本发明涉及一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
乙醇酸(glycolicacid，glycolate)又称羟基乙酸、甘醇酸，是最简单的α-羟基酸。近年来，乙醇酸广泛用于纺织工业、医学工程材料、化学清洗等许多领域，需求量逐年增加。
目前已经报道了很多利用全生物合成进行乙醇酸生产的方法，在微生物中利用乙醛酸循环——过量表达异柠檬酸裂解酶基因acea、乙醛酸还原酶基因ycdw和异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶基因acek，以葡萄糖或木糖为底物实现乙醇酸的积累。但是仅通过调节以上三个关键基因的表达水平，来提高乙醇酸产率的过程中，会导致菌体生长受限及乙酸的大量积累。因此，为解决上述缺陷，提高乙醇酸产率，急需一种更为简单有效的基因工程改造策略。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一种产乙醇酸的基因工程菌，所述基因工程菌过表达柠檬酸合成酶。
在本发明的一种实施方式中，所述柠檬酸合成酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述柠檬酸合成酶的基因含有seqidno.2所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pcdfduet-1为载体，表达所述柠檬酸合成酶。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以真菌或细菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，所述大肠杆菌包括e.colibl21、e.colimg1655、e.colijm109、e.colidh5α、e.colitop10中的至少一种。
本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，所述方法是以pcdfduet-1为载体，与seqidno.2所示的基因连接，转化至e.colimg1655细胞中。
本发明的第三个目的是提供一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，是在大肠杆菌中过量表达seqidno.1所示的柠檬酸合成酶。
本发明的第四个目的是提供一种乙醇酸的生产方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，28～30℃发酵20～50h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基按g/l计，含有：na2hpo46～8，kh2po42～4，nh4cl0.5～1.5，nacl0.5～1，葡萄糖8～1210，mgso40.15～0.3，cacl20.1～0.2。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程在基因工程菌培养至对数中期(od600＝0.6～0.8)，加入0.8～1mmiptg诱导。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程控制发酵液ph为6.8～7.2，通气量1～1.2vvm。
本发明还提供所述基因工程菌或所述方法在制备含乙醇酸的产品方面的应用。
有益效果：本发明提供了柠檬酸合成酶(glta)在提高乙醇酸产率方面的应用。本发明构建的表达该柠檬酸合成酶的基因工程菌mgly145在摇瓶发酵中乙醇酸产量为1.369g/l，产率为0.504g/g-葡萄糖，较基因工程菌mgly14的乙醇酸产率提高了30.9％。分批发酵中与mgly14相比，mgly145的乙醇酸产量提高了8.8％，产率提高了14.6％，而且乙酸积累量减少了67.5％。
附图说明
图1为重组质粒pjnu-5酶切验证图；其中，m，marker；1,hindiii单酶切pjnu-5(5034bp)；2，hindiii和bamhi双酶切pjnu-5(3744bp和1290bp)；
图2为mgly145和mgly14摇瓶发酵结果；
图3为mgly145和mgly14分批发酵结果。
具体实施方式
表1：本发明中所用的菌株与质粒；
实施例1：重组质粒pjnu-5的构建和重组菌株的获得
以大肠杆菌mg1655(de3)基因组为模板进行pcr扩增目的基因glta
(pjnu-5f:ttaggatccaaggagatataatggctgatacaaaagcaaa，pjnu-5r:cgcaagcttttaacgcttgatatcgctttta)。
bamhi和hindⅲ37℃双酶切pcr扩增的基因片段2小时，pcr产物纯化试剂盒纯化，bamhi和hindⅲ37℃双酶切质粒pcdfduet-1两小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段。t4连接酶处理目的基因片段与载体片段，16℃处理8-10小时，将上述连接反应液加入100μl大肠杆菌jm109化转感受态中冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mllb液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布链霉素抗性平板(50mg/l)。37℃培养过夜，挑取单菌落进行菌落pcr验证(veri-pjnu-5f：agcagccatcaccatcatcacca，veri-pjnu-5r：caaggtagtcggcaaataatgtct)。并将阳性菌落转接lb液体培养基，培养12-16h，利用质粒小提试剂盒提取质粒，用bamhi和hindⅲ酶切验证。验证结果如图1。
实施例2：重组质粒pjnu-4的构建
ecori和bamhi双酶切质粒ptrc99a，获得载体片段。ecori和bamhi双酶切质粒pgly-2(公开于dhamankar,h.；tarasova,y.；martin,c.h.；prather,k.l.,engineeringe.coliforthebiosynthesisof3-hydroxy-γ-butyrolactone(3hbl)and3,4-dihydroxybutyricacid(3,4-dhba)asvalue-addedchemicalsfromglucoseasasolecarbonsource.metabolicengineering2014,25,72-81.)，获得目的基因(ycdw，aceak)片段。t4连接酶处理目的基因片段与载体片段，16℃处理8-10小时，将上述连接反应液加入100μl大肠杆菌jm109化转感受态中冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mllb液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布氨苄抗性平板(100mg/l)。挑取阳性克隆进行验证，获得重组质粒pjnu-4(ptrc99a-ycdw-aceak)。:
实施例3：mg1655(de3)中敲除乳酸脱氢酶基因ldha
采用λ-red重组法敲除了ldha(乳酸脱氢酶)。具体实施步骤如下。以pkd4为模板，利用引物ko-ldhaf：
r:
将pcp20电转入阳性克隆，30℃培养8h后，37℃过夜培养，诱导frt重组酶的表达，同时质粒逐渐丢失。在无抗生素的平板上划线，再次进行菌落pcr验证。
实施例4,：重组菌株mgly14和mgly145的获得
将重组质粒pjnu-4(ptrc99a-ycdw-aceak)转化入mgly1(mg1655(de3)δldha)，获得重组菌株mgly14。将重组质粒pjnu-5(pcdfduet-1-glta)，转化进mgly14,得到工程菌株mgly145。
实施例5：重组菌株mgly145和mgly14摇瓶发酵
种子培养基为lb培养基(g/l)：酵母粉5，胰蛋白胨10，nacl10，ph7.0，添加1.5％琼脂粉即为lb固体培养基。灭菌后补加终浓度为1μg/ml的氨苄青霉素和1μg/ml的链霉素。
m9发酵培养基(g/l)：na2hpo46.78，kh2po43，nh4cl1，nacl0.5，葡萄糖10(单独灭菌)，mgso40.24(单独灭菌)，cacl20.115(单独灭菌)。灭菌后补加终浓度为100mg/l的氨苄青霉素和50mg/l的链霉素。
摇瓶发酵方法：将-80℃保藏菌株接种在添加相应抗生素的lb固体平板上分离活化后，转接至50mllb液体培养基中，37℃、200r/min培养过夜，获得摇瓶发酵种子液。取1ml种子液接种于50mlm9培养基中，37℃、200r/min培养至对数中期(od600＝0.6～0.8)，加入1mmiptg以诱导目的基因表达，并控制发酵温度为30℃。
结果分析：发酵过程中每4～6h取一次样，用hplc检测乙醇酸产量。发酵结果如图2示，mgly145乙醇酸产量为1.369g/l，产率为0.504g/g葡萄糖，较mgly14提高了30.9％，生物量提高了27.4％。
实施例6：重组菌株mgly145和mgly14分批发酵
种子培养基和发酵培养基同实施例1。
分批发酵培养方法：甘油保藏的菌种于平板上划线活化后，挑取单菌落接种于50ml的lb液体培养基中，37℃、200r/min摇瓶过夜。以1％接种量将活化后的菌种转接于60mllb液体培养基中，37℃、200r/min培养6h作为种子备用，以2％的接种量接种于5l发酵罐中(装液量为3l)，培养至对数中期(od600＝0.6～0.8)，加入0.8～1mmiptg诱导。发酵条件如下：搅拌转速400r/min，通气量1vvm，2mol/lnaoh维持ph为7.0，温度30℃。
结果分析：发酵过程中每4～6h取一次样，用hplc检测乙醇酸产量。结果如图3所示，mgly14乙醇酸产量为2.227g/l，产率为0.328g/g葡萄，乙酸最高积累量为2.565g/l。mgly145乙醇酸产量为2.423g/l，产率为0.376g/g-葡萄糖，乙酸最高积累量为0.833g/l。与mgly14相比，mgly145的乙醇酸产量提高了8.8％，产率提高了14.6％，而且乙酸积累量减少了67.5％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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