本发明涉及一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶及其制备方法，属于固定化酶技术领域。
背景技术：
酶作为生物催化剂，具有催化效率高、底物专一性强、反应条件温和、催化活性调节方便等优点，已经广泛应用于化学合成、制药科学、食品加工和传感器技术等领域。然而，游离酶价格昂贵、稳定性差、难于分离回收再利用，这些固有的缺陷限制了其应用。为了解决上述问题，固定化技术被提出并得到快速发展。
目前，酶的固定化方法主要有吸附法、共价结合法、交联法、包埋法等。这四种固定化方法各有千秋，一般根据选用的载体性质和酶结构特点选择适宜的固定方法。此外，载体的选择对固定化酶的性能也尤为重要，载体与酶的相互作用对酶的稳定性和动力学有明显的影响。在各类载体中，纳米结构材料由于具有比表面积大、表面反应活性高、机械强度好等优点而受到越来越多的关注。各种纳米材料如纳米纤维、碳纳米管、纤维素纳米晶体和纳米粒子等已经被用于酶的固定化研究。但是，纳米材料仍然存在一些缺陷，比如一些纳米材料生物相容性低，易导致表面结合酶快速变性、活性急剧降低。因此，通过表面修饰技术在载体表面引入亲水性物质增加载体的生物相容性是必须的。
两性离子聚合物同时含有阴、阳离子基团，能够结合大量水分子，形成水化层。这种基于静电相互作用的水化层赋予两性离子材料良好的生物相容性和抗非特异性蛋白吸附性能。而且两性离子聚合物已经被证明能够维持蛋白质的三维空间结构、保持蛋白质的生物活性和稳定性。虽然一些研究者已经探索了两性离子化合物对酶活性和稳定性的影响，但是鲜少有涉及在两性离子聚合物接枝的纳米材料上共价固定酶的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决现有固定化酶所用载体材料生物相容性差、制备过程复杂等问题提供一种以两性离子聚合物接枝纳米介质作为固定化载体在制备固定化酶中的应用。本发明的目的还在于提供一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法。本发明制备方法简单、反应条件温和，易于操作，并以性能优良的两性离子聚合物为修饰剂，有利于获得高活性和稳定性的固定化酶。
本发明的技术方案概述如下：
一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶；其结构式如下：
本发明的以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法，其特征是步骤如下：
1)两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法：将聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)(mao)与n,n-二甲基乙二胺(dmea)的开环反应产物p(mao-dmea)接枝到二氧化硅纳米粒子表面，得到两性离子聚合物接枝纳米介质snps-p(mao-dmea)；
2)以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法：以snps-p(mao-dmea)为载体，通过表面羧基的活化，将酶与载体共价结合，制得以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶。
本发明所述两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法，其特征是步骤如下：
1)以四氢呋喃为溶剂，以聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)和n，n-二甲基乙二胺为原料，通过二者的开环反应合成两性离子聚合物p(mao-dmea)；
2)利用氨丙基三乙氧基硅烷处理平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子snps-nh2；将p(mao-dmea)溶解在氯仿溶液中，配成浓度为17.5-75mg/ml的溶液，加入二环己基碳二亚胺(dcc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，dcc和nhs的浓度分别为12.5-53mg/ml和7.02-29.6mg/ml，对p(mao-dmea)表面羧基进行活化，然后加入上述氨基化的二氧化硅纳米粒子snps-nh2，置于20-30℃的恒温水浴摇床中振荡，反应结束后离心分离并依次用dmf、乙醇、去离子水清洗，得到两性离子聚合物接枝纳米介质snps-p(mao-dmea)；结构式如下：
所述p(mao-dmea)与纳米粒子的质量比为0.71～2.88:1。
上述步骤2)中所述的活化时间为1-2h。
上述步骤2)中所述的水浴摇床振荡是以120-200rpm震荡12-20h。
上述步骤2)中所述的离心速率是8000-10000rpm。
本发明的以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法，其步骤如下
1)将两性离子聚合物接枝纳米介质加入到mes缓冲液中，配成浓度为22-29mg/ml的悬浮液；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，使得悬浮液中edc和nhs的浓度分别为40-60mg/ml和12-18mg/ml，室温下振荡反应，活化后离心弃上清并用磷酸缓冲液对活化的纳米介质进行清洗以除去未反应的edc、nhs及副产物，得到活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质；
2)将目标酶溶解于磷酸缓冲液中，高速冷冻离心收集上层酶溶液，除去不溶物，得到目标酶溶液；
3)将步骤1)中活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质加入到磷酸缓冲液中，再与目标酶溶液混合，使悬浮液中目标酶蛋白的浓度为0.09-0.89mg/ml，然后置于4-10℃恒温空气浴摇床中振荡反应，使目标酶固定在两性离子聚合物改性载体上，反应结束后洗涤、8000-9000rpm冷冻离心，得到以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶。
上述步骤1)中室温下振荡反应30-60min；离心速率为8000-9000rpm。
上述步骤3)中空气浴摇床中振荡条件为：速率是100-170rpm下反应10-20h。
本发明的目标酶包括皱褶假丝酵母脂肪酶、柱状假丝酵母脂肪酶等。
本发明利用纳米介质表面接枝两性离子聚合物，实现酶分子的三维空间固定，具有以下优点和有益效果：
1)纳米介质表面接枝的两性离子聚合物为酶的固定提供大量官能基团的同时也营造了一个生物相容性好的环境，有利于降低表面结合酶的活性损失、提高酶的稳定性；
2)与聚阳离子或聚阴离子化合物修饰的载体材料相比，本发明所述的两性离子聚合物接枝的纳米介质表面同时含有阴、阳离子基团，整体呈电中性，对酶蛋白的作用力小，有利于维持酶分子构象的稳定，增加酶的催化活性；
3)本发明所述的两性离子聚合物p(mao-dmea)不仅含有亲水性基团，还带有一疏水侧链，其可以与酶蛋白的疏水表面结合，改善酶蛋白表面的水化程度，提高酶分子的稳定性；
4)本发明以两性离子聚合物接枝纳米介质作为固定化酶载体，采用碳二亚胺法活化载体，通过共价键的形式将酶连结到载体表面，酶与载体结合牢固，不易脱落，催化效果持久；
5)本发明所述固定化酶的制备过程反应条件温和，工艺简单，成本低廉，所得固定化酶催化活性高、对底物的亲和力强，稳定性和反复使用性好。
附图说明
图1为不同温度下固定化酶对游离酶的相对比活(rsa)。
图2为固定化酶与游离酶的ph稳定性图。
图3为以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化crl酶的重复使用性。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明提供的方法予以进一步的说明，但此处所描述的具体实施例是仅用于解释、而不以任何方式限制本发明。
本发明将聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)(mao)与n,n-二甲基乙二胺(dmea)的开环反应产物p(mao-dmea)接枝到二氧化硅纳米粒子表面，得到两性离子聚合物接枝纳米介质snps-p(mao-dmea)；并以snps-p(mao-dmea)为载体，通过表面羧基的活化，将酶与载体共价结合，制得以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶。
上述p(mao-dmea)的结构式如下：
上述snps-p(mao-dmea)的结构式如下：
上述以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的反应式如下：
本发明的两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法，其步骤如下：
1)以四氢呋喃为溶剂，以聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)和n，n-二甲基乙二胺为原料，通过二者的开环反应合成两性离子聚合物p(mao-dmea)；
2)利用氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)处理平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子(snps)，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子snps-nh2；将p(mao-dmea)溶解在氯仿溶液中，配成浓度为17.5-75mg/ml的溶液，加入二环己基碳二亚胺(dcc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，dcc和nhs的浓度分别为12.5-53mg/ml和7.02-29.6mg/ml，对p(mao-dmea)表面羧基进行活化1-2h，然后加入上述氨基化的二氧化硅纳米粒子snps-nh2，置于20-30℃的恒温水浴摇床中，120-200rpm振荡12-20h，反应结束后8000-10000rpm离心分离并依次用dmf、乙醇、去离子水清洗，得到两性离子聚合物接枝纳米介质snps-p(mao-dmea)。
所述步骤1)中，p(mao-dmea)的合成方法见文献(venaulta,huangwy,shengwh,etal.zwitterionicmodificationsforenhancingthegeneralantifoulingpropertiesofpolyvinylidenefluoridemembranes[j].langmuirtheacsjournalofsurfaces&colloids,2016,32(16):4113.)
所述步骤2)中，p(mao-dmea)与纳米粒子的质量比为0.71:1-2.88:1。
本发明的以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法，其步骤如下
1)将两性离子聚合物接枝纳米介质加入到mes缓冲液(50mm，ph5.5)中，配成浓度为22-29mg/ml的悬浮液；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，使得悬浮液中edc和nhs的浓度分别为40-60mg/ml和12-18mg/ml，室温下振荡反应30-60min，活化后8000-9000rpm离心弃上清并用磷酸缓冲液(50mm、ph7.4)对活化的纳米介质进行清洗以除去未反应的edc、nhs及副产物，得到活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质。
2)将目标酶溶解于磷酸缓冲液(50mm，ph7.4)中，高速冷冻离心收集上层酶溶液，除去不溶物，得到目标酶溶液。
3)将步骤1)中活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质加入到磷酸缓冲液(50mm，ph7.4)中，再与目标酶溶液混合，使悬浮液中目标酶蛋白的浓度为0.09-0.89mg/ml，然后置于4-10℃恒温空气浴摇床中100-170rpm振荡反应10-20h，使目标酶固定在两性离子聚合物改性载体上，反应结束后洗涤、8000-9000rpm冷冻离心，得到以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶。
所述步骤2)中，目标酶包括但不限于皱褶假丝酵母脂肪酶、柱状假丝酵母脂肪酶等。
实施例1：
本实施例中的两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法如下：
1)以四氢呋喃为溶剂，以聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)和n，n-二甲基乙二胺为原料，通过二者的开环反应合成两性离子聚合物p(mao-dmea)(venaulta,huangwy,shengwh,etal.zwitterionicmodificationsforenhancingthegeneralantifoulingpropertiesofpolyvinylidenefluoridemembranes[j].langmuirtheacsjournalofsurfaces&colloids,2016,32(16):4113.)
2)利用氨丙基三乙氧基硅烷处理平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子snps-nh2；将0.35gp(mao-dmea)溶解在20ml氯仿溶液中，配成浓度为17.5mg/ml的溶液，加入12.5mg/ml二环己基碳二亚胺和7.02mg/mln-羟基丁二酰亚胺对p(mao-dmea)表面羧基进行活化1h，然后加入0.49g上述氨基化的二氧化硅纳米粒子snps-nh2(p(mao-dmea)与纳米粒子的质量比为0.71:1)，置于20℃的恒温水浴摇床中，120rpm振荡12h，反应结束后8000rpm离心分离并依次用dmf、乙醇、去离子水清洗，得到聚合物接枝量约为0.15g/gsnps的两性离子聚合物接枝纳米介质snps-p(mao-dmea)。
实施例2：
本实施例中的两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法如下：
1)与实施例1中的步骤1)相同；
2)利用氨丙基三乙氧基硅烷处理平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子snps-nh2；将0.80gp(mao-dmea)溶解在20ml氯仿溶液中，配成浓度为40mg/ml的溶液，加入28.5mg/ml二环己基碳二亚胺和15.9mg/mln-羟基丁二酰亚胺对p(mao-dmea)表面羧基进行活化1.5h，然后加入0.51g上述氨基化的二氧化硅纳米粒子snps-nh2(p(mao-dmea)与纳米粒子的质量比为1.57:1)，置于25℃的恒温水浴摇床中，170rpm振荡15h，反应结束后8500rpm离心分离并依次用dmf、乙醇、去离子水清洗，得到聚合物接枝量约为0.20g/gsnps的两性离子聚合物接枝纳米介质snps-p(mao-dmea)。
实施例3：
本实施例中的两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法如下：
1)与实施例1中的步骤1)相同；
2)利用氨丙基三乙氧基硅烷处理平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子snps-nh2；将1.5gp(mao-dmea)溶解在20ml氯仿溶液中，配成浓度为75mg/ml的溶液，加入53mg/ml二环己基碳二亚胺和29.6mg/mln-羟基丁二酰亚胺对p(mao-dmea)表面羧基进行活化2h，然后加入0.52g上述氨基化的二氧化硅纳米粒子snps-nh2(p(mao-dmea)与纳米粒子的质量比为2.88:1)，置于30℃的恒温水浴摇床中，200rpm振荡20h，反应结束后10000rpm离心分离并依次用dmf、乙醇、去离子水清洗，得到聚合物接枝量约为0.26g/gsnps的两性离子聚合物接枝纳米介质snps-p(mao-dmea)。
下面实施例4-10中以皱褶假丝酵母脂肪酶为例对本发明提供的固定化酶的制备方法予以说明。
实施例4：
本实施例中的以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法如下：
1)将110mg实例2中制备得到的聚合物接枝量约为0.20g/gsnps的两性离子聚合物接枝纳米介质超声分散于5mlmes缓冲液(50mm，ph5.5)中，配成浓度为22mg/ml的悬浮液；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，使得edc和nhs的浓度分别为40mg/ml和12mg/ml，室温下振荡反应30min，活化后8000rpm离心弃上清并用磷酸缓冲液(50mm、ph7.4)对活化的纳米介质进行清洗以除去未反应的edc、nhs及副产物，得到活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质；
2)称取15mg皱褶假丝酵母脂肪酶(crl)粗粉溶解于3ml磷酸缓冲液(50mm，ph7.4)中，高速冷冻离心收集上层酶溶液，除去不溶物，采用bradford方法测定酶液中的蛋白浓度，得到蛋白浓度为0.18mg/ml的脂肪酶溶液；
3)将步骤1)中活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质超声分散于2.5ml磷酸缓冲液(50mm，ph7.4)中，再与2.5ml步骤2)中的脂肪酶溶液混合，使悬浮液中脂肪酶的浓度为0.09mg/ml，然后置于10℃恒温空气浴摇床中，100rpm振荡反应10h，反应结束后用磷酸缓冲液(50mm，ph7.4)洗涤，8000rpm冷冻离心收集，得到固定化脂肪酶。
通过bradford方法测定固定化反应前后反应液中的蛋白浓度，根据物料衡计算得出本实施例中制备的固定化脂肪酶的酶载量为1.43mg/gsnps-p(mao-dmea)。
实施例5：
本实施例中的以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法如下：
1)将125mg实例2中制备得到的聚合物接枝量约为0.20g/gsnps的两性离子聚合物接枝纳米介质snps-p(mao-dmea)超声分散于5mlmes缓冲液(50mm，ph5.5)中，配成浓度为25mg/ml的悬浮液；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，使得edc和nhs的浓度分别为50mg/ml和15mg/ml，室温下振荡反应40min，活化后8500rpm离心弃上清并用磷酸缓冲液(50mm、ph7.4)对活化的纳米介质进行清洗以除去未反应的edc、nhs及副产物，得到活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质。
2)称取30mg皱褶假丝酵母脂肪酶(crl)粗粉溶解于3ml磷酸缓冲液(50mm，ph7.4)中，高速冷冻离心收集上层酶溶液，除去不溶物，采用bradford方法测定酶液中的蛋白浓度，得到蛋白浓度为0.36mg/ml的脂肪酶溶液。
3)将步骤1)中活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质超声分散于2.5ml磷酸缓冲液(50mm，ph7.4)中，再与2.5ml步骤2)中的脂肪酶溶液混合，使悬浮液中脂肪酶的浓度为0.18mg/ml，然后置于4℃恒温空气浴摇床中，120rpm振荡反应12h，反应结束后用磷酸缓冲液(50mm，ph7.4)洗涤，8500rpm冷冻离心收集，得到固定化脂肪酶。
通过bradford方法测定固定化反应前后反应液中的蛋白浓度，根据物料衡计算得出本实施例中制备的固定化脂肪酶的酶载量为2.43mg/gsnps-p(mao-dmea)。
实施例6：
本实施例中的以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法如下：
1)将145mg实例2中制备得到的聚合物接枝量约为0.20g/gsnps的两性离子聚合物接枝纳米介质超声分散于5mlmes缓冲液(50mm，ph5.5)中，配成浓度为29mg/ml的悬浮液；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，使得edc和nhs的浓度分别为60mg/ml和18mg/ml，室温下振荡反应60min，活化后9000rpm离心弃上清并用磷酸缓冲液(50mm、ph7.4)对活化的纳米介质进行清洗以除去未反应的edc、nhs及副产物，得到活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质。
2)称取150mg皱褶假丝酵母脂肪酶(crl)粗粉溶解于3ml磷酸缓冲液(50mm，ph7.4)中，高速冷冻离心收集上层酶溶液，除去不溶物，采用bradford方法测定酶液中的蛋白浓度，得到蛋白浓度为1.78mg/ml的脂肪酶溶液。
3)将步骤1)中活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质超声分散于2.5ml磷酸缓冲液(50mm，ph7.4)中，再与2.5ml步骤2)中的脂肪酶溶液混合，使悬浮液中脂肪酶的浓度为0.89mg/ml，然后置于5℃恒温空气浴摇床中，170rpm振荡反应20h，反应结束后用磷酸缓冲液(50mm，ph7.4)洗涤，9000rpm冷冻离心收集，得到固定化脂肪酶。
通过bradford方法测定固定化反应前后反应液中蛋白浓度，根据物料衡计算得出本实施例中制备的固定化脂肪酶的酶载量为5.28mg/gsnps-p(mao-dmea)。
实施例7：
所用固定化酶为实施例5中制备得到的固定化脂肪酶(snps-crl)，分别通过乙酸对硝基苯酯(p-npa)和棕榈酸对硝基苯酯(p-npp)显色法测定固定化脂肪酶(snps-crl)和游离脂肪酶(crl)的催化活性。固定化酶每克蛋白的单位酶活力与游离酶每克蛋白的单位酶活力的比值定义为相对比活(rsa)。不同温度下固定化酶对游离酶的相对比活(rsa)如图1所示：固定化crl酶(snps-crl)在25-60℃下的催化活性均高于游离脂肪酶，比活约为游离crl的2-4倍，说明本发明实施例5制得的固定化酶具有高的催化活性和耐热能力。
实施例8：
所用固定化酶为实施例5中制备得到的固定化脂肪酶(snps-crl)，测定固定化crl酶(snps-crl)和游离crl酶的动力学常数，结果如表1所示：对于p-npa和p-npp的水解，固定化crl酶的vmax分别是游离crl酶的1.6和3.6倍，km值是游离crl酶的0.59和0.82倍，而且固定化crl酶的转换数(kcat)较大，这些说明在两性离子聚合物接枝纳米介质上固定的酶具有较高的催化效率和对底物的亲和力。
表1游离酶和固定化酶的动力学参数
a下标‘i’和‘f’分别代表固定化酶和游离酶。
实施例9：
将实施例5中制备得到的固定化脂肪酶(snps-crl)与游离酶置于不同ph值(4.0-9.0)的缓冲液中，在室温保温4h后通过乙酸对硝基苯酯(p-npa)显色法测定测定酶的残留活性。结果如图2所示：在ph4-9的范围内，snps-crl都保持较高的活性(74％以上)，而当ph高于6时游离酶随ph的升高稳定性逐渐下降，在ph9.0时，仅有原酶活性的10％。这说明酶固定在本发明的两性离子聚合物接枝纳米介质载体材料上，其ph稳定性大幅度提高。
实施例10:
测定实施例5中制备得到的固定化脂肪酶(snps-crl)的重复使用率，结果如图3所示：将实施例5制得的固定化酶与p-npa溶液组成的混合液在37℃反应10min条件下重复使用9次后，其相对活性仍能保持在50％以上，这说明snps-crl固定化酶具有好的循环使用性能。
综上所述，本发明所述两性离子聚合物接枝二氧化硅纳米介质作为固定化酶载体能有效提高酶的催化活性与稳定性，扩散限制小，其应用范围广泛，是一类具有应用前景的固定化酶载体；所制备的固定化酶催化活性高(比活为游离酶的2-4倍)，对底物的亲和力强，稳定性和反复使用性好。
本发明提出了一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶及其制备方法；在纳米介质表面接枝p(mao-dmea)，制备得到两性离子聚合物接枝纳米介质，并提出了利用该纳米介质作为载体制备固定化酶的方法。已通过现场较佳实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。