Spt事件侧翼的植物基因组dna及用于鉴定spt事件的方法
【专利说明】SPT事件侧翼的植物基因组DNA及用于鉴定SPT事件的方 法 发明领域
[0001] 本发明的实施方案涉及植物分子生物学领域。更具体地，本发明的实施方案涉及 含有制种技术（seed production technology) (SPT)事件和位于转基因序列侧翼的植物基 因组DNA的转基因玉米植物。
[0002] 发明背景
[0003] 植物中外源基因的表达已知能被其在植物基因组中的位置所影响，也许是由于 整合位点附近的染色质结构（例如异染色质）或转录调节元件（例如增强子）的接近 (Weising，et al·，（1988)Ann. Rev. Genet 22:421-477)。同时，位于基因组中不同位置的转 基因的存在以不同方式影响植物的总体表型。因此，通常，为了鉴定以引入的目的基因的最 适表达为特征的事件而必需筛选大量事件。例如，已经在植物和其他生物体中观察到在事 件之间，引入的基因的表达水平可以存在广泛的变化。表达的空间或时间模式中也可以存 在差别，例如，不同植物组织中转基因的相对表达的差别，这可能不符合预期来自引入的基 因构建体中存在的转录调节元件的模式。还观察到转基因插入可以影响内源基因表达。因 此，产生数百至数千的不同事件并且为了具有用于商业目的的所需转基因表达水平和模式 的单一事件而筛选那些事件是常见的。具有所需转基因表达的水平或模式的事件对于使用 常规育种方法通过有性远交将转基因渗入到其他遗传背景中是有用的。这些杂种的子代保 持最初转化体的转基因表达特性。该策略用于确保许多良好适应于局部生长条件的品种中 可靠的基因表达。
[0004] 能够检测植物或种子或这些植物或种子的子代中特定事件的存在或不存在是有 利的，这不仅涉及转基因自身，还涉及其在宿主植物或种子的基因组中的位置。能够为了确 定有性杂交的子代是否含有目的转基因而检测事件的存在是特别有利的。此外，用于检测 特定事件的方法对于以下是有帮助的：符合需要源自重组作物植物的食品的上市前许可和 标签的规定，或环境监测、监测田地中作物的性状或监测源自作物收获的产品中的用途，以 及确保各方对规章性或合同性条款的遵守中的用途。事件特异性检测方法可以鉴定插入的 DNA和受体基因组之间独特的接合（junction)。
[0005] 发明概述
[0006] 如本文所述，玉米通过SPT事件的插入已被修饰。相关描述也提供在美国专利申 请公开第US2009/0038026号和美国专利申请公开第2006/0288440号。表12中总结了用 于生成事件E6611. 32. 1. 38的PHP24597的T-DNA中的遗传元件。
[0007] 提供了涉及含有特定外源DNA的转基因玉米植物的组合物和方法，所述特定 外源DNA通过标准玉米转化被引入，在本文被称为"制种技术（SPT)事件"或"事件 E6611. 32. L 38"或"E6611. 32. L 38"或"事件 DP-32138-1"或"DP-32138-1"或"事件 32138" 或"32138"。转化的植物或种子也可以称为"32138"或"32138玉米"。还提供了对于生成 转基因事件有用的构建体，和对于鉴定导致包含SPT事件的转基因植物的特定转基因事件 有用的材料和方法。
[0008] 还提供了保藏为ATCC专利保藏第PTA-9158号种子和源自其的植物、植物细胞、 植物部分、谷类和植物产品。本申请人在2008年4月15日于美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection (ATCC.'、)，Manassas, VA 20110-2209USA)进行 了至少2500粒玉米事件32138 (指定为E6611. 32. I. 38)的种子的保藏，并且该保藏被指 定为ATCC保藏第PTA-9158号。这些保藏会根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布 达佩斯条约的条款保持。进行这些保藏仅仅是作为本领域技术人员的方便，而不是承认 根据35U.S.C. §112需要保藏。2008年4月15日于ATCC保藏的种子取自由先锋国际 良种公司（Pioneer Hi-Bred International，Inc.)，7250NW 62nd Avenue, Johnston, IA 50131-1000保持的保藏。在该申请未决期间，专利与商标局长（Commissioner of Patents and Trademarks)和局长根据请求所确定的有权人可以获得该保藏。一旦本申请的任何权 利要求被准许，本申请人会根据37C.F.R. § 1.808将使公众可获得所做保藏样品。该玉米 事件32138的种子的保藏会保持在作为公共保藏处的ATCC保藏处，时间为30年或最近的 请求后5年或本专利可实施的年限，以较长的为准，并且如果在该期间中其变为非有活力 的，则会被替换。此外，本申请人已满足37C.F.R. § § 1.801-1.809中所有的要求，包括在 保藏时提供样品活力的说明。本申请人无权免除法律对于生物材料的转移或其在商业中的 运输所施加的限制。本申请人不放弃追宄对该专利赋予他们的权利或根据植物品种保护法 (Plant Variety Protection Act) (7USC 2321及以下）适用于事件32138的权利的任何侵 犯。禁止未经许可的种子繁殖。种子可以被监管。
[0009] 本发明的其他实施方案涉及本文所述的特异侧翼序列，所述侧翼序列可以用于开 发生物样品中E6611. 32. 1. 38的特异性鉴定方法。其他实施方案涉及E6611. 32. 1. 38的左 边界和/或右边界侧翼区，其可以用于特异性引物和探针的开发。本发明的其他实施方案 涉及基于这些特异性引物或探针的使用的生物样品中E6611. 32. 1. 38的存在的鉴定方法。 [0010] 按照本发明的另一实施方案，提供了检测样品中对应于事件E6611. 32. 1.38的 DNA的存在的方法。在特定实施方案中，方法包含：（a)将包含DNA的样品与DNA引物组接 触，当所述引物组与从包含事件E6611. 32. 1. 38的植物中提取的基因组DNA在核酸扩增反 应中使用时，所述引物组产生对于事件E6611. 32. 1. 38是诊断性的扩增子；(b)进行核酸扩 增反应，从而产生所述扩增子和（c)检测所述扩增子。
[0011] 例如图11中所示序列的包含新的转基因/侧翼插入区的DNA分子，或与所述DNA 分子同源的或互补的分子是本发明的实施方案。
[0012] 其他实施方案包含DNA序列，所述DNA序列包含SEQ ID NO: 1或图11的新的侧 翼和转基因侧翼/插入区。包含足够长度的SEQ ID NO: 1或图11的转基因插入物序列的 多核苷酸和足够长度的SEQ ID NO: 1或图11的玉米基因组和/或侧翼序列的多核苷酸的 DNA序列是本发明的另外的实施方案，所述DNA序列作为引物序列可用于产生对于包含事 件E6611. 32. 1. 38的植物是诊断性的扩增子产物。
[0013] 本发明的其他实施方案包括包含32138玉米的T-DNA区的DNA序列的转基因部分 的至少11个或更多个核苷酸的DNA序列，或其互补物，以及相似长度的SEQ ID