本发明属于生物
技术领域：
。更具体地，涉及一种改进的开放染色质检测方法及其试剂盒和应用。
背景技术：
：在人类细胞细胞中，dna与多种蛋白结合形成具有多层结构的染色质。然而，只有1％的染色质是活跃的，被称为活跃染色质(开放染色质)。这些活跃染色质((如启动子，增强子)的打开和关闭，以及它们在细胞核中的位置与基因的表达调控和细胞的生物学行为有密切关系。一直以来，研究者利用dnasei酶切和高通量测序方法(dnase-seq)揭示活跃染色质在基因组中的线性位置。但是这种方法需要107级别数量以上的细胞以及大量的时间投入，限制了其在临床活检中的应用。2013年底斯坦福大学greenleaf教授和howardchang报道的atac-seq(assayfortransposase-accessiblechromatinusingsequencing)技术的出现突破这一限制，为研究染色质的可接近性提供了全新的手段(atac-seq通过tn5转座酶将测序的adapters插入到基因组上的“可接近”区域来标记调控的区域，仅需500～50000个细胞就能获得高质量的染色质开放结构图谱并随着测序深度的加深(达200millionsreads)，甚至可以直接看到转录因子的结合位点(有转录因子结合的地方不被tn5酶切割，形成印迹(footprint)，大大简化了实验流程及样本损耗。2017年7月12日，atac-seq技术发明者之一howardchang通过追踪患者在组蛋白脱乙酰酶抑制剂(hdaci)抗癌药物治疗过程中各个时间点的表观遗传状态，首次在时间尺度上深入研究表观遗传基因组和关键性转录因子对患者药物敏感性的动态调控机制，并准确预测患者对hdaci抗癌药物的敏感性，为新的靶向治疗方案提供依据，也为研究其他疾病的精准医疗的表观遗传调控机制建立模板。另外，通过atac-seq数据对正常、混合、宿主、肿瘤细胞的dna拷贝数进行分析，利用人类染色体图显示人类基因组dna的拷贝数在各细胞类型中的差异，howardchang证实了在混合和肿瘤细胞中多个已被报道的遗传变异，如chr4q、chr8q和chr17q的增加，chr10q和chr17p的缺失等，并发现这些变异并没有发生在正常人或者患者的宿主细胞中。有趣的是，howardchang发现遗传层面的dna拷贝数差异并不能反映患者对药物的敏感性，相反，表观遗传层面的转录因子调控机制却可以准确的预测患者对药物的应答情况，再一次说明对患者表观遗传基因组研究的重要性，也提示了当前精准医疗研究中常规使用的基因测序的局限性。遗憾的是，经典的atac-seq技术只能在新鲜细胞中进行tn5的转座实验，否则文库的质量极差。因此严重限制了atac-seq在临床样本检测中的应用。另外，经典的atac-seq文库中存在较多的adaptordimer和大于600bp的大片段，较大程度影响了测序的质量。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有atac-seq技术无法应用于临床样本(冰冻组织)以及atac-seq文库中存在较多的adaptordimer和大于600bp的大片段会影响测序质量的缺陷和不足。提供一种改进的atac-seq方法，所述方法能有效对临床冰冻组织进行染色质结构检测，其结果与新鲜组织检检测的结果完全一致。该方法能有效地对临床标本库组织的染色质结构进行检测，并结合患者的临床数据，从而建立基于染色质结构检测与患者预后的模型，对于促进精准医疗的发展，具有重要的意义。本发明的目的是提供一种改进的开放染色质检测方法。本发明的另一目的是提供一种用于开放染色质检测试剂盒。本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：本发明首先提供一种细胞核提取方法，将细胞组织研磨成粉末后加入pbs重悬，离心并去除上清，再向沉淀中加入裂解液，充分裂解后离心并去除上清，沉淀用pbs重悬，将重悬后的样品过40μm滤膜得到含细胞核的滤液；所述裂解液包含以下终浓度的各组分组成：50mmhepes(ph7.5)，140mmnacl，1mmedta(ph8.0)，0.5％np-40，0.25％tritonx-100。本发明人前期研究发现，经典的细胞核提取方法不适用于冰冻组织，无法从有限的组织中获取后续研究所需的细胞核数，且难以进行tn5的转座实验，制备的文库质量极差。本发明通过优化细胞组织的细胞核提取方法，尤其是自主研制了一种可以在冰冻组织(临床样本)中获取高质量细胞核的方法；与经典atac-seq先数取一定数量新鲜原代细胞或细胞株进行计数后再通过裂解液裂解相比，本发明所述方法在从冰冻组织中提取细胞核的同时，就可以对细胞核核膜进行初步的裂解，方便后续的实验。本发明的细胞核提取方法可以从有限的冰冻组织中提取到相当数目的细胞核数可达到与新鲜组织同样的水平。优选地，所述裂解液还包含终浓度10％glycerol；本发明在上述裂解液的基础上通过进一步加入glycerol，可使后续的文库质量得到进一步提升，通过摸索，发现10％glycerol的效果最佳。优选地，所述细胞组织为新鲜细胞组织或冰冻组织。优选地，所述细胞组织与裂解液的质量体积比为5～10mg：1～2ml；atac-seq的关键是裂解，裂解不充分，tn5进不去，裂解太过的话，又会破坏核膜，因此对裂解液与细胞组织的比例有一定的要求。优选地，所述裂解液中各组分的母液浓度为：1mhepes(ph7.5)，5mnacl，0.5medta(ph8.0)，50％glycerol，10％np-40。优选地，为了保证组织中细胞核的完整性和活性，上述离心均为4℃2000g离心3～5min；所述pbs均为预冷的pbs。本发明上述方法获得的细胞核可满足开放染色质检测的需求，因此，上述细胞核提取方法在开放染色质检测中的应用，尤其是在冰冻组织的开放染色质检测中的应用亦在本发明保护范围内。一种改进的开放染色质检测方法，为利用上述细胞核提取方法提取细胞组织的细胞核，然后对滤液中的细胞核进行计数，挑取50，000细胞核于pbs中，离心并去除上清，向沉淀中加入转座体系，进行转座反应。然后对已转座的dna进行纯化，再进行pcr扩增，最后将pcr产物纯化后测序。具体地，所述50，000细胞核的转座体系为25μltdbuffer，22.5μlddh20，2.5μltd(tn5酶)；其中，细胞核数与td(tn5酶)的用量是至关重要的，它们共同决定着dna片段的产生分布。具体地，所述转座为在pcr仪中37℃孵育30分钟。具体地，所述对已转座的dna进行纯化为用ampurebeads进行纯化：向已转座的dna中加入ampurebeads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，然后去除上清并用80％乙醇溶液洗涤，重复该步骤，去除残留的乙醇溶液，最后用eb溶液洗脱。优选地，所述已转座的dna与ampurebeads的体积比为1：2～3。具体地，dna纯化后的pcr扩增方法与经典方法相同。具体地，所述pcr产物纯化为用ampurebeads进行纯化：向pcr反应产物中加入终浓度为0.65×的ampurebeads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，将上清液转到新管中，加入终浓度为1.8×的ampurebeads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，然后去除上清并用80％乙醇溶液洗涤，重复该步骤，去除残留的乙醇溶液，最后用eb溶液洗脱。经典的atac-seq通过qiagenminelutekit对已转座的dna进行过柱纯化，通过凝胶电泳法对pcr产物进行纯化并分选；传统的过柱纯化和凝胶电泳法使dna损失较多，会造成文库复杂度降低(50000细胞dna转座后得到dna量很少)，而本发明的ampurebeads回收可减少dna的损失(约30％)；去除文库中的无效测序片段：经典的atac-seq并未对文库中的adaptordimer及大于600bp片段去除(保留所有的nucleosomepattern)，然而，如果实验只关注的是开放染色质区域而非核小体定位信息，没必要保留600bp以上的大片段(二代测序仪对600bp以上片段的测序效率极低)。因此，我们利用ampurebeads，经过两轮的ampurebeads筛选(通过控制不同的ampurebeads与样本的比例)，去除了adaptordimer和大于600bp的大片段，大大提高了文库dna的有效测序比例。同时，上述方法在冰冻组织开放染色质检测中的应用亦在本发明保护范围内。一种用于开放染色质检测的试剂盒，所述试剂盒包含上述裂解液及ampurebeads。优选地，所述试剂盒中还包含40μmcellstrainer，illuminatagmentdnabuffer，illuminanexteratagmentdnaenzyme，nebnexthigh-fidelty2xpcrmastermix，100xsybrgreeni。本发明的所述试剂盒可对临床冰冻组织进行开放染色质检测，其结果可以达到和新鲜组织检测结果完全一致。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种改进的atac-seq方法，通过对细胞组织的细胞核提取方法进行改进，以及通过使用ampurebeads技术大大提高了文库的质量，所述方法能有效对临床冰冻组织进行染色质结构检测，其结果与新鲜组织检检测的结果完全一致。该方法能有效地对临床标本库组织的染色质结构进行检测，并结合患者的临床数据，从而建立基于染色质结构检测与患者预后的模型，对于促进精准医疗的发展，具有重要的意义。附图说明图1为本发明pcr循环数计算方法图。图2为利用ampurebeads对文库片段进行筛选前后的bioanalyzer分析数据图；上图显示的是未经ampurebeads处理的文库(与2013年naturemethods报道的atac-seq的文库类似，呈现特征性的核小体分布)，下图是经过ampurebeads处理的文库。图3为冰冻肝脏组织与新鲜肝脏组织atac-seq的pearson相关系数。图4为冰冻肝脏组织与新鲜肝脏组织ucsc基因组浏览器截图。图5为本发明的细胞核裂解液优化过程图。图6为本发明方法和2013年naturemethods报道的方法的对比图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1冰冻肝脏组织和新鲜肝组织的开放染色质检测方法一、方法1、在液氮下，利用研磨皿分别把5mg新鲜肝组织和5mg冰冻肝组织研磨成粉末，然后转移到1.5mlep管中；2、往组织粉末中加入1ml1x预冷的pbs，重悬后4℃2000g离心3min；3、去除上清后往pellet中加入1mllb1裂解液重悬；然后在4℃震动10min；所述裂解液的配制如表1所示：表14、然后把样本转移到2ml玻璃匀浆器中，温柔地匀浆15下，然后转移到1.5mlep管中，4℃2000g离心5min；5、吸取上清并用1ml1x预冷的pbs重悬pellet；6、把重悬后的样品用40μm滤膜的cellstrainer(放在6孔板中)进行过滤；7、用tryptanblue对细胞核进行计数；8、把50，000细胞核转移到1.5mlep中，使用pbs把液体补足到50μl，然后4℃800g离心10分钟；9、去除上清后进行加入25μltdbuffer，22.5μlddh20，2.5tde(tn5酶)，并转移到pcr管中，在pcr仪中37℃孵育30分钟；10、用ampurebeads对已转座的dna进行纯化：(1)加入100μlampurebeads,吹打10次，室温静置15min；(2)然后把beads放在magneticrack上，室温静置2min；(3)去除上清；(4)加入200μl80％新鲜配制的乙醇；(5)室温孵育30sec后去除上清；(6)重复用乙醇清洗一次；(7)去除上清后，进行短暂spindown，然后把ep管放回到magneticrack中，去除残余的乙醇；(8)室温风干5min；(9)把ep管移离magneticrack；(10)用16.5μlebbuffer重悬beads；(11)室温孵育2min；(12)把ep管放到magneticrack中，小心地吸取15μl上清；11、对已纯化的转座dna进行pcr扩增，所述pcr反应体系如表2所示，pcr程序如表3所示：表2表3组分体积转座dna15μlnexterapcr引物indexn7xx(25μm)2.5μlnexterapcr引物indexs5xx(25μm)2.5μlnebnexthigh-fidelity2xpcrmaster25μl100xsybrgreeni**0.3μlh204.7μl总体积50μl12、为了减少gc和dna片段大小偏倚，进行如下的一个预pcr反应，以确定剩余样本的pcr循环数(避免过饱和)：其中，反应体系如表4所示，pcr程序为表5所示；表4表513、计算剩余45μlpcr反应的最佳循环数(如图1所示)：方法：测量每个曲线1/4最大荧光强度所对应的循环数，该循环数则为剩余45μl样本反应的最佳循环数；14、对剩余的45μl进行pcr扩增(除循环数改变外，其余程序与12一样)。15、对pcr产物进行进行两轮ampurebeads纯化；第一轮(0.65xampurebeads)(1)把45μlpcr反应产物用水补足到50μl，加入32.5μlampurebeads，吹打10次；(2)室温静置15min；(3)然后把beads让在magneticrack上，(4)静置2min；(5)把上清转移到一个新的ep管中；第二轮(1.8xampurebeads)(1)往上清中加入57.5μlampurebeads,吹打10次，室温静置15min；(2)把beads放在magneticrack上，室温静置2min；(3)去除上清；(4)加入200μl80％新鲜配置的乙醇；(5)室温孵育30sec后去除上清；(6)重复用乙醇清洗一次；(7)去除上清后，进行短暂spindown，然后把ep管放回到magneticrack中，去除残余的乙醇；(8)室温风干5min；(9)把ep管移离magneticrack；(10)用22.5μlebbuffer重悬beads,室温孵育2min；(11)把beads放到magneticrack中，小心地吸取20μl上清。16、将纯化后的pcr产物进行测序。二、结果1、本发明的冰冻肝脏组织文库经过使用两轮ampurebeads处理后，文库中的adaptordimer(左边红框)和大于600bp的片段(右边红框)被很好地去除(如图2所示)。而未经ampurebeads处理的文库(与2013年naturemethods报道的atac-seq的文库类似，呈现特征性的核小体分布)。2、本实施例新鲜肝脏组织和冰冻肝脏组织的atac-seq文库(ampure处理后)进行测序，结果发现二者均产生约72423个peaks；二者的pearson相关系数达0.995(如图3所示)；ucsc基因组浏览器显示新鲜和冰冻的肝脏组织的atac-seq检测结果高度相似(如图4所示)，重复试验显示本发明的方法结果稳定、可靠。实施例2裂解液的优化本发明实施例1中裂解液的关键是引入triton进行裂解(2013年的naturemethods文章仅使用np-40)，这一步骤使文库的质量显著提高；另外，我们引入glycerol后(浓度为50％)，文库的质量得到进一步提高；再通过摸索glycerol的不同浓度，发现10％glycerol的效果最佳；其结果如图6所示。对比例1用经典的方法进行冰冻肝脏组织的开放染色质检测使用经典的方法(2013年发表在naturemethods的protocol)对新鲜和冰冻的小鼠肝脏组织进行atac-seq实验，结果新鲜的肝脏组织能呈现一些特异的peak，但背景(noise)较高，而在冰冻组织中背景极高，根本并不能看到特异的peak。(下图是ucscgenomebrowser截取管家基因actb基因附近的区域)。因此用经典的方法并不能进行冰冻组织的atac-seq实验。而我们自主改良的方法无轮在新鲜还是在冰冻肝脏组织中的结果都呈现特异的peak且几乎无背景(图5)，进一步显示了本发明方法的优越性。当前第1页12