本发明属于农业微生物
技术领域：
，具体涉及一种降解烟碱、腐解烟杆烟末、腐熟鸡粪猪粪为有机肥的菌株及方法。
背景技术：
：烟草种植区因烟叶收割后，在烟田留下大量烟杆，我国烟杆的年产量约有280—300万吨，接近烟叶的产量。烟末是卷烟加工后的的废弃物，我国年产量达60万吨，烟末堆积如山，若有风起，直接污染空气。烟杆与烟末均有体积大，占地面积宽，价值不高，烟碱含量高的特点。如果烟杆烟末的处理方法不当，比如，采用焚烧法，会极大地增加空气污染，这与建设美丽乡村方针路线相违背。烟杆烟末具有丰富的有机质，最好资源化处理方法是将它们降解为有机肥，实现循环生产。然而，烟杆烟末的腐解面临较大难题。一是烟杆质地紧密，木质纤维层厚，粉碎难度大，成本高。二是烟杆烟末烟碱含量高，平均含量约在1.5—2.0％，有的烤烟品种烟碱含量高达3.5—4.5％，因烟碱含量高，其有机肥的施用作物品种范围和土地面积受到严重限制。烟碱不但对高等动物有害，对低等动物也有害，因此也是农业杀虫剂的主要成分。烟碱杀虫剂具有优良的内吸性和高效、低毒、杀虫谱广、持效期长等特点，但对许多作物的根系延伸有抑制作用。三是烟杆烟末氮素不足，单一原料的腐熟降解达不到有机肥氮素的要求。正因为这些问题，烟杆存在被焚烧的风险。高烟碱有机肥被不当施用，烟碱在田间持续积累，对当年种植以及后续种植作物会造成长效的不利影响，轻则减产，严重时造成大面积颗粒无收，严重破坏土壤，影响土地可持续发展。关于烟杆烟末的研究，目前仍然处于起步阶段，主要停留在单一烟碱降解菌的筛选与培养条件的优化，或者单一烟杆腐解方面的研究。市售的秸秆腐熟发酵剂，均缺乏对烟碱降解系统的研究，缺乏综合治理烟杆烟末的有效方法。有些发酵剂能降解秸秆纤维，但烟碱耐受性不够，影响其生长繁殖甚至被抑制。有些烟碱降解菌不能耐受60—80℃高温发酵，对秸秆的腐解效果、畜禽废弃物的无害化处理不是很理想。技术实现要素：本发明旨在克服现有技术的不足，本提供一种降解烟碱、腐解烟杆烟末、腐熟鸡粪猪粪为有机肥的菌株及方法。该方法能够充分腐解烟杆烟末、腐熟鸡粪猪粪、降解烟碱，获得肥效达标，烟碱含量低，且对土壤、作物无危害的有机肥，实现将烤烟废弃物、畜禽废弃物等变废为宝的目的。实现农牧业污染源资源化、无害化利用。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：所述降解烟碱、腐解烟杆烟末、腐熟鸡粪猪粪为有机肥的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.13343，命名为枯草芽孢杆菌z03菌株。其中，所述菌株耐烟碱、降解烟碱、腐解烟杆烟末、腐熟鸡粪猪粪。所述菌株适合生长温度为37℃—45℃，耐受温度为65℃—78℃。所述菌株在烟碱质量百分比浓度为3.0—4.0％的培养基中能正常生长繁殖，每ml发酵液活菌数达200亿个以上；在烟碱质量百分比浓度为6.0—8.0％的培养基中能较好生长，每ml发酵液活菌数达10—40亿个；在烟碱质量百分比浓度10.0％以上的培养基中，生长受到抑制，每ml发酵液活菌数不足1.0亿个。所述菌株在烟碱质量百分比浓度为3.0—4.0％的液体培养基中，摇床转速200r/m，37℃发酵4天烟碱残留量低于0.1％；在烟碱质量百分比浓度为2.0—2.5％的固体培养基中，37℃发酵3天烟碱残留量低于0.09％。利用上述菌株制备液体发酵菌剂的方法包括如下步骤：(1)摇瓶种子的制备：将所述菌株试管斜面分别接种多瓶装有种子培养基的容器中，种子培养基配方为：酵母膏0.25—0.35％，优选为0.3％，黄豆粕0.25—0.35％，优选为0.3％，葡萄糖1.5—2.5％，优选为2％，ph7.0，水200—300ml，优选为250ml；于37℃，200r/m条件下发酵13—15h，得种子液，菌数达100—200亿个/ml；所述发酵培养基配方中的百分比均为该组分在发酵培养基中所占的质量百分比；(2)二级液体种子的制备：将种子液接种至发酵罐的种子培养基中，所述种子液与发酵罐的体积比为(2—3):100，优选为2.5:100，发酵罐中种子培养基同步骤(1)中所述种子培养基，于37℃，100r/m发酵10—12h，得二级种子液，菌数达100—150亿个/ml；。(3)液体发酵剂的制备：将二级种子液接种至发酵罐的发酵培养基中，二级种子液与发酵罐的体积比为1:20，发酵培养基配方为：酵母膏0.25—0.35％，优选为0.3％，黄豆粕0.25—0.35％，优选为0.3％，葡萄糖1.5—2.5％，gp330消泡剂0.02—0.04％，ph7.0，水1500l；于体积比为1:1的发酵通气量、40℃、60r/m条件下发酵24h，即得液体发酵菌剂，液体发酵菌剂中活菌数为200—300亿个/ml；所述发酵培养基配方中的百分比均为该组分在发酵培养基中所占的质量百分比。利用上述菌株制备固体发酵菌剂的方法包括如下步骤：(1)摇瓶种子的制备：将所述菌株试管斜面分别接种多瓶装有种子培养基的容器中，种子培养基配方为：酵母膏0.25—0.35％，优选为0.3％，黄豆粕0.25—0.35％，优选为0.3％，葡萄糖1.5—2.5％，ph7.0，水200—300ml，优选为250ml；于37℃，200r/m条件下发酵13—15h，得种子液，菌数达100—200亿个/ml；所述发酵培养基配方中的百分比均为该组分在发酵培养基中所占的质量百分比；(2)二级固体种子的制备：将种子液接种至固体培养基中，所述种子液与固体培养基的质量比为1:(45—55)，优选为1:50，所述固体培养基配方为：麸皮40％，黄豆粕10％，水50—60％，ph自然；于37℃发酵36—48h，气流干燥至含水量为6—8％，菌数大于150亿个/g，即得固体发酵菌剂。上述菌株可用于制备有机肥或土壤调理剂。所述降解烟碱、腐解烟杆烟末、腐熟鸡粪猪粪为有机肥的方法是将初步粉碎的烟杆、烟末、鸡粪、猪粪混合，并调节含水量为50—60％，然后喷洒上述液体发酵菌剂，每1t混合物喷洒1—2kg液体发酵菌剂；或者接种上述固体发酵菌剂，每1t混合物接种1—2kg固体发酵菌剂；进行堆肥处理，控制堆肥发酵温度、发酵时间、翻堆次数，使堆肥含水量低于30％，得色泽发黑，无臭的有机肥；有机肥中：有机质含量≥45％，总养分≥5％，含水量≤30％，ph5.5—8.5，虫卵死亡率≥98％，粪大肠杆菌群数≤50个/g；每kg干物质中，砷as≤30，汞hg≤30，铅pb≤100，镉cd≤3，铬cr≤300；烟碱含量小于0.1％。下面对本发明作进一步说明：本发明提供了一种耐烟碱、降解烟碱、农牧业秸秆腐解、粪便高温快速发酵的菌株。从湖南农业大学耘园烟草种植园，人工高温渥堆的烟杆烟末、鸡粪猪粪堆中分离所得到120多株单菌落，再经高温发酵复筛、高烟碱降解复筛获得，菌株z03经形态鉴定和分子测序鉴定为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌z03已于2016年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：cgmccno.13343。本发明中，将初步粉碎的烟杆、烟末、鸡粪、猪粪按不同配比混合，调节含水量至50—60％，同时喷洒接种枯草芽孢杆菌z03发酵剂(液体或固体发酵剂均可，每kg发酵剂活菌数大于100亿个)，接种量为1t混合物料接种z03液体发酵剂1.5kg；或者混合接种枯草芽孢杆菌z03固体发酵剂，接种量为1t混合物料接种z03固体发酵剂1.5kg，将菌剂z03与物料混合均匀，制成有机肥发酵基料，将基料堆置成垄型，主要利用耐热芽孢杆菌z03与基料中少量原有的微生物生料发酵生产有机肥。发酵基料垄堆宽2.0—2.5米，高0.6—0.8米，长度大于15米。堆肥前2—3天，地膜覆盖发酵基料，保温保湿，加速升温，待堆心温度达43℃以上时，去掉地膜；堆心温度达52℃以上时开始翻堆(铲车或人工翻堆均可)，3天翻堆1次，堆温60℃以上维持8天以上。夏天，只需14—17天完成发酵基料的快速腐熟；冬天，只需20—25天完成发酵基料的快速腐熟，烟碱大大降低，同时烟碱烟末充分腐解、鸡粪猪粪充分腐熟，发酵周期比自然堆肥发酵方法大大缩短。堆肥品质控制如下：控制堆肥发酵温度，发酵时间，翻堆次数，使堆肥含水量低于30％，色泽发黑，无臭；其基本特征除包含有机肥感官及理化指标均符合有机肥料新标准ny525—2011外，即，有机质含量≥45％，总养分≥5％，含水量≤30％，ph5.5～8.5，虫卵死亡率≥98％，粪大肠杆菌群数≤50个/g；每千克干物质中，砷as≤30，汞hg≤30，铅pb≤100，镉cd≤3，铬cr≤300；本发明还特定地限制了有机肥中烟碱含量，烟碱含量每公斤小于0.1％。与现有技术相比，本发明在快速降解烟杆烟末中的烟碱、腐熟鸡粪猪粪、腐解烟杆木质纤维方面，具有显著优势和技术进步：一是高效降解烟碱，发酵剂组分简化、发酵效果快速，便于实际操作。实施例11表1的实验结果可以看出，本发明的z03为单一发酵剂，发酵总时间最短(22天)，烟碱含量最低(低于0.1％)，降低了时间成本。其他发酵剂，因烟杆烟末的烟碱含量过高，抑制了发酵剂的生长繁殖，从而延长了发酵时间(比预期延长5—7天)，因而增加了生产时间成本。二是发酵产品不仅达有机肥要求，而且特别适用烤烟烟杆、烟末等废弃物的资源化、无害化利用，明显优于市售秸秆发酵剂。实施例12表2的实验结果可以看出，本发明生产的有机肥产品不仅适用烟田，而且烟碱充分降解，也可以使用其他作物的发芽、种植生产，制备出的调理剂产品使用在改善土壤结构，防治土壤结块退化，增强土壤保水、通气，促进土壤微生物活动方面的效果显著。具体实施方式实施例1，枯草芽孢杆菌z03的获得从湖南农业大学耘园烤烟基地人为高温渥堆的烟杆、烟末、鸡粪、猪粪若干堆肥中取样中分离所得耐高温、耐烟碱芽孢杆菌，获得单菌落120多株，其中菌株z03，经形态鉴定和分子测序鉴定，菌株z03为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。枯草芽孢杆菌z03已于2016年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：cgmccno.13343。实施例2，枯草芽孢杆菌z03生长及产芽孢特性测定配制液体培养基100ml若干(250ml三角瓶)，培养基配方为酵母膏0.5％，葡萄糖2.0％，ph7.0，121℃条件下灭菌25min。将菌株z03试管斜面，发别接种液体培养基中，在30℃，35℃，37℃，39℃，42℃，45℃，48℃，52℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃摇床或震荡水浴锅中培养，测定活菌数和芽孢数。z03菌株适合生长温度为37℃—45℃，活菌数每毫升达200亿个以上，芽孢数每毫升达20亿以上；耐受温度为65℃—78℃。实施例3，枯草芽孢杆菌z03液体摇瓶种子的制备摇瓶种子的制备，将菌株z03试管斜面每次接种一环分别至10瓶500ml三角瓶中，培养基配方为酵母膏0.3％，黄豆粕0.3％，葡萄糖2.0％，ph7.0，自来水250ml，121℃灭菌25min；37℃，200r/m发酵13—15小时即可，菌数达100—200亿个/ml，制成摇瓶种子。实施例4，枯草芽孢杆菌z03二级种子的制备二级种子的制备，将菌株z03摇瓶级种子10瓶共计2500ml接种至100l发酵罐，培养基配方同摇瓶种子配方，37℃，100r/m发酵10—12小时即可，菌数达100—150亿个/ml，制成二级种子。实施例5，枯草芽孢杆菌z03生产种子的制备枯草芽孢杆菌z03(生产种子)发酵剂的制备，将二级种子按体积比1:20(v/v)的无菌操作管道移种至2000l发酵罐中，培养基配方为酵母膏0.3％，黄豆粕0.3％，葡萄糖2.0％，gp330消泡剂0.03％，ph7.0，自来水1500l，121℃灭菌30min；通气量(1:1，v/v)，40℃，60r/m发酵24小时即可，活菌数为200—300亿个/ml，芽孢数每毫升达20—50亿以上。即可作为烟杆、烟末、鸡粪、猪粪堆肥发酵液体发酵菌剂。实施例6，枯草芽孢杆菌z03固体发酵菌剂的制备二级固体种子的制备，将菌株z03摇瓶种子，按质量比1:50(w/w)无菌操作接种至200盘40cm×60cm×5cm不锈钢浅盘中，每盘培养基4kg(湿料)；培养基配方为麸皮40％，黄豆粕10％，水50％，ph自然，124℃灭菌40min；37℃，发酵36—48小时即可，气流干燥至含水量6％—8％，活菌数大于150亿个/g(干重)，即可作为烟杆烟末—鸡粪猪粪堆肥固体发酵菌剂。实施例7，枯草芽孢杆菌z03固体发酵菌剂的耐热性试验将活菌数为150亿个/g的枯草芽孢杆菌z03固体发酵菌剂100g，于80℃的恒温箱处理24小时，测定处理前后活菌数。结果表明，z03固体发酵菌剂在80℃的恒温箱处理24小时后，活菌数仍然达115—120亿个/g，存活率达75％以上，说明发酵菌剂耐高温，有利于进行高温堆肥发酵。实施例8，枯草芽孢杆菌z03耐烟碱性能试验配制100ml培养基若干，培养基配方为酵母膏1.0％，葡萄糖4.0％，烟碱0—10.0％不等，ph自然，121灭菌20min，接种枯草芽孢杆菌z03，37℃，200r/m发酵24小时，测定活菌数。烟碱浓度为0时，活菌数每毫升达200—300亿个；烟碱浓度3.0％—4.0％时，每毫升发酵液活菌数可以达150—200亿个以上，生长几乎不受影响；烟碱浓度6.0％—8.0％的培养基中还能较好生长，每毫升发酵液活菌数可以达10—40亿个；烟碱浓度10.0％以上的培养基中，菌株生长受到抑制，每毫升发酵液活菌数不足1.0亿个，生长受到抑制；说明菌株z03耐烟碱性能很好。实施例9，枯草芽孢杆菌z03堆肥烟杆、烟末、鸡粪便进行有机肥生产实验按干物质质量比，烟杆、烟末、鸡粪的比例为1:1:1的配方混合堆肥物料，含水量50％—60％，每吨堆肥物料混合物接种1.5公斤枯草芽孢杆菌z03固体发酵剂，发酵菌剂活菌数大于150亿个/g；然后再将基料垄式堆放，发酵基料每垄宽2.5米，高0.8米，长20米，基料堆用地膜覆盖，开始堆肥发酵。期间，用插杆长度大于1米插杆式温度计测定堆心温度，每天测定一次，发酵2天堆温达43℃，取掉地膜，并用铲车翻堆；发酵4天堆温达52℃；之后持续升温至60℃以上，最高达70℃，持续时间达8天以上，水分在发酵及翻堆过程中不断挥发。发酵15天后温度开始下降，经过多次翻堆，20天时，水分低于30％，发酵基料发黑，臭气显著降低，无明显烤烟味，发酵基本完成，达有机肥标准。发酵终了时，每公斤有机肥烟碱含量为0.85克，每公斤物料烟碱的含量远远低于发酵初期的16克。实施例10，枯草芽孢杆菌z03堆肥烟杆、烟末、蘑菇渣、猪粪便进行有机肥生产实验按干物质质量比，烟杆、烟末、蘑菇渣、猪粪的比例为1:1:1:1的配方混合堆肥物料，含水量50％—60％，每吨堆肥物料混合物接种1.5公斤枯草芽孢杆菌z03液体发酵剂，发酵菌剂活菌数大于200亿个/g；然后再将基料垄式堆放，发酵基料每垄宽2.5米，高0.9米，长25米，基料堆用地膜覆盖，开始堆肥发酵。期间，用插杆长度大于1米插杆式温度计测定堆心温度，每天测定一次，发酵2天堆温达45℃，取掉地膜，并用铲车翻堆；发酵4天堆温达55℃；之后持续升温至60℃以上，最高达68℃，持续时间达8天以上，水分在发酵及翻堆过程中不断挥发。发酵14天后温度开始下降，经过多次翻堆，20天时，水分低于30％，发酵基料发黑，臭气显著降低，发酵基本完成，达有机肥标准。发酵终了时，每公斤有机肥烟碱含量为0.67克，每公斤物料烟碱的含量远远低于发酵初期的12克。实施例11，枯草芽孢杆菌z03与市售堆肥发酵剂对比生产实验(见表1)按干物质质量比，烟杆、烟末、鸡粪的比例为1:1:1的配方混合堆肥物料，含水量50％—60％的堆肥若干垄，每垄分别接种不同发酵剂，每吨堆肥物料混合物接种量为1.5公斤。发酵基料每垄宽2.5米，高0.8米，长2.5米，基料堆用地膜覆盖，开始堆肥发酵。期间，用插杆长度大于1米插杆式温度计测定堆心温度，每天测定一次，记录发酵工程数据，发酵结束时，检测有机肥产品中烟碱含量。结果见表1。从表1可以看出，除对照组外，实验组在实验周期内发酵烟杆、烟末、鸡粪堆肥均达有机肥标准。烟碱的降解程度，以枯草芽孢杆菌z03最优，降解率94.4％；市售发酵剂b其次，自然发酵的烟碱降解率仅为48.8％。从发酵高温持续时间和充分腐熟时间来看，以枯草芽孢杆菌z03最优，其他发酵菌剂由于堆肥中烟碱影响其生长繁殖，比预计的发酵时间延长了5—8天。可见枯草芽孢杆菌z03适合烟杆烟末专用发酵剂。表1.不同发酵剂对烟杆、烟末、鸡粪堆肥发酵的影响实施例12，堆肥过程中堆料对大白菜发芽指数的影响(见表2)以蒸馏水为对照，分别对烟末1.0％，以及菌株z03处理堆肥不同时间点的物料(烟杆、烟末、鸡粪干物质质量比1:1:1)进行山东大白菜种子发芽指数的跟踪检测，gi(％)＝(堆肥浸提液的种子发芽率×种子跟长)/(蒸馏水的种子发芽率×种子跟长)×100，结果见表2。未处理的烟末对大白菜发芽率有显著抑制作用，影响根系生长。堆肥发酵初期，堆肥腐熟为充分，烟碱降解不彻底，严重影响种子发芽。可见，以烟杆烟末为有机质发酵生产的有机肥，烟碱含量的高低是评价该有机肥的重要指标，尽管有机肥标准ny525—2011中没有限定这一指标，但在生产实际应用中，必须加以考虑，否则会影响作物产量，破坏土壤理化特性。表2.堆肥物料及其烟碱对大白菜发芽指数的影响发芽指数(gi)a5天10天15天20天蒸馏水(对照)100％100％100％100％烟末1.0％18.1％18.5％20.6％23.8％堆肥物料1.0％21.2％75.6％94.4％98.5％a注：如果，gi>50％，则可认为基本腐熟，当gi达到80％—85％时,这种堆肥就可以认为已经完全腐熟，对植物没有毒性。当前第1页12