本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一组来氟米特药物疗效及不良反应风险snp位点的系统及试剂盒，通过同时检测来氟米特药物疗效及不良反应风险密切相关的dhodh基因和cyp1a2基因的单核苷酸多态性位点(snp)基因型来评估来氟米特在类风湿关节炎及其他疾病使用中的疗效及不良反应风险。
背景技术：
来氟米特是一种针对类风湿关节(ra)的慢作用抗风湿病药物(dmard)。以往的临床试验证实来氟米特治疗的患者中有30-50％达到疾病活动度下降20％(acr20)，此外与甲氨蝶呤联用时疗效亦很显著。但是，仍有相当一部分患者对其无反应，此外高达40％的患者因为毒性而必须停止用药；大约20-30％的患者出现胃肠道毒性(腹泻、恶心和呕吐)，这常出现于用药早期且在长期服用后可能会自发缓解。对于传统dmards无效的患者通常会考虑生物dmards，但生物dmards可能增加某些类型癌症和感染的风险且价格昂贵。所以使用较为经济且能降低复发率的药物(例如来氟米特)仍是一种较好的选择。因此，预测患者对来氟米特反应如何相当重要，但通常临床判断来氟米特的疗效需要3个月时间，而与药物反应相关的遗传特征有助于早期在治疗开始前进行预判，从而迅速帮临床医师确定治疗选择。
来氟米特的作用机制主要涉及对酶dhodh的抑制，而dhodh对嘧啶的从头合成至关重要。通过抑制嘧啶的合成，t细胞的增殖受到抑制，编码dhodh的基因位于第16号染色体的长臂上，长度约16kbp。pawlik等人分析了dhodh基因第一个外显子中的非同义snp(rs3213422)，结果发现c等位基因与来氟米特治疗反应增强相关，同时c等位基因还与治疗的毒性风险下降相关。
来氟米特是一种前体药物，在体内迅速被转换特立氟胺(活性代谢产物)。细胞色素p-450酶cyp1a2负责将来氟米特代谢为特立氟胺，研究表明cyp1a2的基因多态性可能与来氟米特的毒性增加及血浆浓度的变化有关。有研究证实cyp1a2c734a的a等位基因毒性反应的风险增加9.7倍(p＝0.002,or＝9.708,95％ci＝2.276,41.403)。
技术实现要素：
为了解决上述提到的问题，本发明提供了一种可以预测患者对来氟米特反应如何的系统、试剂盒和方法。
一种用于预测来氟米特药物疗效及风险的snp位点的系统，所述的试剂盒包括有：
如下特异序列引物：
如下序列特异探针：
如下序列报告探针：
一种用于预测来氟米特药物疗效及风险的基因型的试剂盒，所述的试剂盒包括有上述的特异序列引物、探针和报告探针。
一种用于预测来氟米特药物疗效及风险的snp位点的方法，所述的方法包括如下步骤：首先进行pcr反应，实现扩增；再进行多重ola反应，标记和连接；然后进行杂交反应，最后进行基因型的分析。
优选的，所述的pcr反应体系如下：2xqiagenhotstarmm5ul,primermix1ul，dna样本2ul,灭菌水2ul；pcr反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。
优选的，所述的ola反应如下：配制2xolamastermix，将olamastermix与pcr反应产物混合，混匀后进行连接反应。
优选的，配制2xolamastermix包括有：10xtaqligasebuffer2ul,40000u/ml的taqdnaligase0.25ul，野生型探针mix1ul，突变型探针mix2ul，去离子水4.75ul。
优选的，连接反应条件如下：96℃2min,30个循环的94℃15s,37℃1min；4℃维持。
优选的，杂交反应的洗涤程序过程如下：选择相应的报告探针的磁珠，重悬，然后将每种磁珠混合，稀释最多至100u颗/ul，用2xtmhybridizationbuffer，混合后加入磁珠混合物至每孔中，添加1-5ulolareaction和25uldh2o至每个孔，进行pcr反应：96℃90s,37℃30min，吸走上清，用1xtmhybridizationbuffer重悬磁珠，吸磁30-60s，再次吸走上清，重复用1xtmhybridizationbuffer重悬磁珠，吸磁30-60s，第三次吸走上清，用1xtmhybridizationbuffer重悬磁珠，在37℃温育15min，加入50ul反应产物至luminex中分析。
优选的，杂交反应的不洗涤过程如下：1、选择磁珠，并重悬；2、将每种磁珠混合，并稀释至100u颗/ul，用2xtmhybridizationbuffer，振荡混合；3、加入磁珠混合物至每孔中；4、添加样品至每孔中；5、进行pcr反应：96℃90s，37℃30min；6、准备6ug/mlsape在1xhybridizationbuffer；7、添加100ulsapemix，混匀；8、37℃温育15min；9、加入100ul至37℃的luminex中分析。
本发明的有益效果在于：提供了特异序列的引物、探针和报告探针，创新性地对一组来氟米特药物疗效及不良反应风险的基因位点进行检测，预测类风湿关节炎及其他患者服用来氟米特后疗效及不良反应的风险，利于患者的精准用药。
具体实施方式
本发明提供一种试剂盒，试剂盒针对人类基因组dna中来氟米特药物疗效及不良反应风险的基因位点，即dhodh(19c>a)即rs3213422，和cyp1a2(734c>a)即rs762551。设计特异性引物和野生型/突变型探针，与偶联相应报告探针的magplex-tag磁珠进行杂交反应，通过显色反应在luminex200仪器上进行检测。通过对信号值的读取判读各个snp位点的碱基型别进行判定。
试剂盒中涉及的特异引物序列如下：
涉及的特异探针序列如下：
涉及的报告探针序列如下：
其检测过程如下：
(1)2个snp位点在同一管进行pcr反应，反应的体系为总体积10μl，包含2xqiagenhotstarmm5ul,primermix1ul，dna样本2ul,灭菌水2ul。
在abi9700型pcr扩增仪上进行反应，反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。
(2)多重ola反应：配制2xolamastermix：10xtaqligasebuffer2ul,taqdnaligase(40,000u/ml)0.25ul，野生型探针mix(100nmeach)1ul,突变型探针mix(2.5umeach)2ul，去离子水4.75ul。将olamastermix与反应产物混合：2xolamastermix10ul,扩增的pcr产物5ul,灭菌去离子水5ul。上下吹打混匀，盖上反应管，进行在abi9700型pcr扩增仪上连接反应。96℃2min,30个循环的94℃15s,37℃1min；4℃维持。
(3)杂交反应：选择相应报告探针的magplex-tag磁珠，并重悬。将每种磁珠混合，并稀释至100u颗/ul，用2xtmhybridizationbuffer，振荡混合20s。加入25ul磁珠混合物至每孔中。(应该提供2500颗珠子/每种反应)。添加1-5ulolareaction和25uldh2o至每个孔。调整h2o的体积，使总体积接近50ul。盖上盖子，进行pcr反应：96℃90s,37℃30min。放于磁力板中30s-60s，使磁珠吸住。小心吸走上清，别吸走磁珠。用1xtmhybridizationbuffer75ul，重悬magplex-tag磁珠，吸磁30-60s。小心吸走上清，别吸走磁珠。重复用1xtmhybridizationbuffer75ul，重悬magplex-tag磁珠，吸磁30-60s。小心吸走上清。用75ul1xtmhybridizationbuffer(包含2-8ug/mlsape)，重悬磁珠，在37℃温育15min。在37℃中，加入50ul反应产物至luminex中分析。
(4)结果分析
通过质粒及水对照，获得背景信号，检测样本结果时，减去背景后，数值大于200即为阳性反应。
检测报告中会提供2个snp型别结果，参考基因为野生型基因。检测dhodh(19c>a)基因rs3213422突变型对应的结果显示为aa,杂合型对应的结果显示为ca，野生型对应的结果显示为cc。cyp1a2(734c>a)基因rs762551突变型对应的结果显示为aa,杂合型对应的结果显示为ac，野生型对应的结果显示为cc。
序列表
<110>广州和康医疗技术有限公司
<120>一种用于预测来氟米特药物疗效的snp位点的试剂盒和方法
<130>pj1810004.06
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(“人工序列”)
<400>1
gccaccatctcctccaat18
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(“人工序列”)
<400>2
gcggtcatgtgttcactaa19
<210>3
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(“人工序列”)
<400>3
gggcacttcgaccctta17
<210>4
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(“人工序列”)
<400>4
ctgatagtgctcctggac18
<210>5
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(“人工序列”)
<400>5
attcaatactatctaacacttactgcgtggagacacctgc40
<210>6
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(“人工序列”)
<400>6
acttacaataactactaatactctgcgtggagacacctga40
<210>7
<211>41
<212>dna
<213>人工序列(“人工序列”)
<400>7
tcatcactttctttactttacattcccatccttcgctacca41
<210>8
<211>41
<212>dna
<213>人工序列(“人工序列”)
<400>8
aatttcttctctttctttcacaatcccatccttcgctacct41
<210>9
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(“人工序列”)
<400>9
aagtgagtcccgcgagtg18
<210>10
<211>16
<212>dna
<213>人工序列(“人工序列”)
<400>10
gcctaaccctgccctg16