模拟中风、梗塞和缺血作用的条件下的抗体作用。使混合胶质细胞培养物在常氧条件下在含有fbs(10％)的培养基中生长4天，随后在缺氧(3％o2)下在具有人再生抗体rhigm12的化学定义的培养基或仅培养基中处理1-7天。代表性western印迹(图53)显示增殖标志物ki-67、小胶质细胞标志物iba-1、cd68和inos、凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3、星形胶质细胞标志物gfap、细胞周期标志物prbs795和prbs807和少突胶质细胞标志物pdgfαr、ng2、olig-1、olig-2和髓鞘标志物mbp的水平。来自这些数据的结果表明在缺氧下rhigm12处理的功效。rhigm12活化小胶质细胞，刺激胶质细胞(prbs)的细胞周期退出，降低胶质细胞凋亡的水平，并降低缺氧下髓鞘产生的增加水平。因此，再生抗体rhigm12刺激缺氧混合胶质细胞培养物中胶质细胞存活并降低opc分化。缺氧(相比于常氧)下rhigm12的分子结果通过缺氧(相比于常氧)下对混合胶质细胞的rhigm12介导的作用的直接比较来评价。将混合胶质细胞如前所述培养，并在缺氧或常氧条件下在具有rhigm12、rhigm22的化学定义的培养基或仅培养基中处理7天。代表性western印迹(图54)显示小胶质细胞标志物iba-1和cd68、细胞凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶-3、星形胶质细胞标志物gfap、少突胶质细胞标志物pdgfαr、ng2和olig-2和髓鞘标志物mbp和cnpase的水平。rhigm12显示在常氧和缺氧条件两者下刺激小胶质细胞表达标志物cd68和iba-1的的功效。最显著地，rhigm12平衡缺氧相比于常氧条件对髓鞘标志物表达mbp和cnpase的影响。在动物中评价缺氧条件，以检查培养标志物的有效性和一致性。进行来自p13大的新生b16小鼠的缺氧和常氧皮质的分子分析。c57/bl6新生小鼠通过cd1母兽交叉培育，并从p3至p7暴露于缺氧(10％o2)4天。随后将小鼠暴露于室内空气，持续额外6天，并在p13处死。从两个处理组(常氧和缺氧小鼠)的皮层中分离rna，并探测髓鞘标志物plp1、mog、mbp1、少突胶质细胞祖细胞标志物pdgfαr和olig-1、星形胶质细胞标志物gfap、神经元标志物巢蛋白和β3-微管蛋白、缺氧诱导因子1α和肌长蛋白蛋白sspn。表达水平通过rt-pcr分析，并将结果针对β肌动蛋白的水平均一化。进行来自p13的缺氧和常氧c57/b16新生鼠的皮层的标志物的rt-pcr分析，并且结果显示于图55。来自这些数据的结果表明，新生小鼠的缺氧处理选择性降低皮层组织中髓鞘标志物的表达水平，但不降低皮层组织中新生、opc或星形胶质细胞标志物的表达水平。实施例23-igm抗体rhigm12在中风小鼠模型中的定位为了评价中风或缺血事件后用于干预的抗体进入和定位，通过单克隆抗体的ip施用利用中风动物模型。在小鼠中诱导中风，施用放射性标记的抗体，然后通过在直至施用后24小时的时段测定放射性标记而评价动物组织中的抗体。评价含有中风病变的脑(皮层)以及小脑、脊髓、肝脏、脾脏、肾脏和血清。使用上述光活化的孟加拉玫瑰红方案在三只成年cd-1小鼠的右大脑皮质中诱导中风，三只其他小鼠接受了假中风程序，孟加拉玫瑰红但没有光活化。在中风后30至40min，将500ul体积盐水中10百万cpm的35s标记的rhigm12(对应于约60ugigm)腹膜内施用于每只小鼠。在igm施用或处理后6,、12和24小时，从小鼠收集血液，用30ml生理盐水洗涤脉管系统，并快速收集组织。对于组织中放射性标记的分析，将含有病变区域的脑右前皮质去除，作为75mg组织块。将组织溶解在solvable(perkinelmer)中，并根据制造商的方案在ultragold液体闪烁混合物中测定cpm。去除一部分其他组织，称重并根据perkinelmer提供的比率处理。结果显示在图56中。尽管本研究在每个时间点利用单一小鼠，值得注意的是，rhigm12在24小时内在cns组织中积累，而相反，rhigm12水平在负责血液代谢的组织和血清本身中下降。在6小时在中风小鼠的皮层中rhigm12的高水平(图56中第一小图表示脑)表明，在该时间过程中，igm改善进入中风区域。与正常/假程序动物相比，在该时间点中风动物的脑/皮层中存在显著更多的标记。同样有趣的是，rhigm12进入中风小鼠和对照小鼠的cns组织，同样表明完整bbb不会完全阻断这种治疗性igm到达cns损伤区域的能力。当预期药物具有其最大效果时，在关键的中风后前12个小时过程中，rigm12抗体到达中风区域。本发明可体现在其他形式中，或者在不偏离其精神或基本性质的情况下以其他方式实施。因此，本公开内容在所有方面都被视为说明性的和非限制性的，本发明的范围由随附权利要求书限定，并且本文欲包括在等同含义和范围内的所有改变。本说明书引用了各种参照文献，所述文献各自都通过引用以其整体结合到本文中。序列表<110>m.罗德里格斯a.e.沃林顿l.r.皮斯<120>用于中风和缺血或缺血性病况的人抗体及其特异性结合序列<130>1199-1-016pct3<140>未指定<141>2013-04-17<150>61/625,628<151>2012-04-17<160>46<170>用于windows4.0版本的fastseq<210>1<211>118<212>prt<213>智人<400>1glnvalglnleuglngluserglyproglyleuleulysproserglu151015thrleuserleuthrcysthrvalserglyglyservalserleutyr202530tyrtrpsertrpileargglnserproglylysgluproglutrpile354045glytyriletyrserserglyserthrasptyrasnproserleuarg505560serargvalthrileserleuaspthrserasnasnargpheserleu65707580asnleuargservalthralaalaaspthralavaltyrtrpcysala859095argseralaserileargglytrppheaspprotrpglyglnglythr100105110leuvalthrvalserser115<210>2<211>354<212>dna<213>智人<400>2caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactgctgaagccttcggagaccctgtccctc60acatgcactgtctctggtggttccgtcagtctttactactggagctggatccggcagtcc120ccagggaaggaaccggagtggattggatatatctattccagtggaagcaccgattacaac180ccttccctcaggagtcgagtcaccatatcactggacacgtcaaacaaccggttttcccta240aacctgaggtctgtgaccgccgcagatacagcggtctattggtgtgcgagaagtgcgtca300attaggggctggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca354<210>3<211>104<212>prt<213>智人<400>3glyseralaseralaprothrleupheproleuvalsercysgluasn151015serproseraspthrserservalalavalglycysleualaglnasp202530pheleuproaspserilethrphesertrplystyrlysasnasnser354045aspileserserthrargglypheproservalleuargglyglylys505560tyralaalathrserglnvalleuleuproserlysaspvalmetgln65707580glythraspgluhisvalvalcyslysvalglnhisproasnglyasn859095lysglulysasnvalproleupro100<210>4<211>310<212>dna<213>智人<400>4gagtgcatccgccccaacccttttccccctcgtctcctgtgagaattccccgtcggatac60gagcagcgtggccgttggctgcctcgcacaggacttccttcccgactccatcactttctc120ctggaaatacaagaacaactctgacatcagcagcacccggggcttcccatcagtcctgag180agggggcaagtacgcagccacctcacaggtgctgctgccttccaaggacgtcatgcaggg240cacagacgaacacgtggtgtgcaaagtccagcaccccaacggcaacaaagaaaagaacgt300gcctcttcca310<210>5<211>112<212>prt<213>智人<400>5valilealagluleuproprolysvalservalphevalproproarg151015aspglyphepheglyasnproarglysserlysleuilecysglnala202530thrglypheserproargglnileglnvalsertrpleuargglugly354045lysglnvalglyserglyvalthrthraspglnvalglnalagluala505560lysgluserglyprothrthrtyrlysvalthrserthrleuthrile65707580lysgluserasptrpleuserglnsermetphethrcysargvalasp859095hisargglyleuthrpheglnglnasnalasersermetcysvalpro100105110<210>6<211>336<212>dna<213>智人<400>6gtgattgctgagctgcctcccaaagtgagcgtcttcgtcccaccccgcgacggcttcttc60ggcaacccccgcaagtccaagctcatctgccaggccacgggtttcagtccccggcagatt120caggtgtcctggctgcgcgaggggaagcaggtggggtctggcgtcaccacggaccaggtg180caggctgaggccaaagagtctgggcccacgacctacaaggtgaccagcacactgaccatc240aaagagagcgactggctcagccagagcatgttcacctgccgcgtggatcacaggggcctg300accttccagcagaatgcgtcctccatgtgtgtcccc336<210>7<211>106<212>prt<213>智人<400>7aspglnaspthralaileargvalphealaileproproserpheala151015serilepheleuthrlysserthrlysleuthrcysleuvalthrasp202530leuthrthrtyraspservalthrilesertrpthrargglnasngly354045glualavallysthrhisthrasnilesergluserhisproasnala505560thrpheseralavalglyglualaserilecysgluaspasptrpasn65707580serglygluargphethrcysthrvalthrhisthraspleuproser859095proleulysglnthrileserargprolys100105<210>8<211>318<212>dna<213>智人<400>8gatcaagacacagccatccgggtcttcgccatccccccatcctttgccagcatcttcctc60accaagtccaccaagttgacctgcctggtcacagacctgaccacctatgacagcgtgacc120atctcctggacccgccagaatggcgaagctgtgaaaacccacaccaacatctccgagagc180caccccaatgccactttcagcgccgtgggtgaggccagcatctgcgaggatgactggaat240tccggggagaggttcacgtgcaccgtgacccacacagacctgccctcgccactgaagcag300accatctcccggcccaag318<210>9<211>131<212>prt<213>智人<400>9glyvalalaleuhisargproaspvaltyrleuleuproproalaarg151015gluglnleuasnleuarggluseralathrilethrcysleuvalthr202530glypheserproalaaspvalphevalglntrpmetglnargglygln354045proleuserproglulystyrvalthrseralaprometproglupro505560glnalaproglyargtyrphealahisserileleuthrvalserglu65707580gluglutrpasnthrglygluthrtyrthrcysvalvalalahisglu859095alaleuproasnargvalthrgluargthrvalasplysserthrgly100105110lysprothrleutyrasnvalserleuvalmetseraspthralagly115120125thrcystyr130<210>10<211>392<212>dna<213>智人<400>10gggtggccctgcacaggcccgatgtctacttgctgccaccagcccgggagcagctgaacc60tgcgggagtcggccaccatcacgtgcctggtgacgggcttctctcccgcggacgtcttcg120tgcagtggatgcagagggggcagcccttgtccccggagaagtatgtgaccagcgccccaa180tgcctgagccccaggccccaggccggtacttcgcccacagcatcctgaccgtgtccgaag240aggaatggaacacgggggagacctacacctgcgtggtggcccatgaggccctgcccaaca300gggtcaccgagaggaccgtggacaagtccaccggtaaacccaccctgtacaacgtgtccc360tggtcatgtccgacacagctggcacctgctac392<210>11<211>105<212>prt<213>智人<400>11aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnserilesersertyr202530leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysvalleuile354045tyralaalaserthrleuargserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuservalserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnsertyrhisthrprotrp859095thrpheglyglnglythrlysvalglu100105<210>12<211>315<212>dna<213>智人<400>12gacatccagatgacccagtctccatcctccttgtctgcgtctgtaggagacagagtcacc60atcacttgccgggcaagtcagagtattagtagttatctaaattggtatcagcagaaacca120gggaaagcccctaaggtcctgatctatgctgcatccactttgcgaagtggggtcccgtca180aggttcagtggcagtggatctgggacaga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