本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种新型酿酒酵母表达体系及其构建方法。
背景技术：
随着基因组学研究的迅速发展，如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等多种表达体系应运而生，以满足挖掘新基因及其新功能，构建新型工程菌等的迫切需求。酵母表达体系有很多，如酿酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母和产朊假丝酵母等，其中酿酒酵母和毕赤酵母是最常用的两种表达系统。
酿酒酵母（saccharomycescerevisiae），又称面包酵母，长期应用于酿酒、面包和馒头制作等，安全可靠，不产生毒素，是国际公认的食品安全级（generallyregardedassafe，gras）真核微生物；由于其菌体细胞富含营养，具很高的经济价值，酵母抽提物或酵母浸出物（yeastextract）不仅广泛用于微生物、动植物细胞培养，在制药、酿造及发酵食品中有着举足轻重的作用，而且也直接用于饲料及食品添加剂；由于酵母在工业生产中具有良好的发酵性能，在发酵过程中能够快速分裂，容易培养，对杂菌污染具有较强的抗性，遗传背景清晰，基因操作简单等优势，使其在基因工程技术中常被用于代谢工程改造的出发菌株；在新近推崇的合成生物学研究中，酿酒酵母因其特殊的代谢能力等特点已成为备受关注的底盘细胞，可用于不同作用微生物细胞工厂的构建；相较于原核生物，能识别真核基因帮助其进行转录翻译后修饰，表达蛋白接近天然构象，并且可以将外源蛋白分泌至胞外，有利于表达产物纯化；作为模式物种之一，有许多涉及人类遗传性疾病的基因均与酵母基因具有很高的同源性，所以酵母还可以作为高等真核生物特别是人类基因组研究的模式生物，以提高基因诊断和治疗水平；以酿酒酵母为代表的酵母表达体系已成为生产生物基化学品、表达新型外源基因，服务于工农业和医药领域的重要工具。
通常情况下，酿酒酵母与其他真核生物一样，至少产生三种主要的rna，包括核糖体rna（rrna）、转运rna（trna）和信使rna（mrna），其中，rrna是由rna聚合酶i负责合成的，表达编码的蛋白质是由rna聚合酶ii负责合成的，trna和5srrna则是由rna聚合酶iii负责合成的。外源基因在酵母中的表达效率与启动子强度、rna聚合酶ii调控的mrna的转录效率等因素有关，目前使用的酿酒酵母表达体系因缺乏强有力的启动子，及受到其他方面因素的影响，利用酿酒酵母发酵生产时，高水平表达外源基因尚有难度。
酿酒酵母产生的rrna占总rna含量的80%[warnerjr.theeconomicsofribosomebiosynthesisinyeast.trendsbiochemsci.1999,24(11):437–440]，其与核糖体蛋白质和其他一些关联的蛋白在细胞核内组装形成大小亚基，并转运出核，在细胞质中组装成成熟的核糖体，实现蛋白质的翻译。细胞每分钟产生约2000个核糖体[warnerjr.theeconomicsofribosomebiosynthesisinyeast.trendsbiochemsci.1999,24(11):437–440.]。编码rrna的rdna基因一般以约150~200个重复的单元拷贝随机地位于染色体xii上[petestd:yeastribosomaldnagenesarelocatedonchromosomexii.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica.1979,76(1):410–414]，rdna基因的转录开始于rna聚合酶i在启动子位置与四个主要的转录因子即核心因子（cf）、rrn3p、tata结合蛋白（tbp）和上游激活因子复合物（uaf）形成起始复合物。细胞在核糖体生物合成中的能量投入大于对任何其它过程的投入。根据计算，在酵母标准生长的条件下，rna聚合酶i介导的转录起始必须每5s发生一次[reeder,r.h.,lang,w.h.terminatingtranscriptionineukaryotes:lessonslearnedfromrnapolymerasei.trendsbiochem.1997,sci.22:473–477]。rna聚合酶i以约60个核苷酸/秒延伸通过35srrna基因[frenchsl,osheimyn,ciocif,nomuram,beyeral.inexponentiallygrowingsaccharomycescerevisiaecells,ribosomalrnasynthesisisdeterminedbythesummedrnapolymeraseiloadingrateratherthanbythenumberofactivegenes.molcellbiol.2003,23:1558–1568]。通过rna聚合酶i介导rdna转录在高的起始速率、聚合酶密度、在核仁内的特异性组织以及与核糖体组装的紧密连接等方面是独一无二的，占核内总转录的60％以上[warnerjr.theeconomicsofribosomebiosynthesisinyeast.trendsbiochemsci.1999,24(11):437–440]。转录产物全长大概是6.7kb，也明显长于rna聚合酶ii和iii介导的转录产物。rna聚合酶i独特的转录起始和延伸效率比rna聚合酶ii和rna聚合酶iii都明显要快。利用rna聚合酶i在rdna基因转录方面的所起到高效作用这一特点，我们利用rdna基因启动子启动外源或内源基因表达，构建了一种新型酿酒酵母表达体系。
技术实现要素：
针对目前酵母表达体系存在的不足，利用rna聚合酶i在rdna基因转录方面的高效作用，用rdna基因启动子启动外源或内源基因表达，构建了一种新型酿酒酵母表达体系。同时对于酿酒酵母中rna聚合酶i介导的调控机制和rrna合成机制的研究也具有重要的意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种新型酿酒酵母表达体系，由表达载体转染宿主构成，所述表达载体为环状，是构建于酿酒酵母和大肠杆菌间的穿梭质粒载体，该载体从5’到3’依次包括以下可操作性元件：yeplac195质粒骨架、外源或内源基因表达盒、筛选标记基因表达盒；
所述yeplac195质粒是酵母附加体质粒，含有酵母2μ质粒的ori；
所述外源或内源基因表达盒自上游至下游依次包括rdna启动子、内部核糖体进入位点（internalribosomeentrysite，ires）序列、外源或内源基因表达框、poly(t)序列、rdna终止子；
所述筛选标记基因表达盒包括启动子、筛选标记基因、转录终止子。
所述外源或内源基因表达盒中的基因开放阅读框为尿嘧啶基因或gfp基因，其中尿嘧啶基因开放阅读框来源于来源于酿酒酵母，序列如seqidno:4所示。
所述外源或内源基因表达盒中的rdna启动子和rdna终止子，序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示；
所述外源或内源基因表达盒中的内部核糖体进入位点，序列如seqidno:3所示；
所述外源或内源基因表达盒中的poly(t)，序列如seqidno:5所示。
所述的筛选标记基因表达盒中可包括至少一个的筛选标记基因，所述标记基因可为潮霉素b抗性基因和/或g418抗性基因；所述的潮霉素b抗性基因的dna序列如seqidno:6所示；所述的g418抗性基因的dna序列如seqidno:7所示；
所述筛选标记基因的启动子，序列如seqidno:8所示；
所述筛选标记基因的终止子，序列如seqidno:9所示。
本发明另一方面还提供了该表达体系的构建方法，包括如下步骤：
（1）酿酒酵母新型表达体系的表达载体构建；
（2）外源或内源基因表达：将基因编码框插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；将所述重组表达载体转化宿主菌酿酒酵母；筛选并验证宿主菌酿酒酵母阳性转化子；
步骤（2）中重组表达载体转化宿主菌酿酒酵母的方法包括peg-liac转化法、电转化法和原生质体转化法。
优选地，步骤（2）中重组表达载体转化宿主菌酿酒酵母的方法是peg-liac转化法。
进一步的，本发明还包括由上述表达体系表达的蛋白。
本发明的有益的技术效果在于：
1、本发明提供了能够应用于酿酒酵母表达外源或内源基因表达盒元件：rdna启动子、ires序列、poly(t)序列和rdna终止子，并以此构建了一系列新型表达载体，采用该系列表达载体，可方便地对该酵母进行外源或内源蛋白的表达以及代谢通路的改造。
2、本发明所述外源基因表达盒中的rdna启动子能够被rna聚合酶i识别并结合，进而利用rna聚合酶i在rdna基因转录方面的高效作用，完成外源基因的高效表达；
3、本发明所述外源基因表达盒中的内部核糖体进入位点（ires）可行使类似rna聚合酶ii指导的mrna转录出的5’帽子结构的功能，能够在体内不招募任何起始翻译因子的情况下，被核糖体小亚基结合并启动翻译，进行蛋白质的合成。
4、本发明所述外源基因表达盒中的poly(t)序列经在转录的外源基因mrna后面的带有50bp的poly(a)尾巴，有助于外源基因的mrna从细胞核转运到细胞质，并且可以增强外源基因mrna的稳定性。
5、本发明所述新型酿酒酵母表达体系对在酿酒酵母中rna聚合酶i介导rdna转录调控机制和rrna合成机制的研究方面也具有重要的意义。
附图说明
图1为实施例1中潮霉素b基因表达框构建到yeplac195上的pcr验证图m：1kbdnamarker；1：利用引物hygb-f和pj-tef1-ncoi-r进行菌落pcr扩增到的hygb-tef1终止子基因片段。
图2为实施例1中尿嘧啶基因表达框各元件构建到yep-hygb上的pcr验证图m：1kbdnamarker；1：利用引物asci-ura3-f和rdnat-hindiii-r扩增到的ura3-poly(t)-rdna终止子基因片段。
图3为实施例2中确定新型表达载体yep-hygb-riutr成功转化到酿酒酵母的pcr验证图m：1kbdnamarker；1：利用引物saci-rdnap-f和ura3-xhoi-rpcr扩增到的rdna启动子-ires-ura3基因片段。
图4为实施例3中新型表达体系在含有或不含有尿嘧啶的合成培养基上的梯度生长测试。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。这些实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均视为落入本发明的范围。
为了验证新型表达体系在酵母中的可行性和有效性，本发明以尿嘧啶基因的表达为例，利用该表达体系表达尿嘧啶基因，使不能合成尿嘧啶的宿主菌获得合成尿嘧啶的能力为例进行表达，具体实施过程如下：
实施例1：酵母新型表达载体的构建
1、潮霉素b抗性基因表达框的构建
以质粒yep-ch为模板，利用引物sali-pj-tef1-f（5’-catttccccgaaaagtgccacctgacgtcgacatggaggcccagaatacc-3’）和pj-tef1-ncoi-r（5’-ctttagcggcttaactgtgccctccatggcagtatagcgaccagcattcac-3’）扩增1500bp左右的带有sali和ncoi酶切位点的潮霉素b基因表达框sali-tef1p-hygb-tef1t-ncoi，pcr扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性45s，52℃退火15s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃终延伸5min。
2、含有潮霉素b抗性基因的质粒yep-hygb构建
利用sali和ncoi酶切质粒yeplac195和潮霉素b基因表达框sali-tef1p-hygb-tef1t-ncoi，然后连接，转化大肠杆菌dh5α，挑选转化子提取质粒，利用引物hygb-f（5’-atgcctgaactcaccgcg-3’）和pj-tef1-ncoi-r（5’-ctttagcggcttaactgtgccctccatggcagtatagcgaccagcattcac-3’）进行菌落pcr验证，pcr扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性45s，56℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环，72℃终延伸5min。扩增到1300bp左右的条带，（如图1所示），说明潮霉素b表达框成功连接到yeplac195上，获得含有潮霉素b基因表达框的重组质粒yep-hygb。
3、尿嘧啶基因表达框中各元件的扩增
（1）rdna启动子扩增：以酿酒酵母by4741的基因组dna为模板，利用引物saci-rdnap-f（5’-catttccccgaaaagtgccacctgacgtcgacatggaggcccagaatacc-3’）和rdnap-ires-r（5’-ctttagcggcttaactgtgccctccatggcagtatagcgaccagcattcac-3’）进行pcr扩增获得600bp左右的带有ires元件同源臂的rdna启动子片段，pcr扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性45s，52℃退火15s，72℃延伸40s，30个循环，72℃终延伸5min。
（2）ires片段扩增：通过ncbi（nationalcenterforbiotechnologyinformation）genome中查阅crpv基因间隔区（igr）ires的序列，ires序列通过全基因合成的方式获得，然后以含有ires序列的质粒puc57-ires为模板，利用引物rdnap-ires-f（5’-gaaagcagttgaagacaagttcgaaaagagaaagcaaaaatgtgatcttgc-3’）和asci-ires-r（5’-ttggcgcgccttgaaatgtagcaggtaaatttc-3’）进行pcr扩增得到250bp左右的带有rdna启动子元件同源臂的ires元件片段，pcr扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性45s，52℃退火15s，72℃延伸20s，30个循环，72℃终延伸5min。
（3）rdna启动子片段与ires片段融合扩增：分别以带有ires元件同源臂的rdna启动子片段和带有rdna启动子元件同源臂的ires元件片段为模板，利用引物saci-rdnap-f和asci-ires-r，融合扩增850bp左右的带有saci和asci酶切位点的saci-rdnap-ires-asci片段，pcr扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性45s，52℃退火15s，72℃延伸50s，30个循环，72℃终延伸5min。。
（4）尿嘧啶基因开放阅读表达框的扩增：尿嘧啶序列如以质粒pjfe3质粒为模板，利用引物asci-ura3-f（5’-ttggcgcgccatgtcgaaagctacatataag-3’）和ura3-xhoi-r（5’-ccgctcgagttagttttgctggccgc-3’）进行pcr扩增，得到850bp左右的尿嘧啶基因开放阅读框，扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性45s，52℃退火15s，72℃延伸50s，30个循环，72℃终延伸5min。
（5）poly(t)序列的获得：由于很难通过pcr的方式获得poly(t)序列，本发明利用人工合成的方式构建在质粒puc57-poly(t)上，然后利用xhoi和xbai双酶切，获得含有酶切位点poly(t)。
（6）rdna终止子片段的扩增：以酿酒酵母by4741的基因组dna为模板，利用引物rdnat-xbai-f（5’-ctagtctagatttttatttctttctaagtgggtac-3’）和rdnat-hindiii-r（5’-gatgctagcttgtgaaagcccttctctttc-3’）进行pcr扩增，得到300bp左右的含有xbai和hindiii酶切位点的rdna终止子的片段，扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性45s，50℃退火15s，72℃延伸25s，30个循环，72℃终延伸5min。
4、新型表达载体yep-hygb-riutr的构建
将重组质粒yep-hygb和外源基因表达框中各元件分别用相应的限制性内切酶酶切，然后进行连接，转化大肠杆菌，然后进行相应的验证，经过4次连接，转化大肠杆菌dh5α，挑选转化子提取质粒，利用最后转化子利用引物asci-ura3-f和rdnat-hindiii-r进行pcr验证（如图2所示），pcr扩增条件为94℃预变性10min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃终延伸10min。pcr扩增出1300bp左右的条带，说明ura3开放阅读框、poly(t)和rdna终止子成功连接到yep-hygb上，最终获得新型表达载体的重组质粒yep-hygb-riutr，该表达载体含有潮霉素b抗性基因的表达框和尿嘧啶基因的表达框，其中尿嘧啶基因在rdna启动子和终止子的控制下，通过添加ires序列及poly(t)序列实现尿嘧啶基因的转录及翻译。
实施例2：新型酿酒酵母表达体系的构建
将新型表达载体yep-hygb-riutr转化酿酒酵母by4741，所使用的转化方法为peg-liac介导的酿酒酵母转化方法，利用含有200mg/l潮霉素b的ypd平板筛选转化子，挑选转化子，从酵母中反提质粒，然后利用引物saci-rdnap-f和ura3-xhoi-r进行pcr扩增，pcr扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性45s，52℃退火15s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃终延伸5min。pcr扩增出大约1400bp左右的条带，说明信息表达载体成功转化到酿酒酵母中。
实施例3：新型表达体系的功能测试
挑取平板划线分离的对照菌株（即不含有ura3基因表达框的空质粒yep-hygb）和实验菌株即表达有尿嘧啶基因（含有质粒yep-hygb-riutr）的酿酒酵母单菌落接种到ypd中，30℃中振荡活化培养两次，过夜培养，取对数生长期后期的菌体，离心收集并用无菌水清洗菌体三次后悬浮于1ml无菌水中，置于30℃培养箱中温育9h消耗内源性营养物质以便制备休止细胞。调节菌体休止细胞浓度使其悬液od600为1左右，10倍梯度稀释三个梯度（100，10-1，10-2，10-3），取4μl点滴于含有或不含有尿嘧啶的合成培养基平板，于30℃中培养3~5天观察菌落生长情况，拍照保存结果，图4结果所示，对照菌株和实验菌株在含有尿嘧啶的合成培养基上生长良好，对照由于不含有尿嘧啶基因表达框，无法合成尿嘧啶，在含有尿嘧啶的合成培养基上无法生长，而利用新型表达载体表达尿嘧啶基因的实验菌株则能在含有尿嘧啶的合成培养基上较好地生长，说明在rna聚合酶i作用下，尿嘧啶基因在rdna启动子和终止子的控制下，实现了尿嘧啶基因的转录，并在蟋蟀麻痹病毒基因间隔区ires序列和poly(t)的作用下，成功翻译出尿嘧啶，所以最终能在不含有尿嘧啶的培养基上生长。
序列表
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山东圣琪生物有限公司
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