本发明涉及一种(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法，属于药物中间体合成技术领域。
背景技术：
高血压是当今世界最常见的心血管疾病之一。流行病学研究显示：中国高血压患者发病率为12％，而欧美一些发达国家达到20％。目前，心脑血管类药物的销售额占药物销售总额的百分比已经由上世纪80年代的15％上升到目前的20％左右。据市场研究机构kaloramainformation公司研究报告推测，到2008年将心血管市场将超过1000亿美元大关。因此，对于心血管疾病的药物研究备注关注。
一直以来，β受体阻滞剂被用于抗心肌缺血、抗心律失常和抗高血压药物。而奈必洛尔(通用名为盐酸奈必洛尔)是一种强效、选择性的第三代β受体阻滞剂，具有血管扩张活性的选择性β1肾上腺素受体拮抗剂，无内源性产感神经活性。具有更高的选择性，不会引起支气管平滑肌和血管平滑肌收缩，无内源性拟交感活性。用于轻至中度高血压病人的治疗，可用于心绞痛和充血性心力衰竭的治疗。凭借其对心脏的保护作用、良好的降压作用、耐受性及不良反应少等优点，必将在抗高血压药物市场中抢占较大的份额，给企业带来巨大的社会效益和经济效益。市场前景广阔，潜力巨大,被预测为未来具有良好市场前途的“十大重磅炸弹”之一。
一方面，由于当前盐酸奈必洛尔的化学合成工艺普遍存在转化率低、立体选择性低和收率低的缺点，使得盐酸奈必洛尔的价格十分昂贵。然而，对于盐酸奈必洛尔的合成中r-2-氯-1-(6-氟-1-苯并二氢吡喃-2-基)-乙醇是合成盐酸奈必洛尔的关键中间体，但是，国内、外对r-2-氯-1-(6-氟-1-苯并二氢吡喃-2-基)-乙醇的合成工艺中主要是采用硼氢化物(如硼氢化钠或硼氢化钾)进行催化还原的化学合成方式进行制备，而这些反应放量大，反应剧烈，操作复杂，不易控制等缺陷，且采用化学合成往往存在ee值低，手性选择性差，需经过后续的拆分过程，且产物的手性纯度低等问题。
另一方面，相较于化学合成方法，采用生物酶催化还原合成方式由于其具有选择性、反应条件温和环境污染小等优点，如对于羰基还原酶还原羰基成羟基等，但是，目前对于该关键中间体的r-2-氯-1-(6-氟-1-苯并二氢吡喃-2-基)-乙醇的合成还没有报道采用生物酶催化的方式来合成，且在生物酶催化合成的过程中如何选择羰基还原酶使底物中的羰基有选择性的转化成r型的结构对于选择的酶具有较高的针对性，这也就是为什么同样采用同一生物酶催化还原的过程中，对于不同底物的催化还原其对生物酶的选择也不完全相同，具有一定的针对性。因此，如何研究开发出一种适合奈必洛尔的关键中间体生物酶催化的合成方法是目前主要的研究方向之一。
技术实现要素：
本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法，解决的问题是如何选择高立构选择性酶还原来实现高转化率和产物手性纯度。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现，一种(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
在辅助底物葡萄糖和辅助因子的存在下，将如下式i化合物的底物经羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶作用进行不对称催化反应，得到式ⅱ化合物(r)-2-氯-1-(-6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇；
所述羰基还原酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。
采用葡萄糖脱氢酶(ec1.1.1.47)耦合具有上述seqidno：1所示氨基酸序列的羰基还原酶(ec1.1.1.184)共同作用于底物式i化合物(clk)进行生物催化，使能够有针对性的选择对底物中的羰基位进行不对称催化还原，还能够实现很好的立体选择性，实现高效转化成r型结构的式ⅱ化合物(cla)，有效避免反应过程中s型构形的产生，实现底物高效转化的优点，具有手性选择性和纯度高的效果；从而使产物无需经过后续的复杂拆分工序，极大的简化了操作过程。同时，葡萄糖和辅助因子与葡萄糖脱氢酶(ec1.1.1.47)共存体系，能够实现再生，使反应能够有效的进行，从而使整体上能够实现高手性纯度的效果。实现了从根本上解决传统化学合成法产物立体选择性不高和不同产物构型产物的分离难题，实现了高转化率、高手性纯度和高收率的效果，同时，由于减少了拆分工序，极大地降低了该药物的生产成本，让更多的高血压患者能够用的起药。
在上述(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法中，最好使反应体系在弱碱性的条件下进行不对称反应，由于反应过程中产生葡萄糖酸，在一定程度上会影响酶的活性，在弱碱性条件下能够中和产生的葡萄糖酸，从而有效避免葡萄糖酸过多的存在反应体系中而抑制羰基还原酶(ec1.1.1.184)的活性。作为优选，所述不对称催化反应过程中控制反应体系的ph值在7.0～8.0，最好使反应体系的ph值在7.1～7.6。当然，这里调节体系的ph值采用一般的碱性试剂均可，如可以采用氢氧化钠水溶液进行调整。
在上述(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法中，作为优选，所述不对称催化反应的温度为25℃～35℃。使羰基还原酶(ec1.1.1.184)和葡萄糖脱氢酶(ec1.1.1.47)均能够更好的保持酶活性，有利于底物的高效率转换，且在该温度范围内还具有反应条件温和，易于操作的优点。
在上述(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法中，作为优选，所述辅助因子为nad+。能够促进催化还原过程中电子的传递，与葡萄糖脱氢酶(ec1.1.1.47)和葡萄糖共同作用实现酶的再生效果。这里对于辅助因子的用量可以根据实际情况进行调整，并没有具体的限定，最好使辅助因子的用量为底物式i化合物的用量的0.002wt％～0.01wt％。上述的葡萄糖可以是采用无水葡萄糖或一水合葡萄糖均可，最好是采用一水合葡萄糖，具有更好的可操作性。
在上述(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法中，作为优选，所述式i化合物为r型或s型；
所述式i化合物为r型时，相应的式ⅱ化合物为(r)-2-氯-1-((r)-6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇；
所述式i化合物为s型时，相应的式ⅱ化合物为(r)-2-氯-1-((s)-6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇；
在本发明的反应体系中，采用的羰基还原酶(ec1.1.1.184)和葡萄糖脱氢酶(ec1.1.1.47)具有高选择性的特性，能够有效的保持原有的母核立体构形，使母核上手性碳的手性情况能够保持与选择的底物手性相一致，且也能够保证产物的手性纯度效果。
在上述(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法中，作为优选，所述不对称催化还原反应在水中进行。具有环保，毒性低的优点，且也有利于后续产物的分离，简化操作。
在上述(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法中，作为优选，所述羰基还原酶(ec1.1.1.184)的氨基酸序列选用对seqidno.1所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基到的替换、缺失、改变、插入或增加所得到的氨基酸序列进行代替。如seqidno.1所示的氨基酸序列的碱基序列并不局限于该序列，可以在本发明采用的seqidno.1所示的氨基酸序列的基础上通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来获得该序列的类似氨基酸序列均可，使得到的氨基酸序更在保持酶活性的范围内即可。
综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1.通过采用葡萄糖脱氢酶(ec1.1.1.47)和序列如seqidno.1所示的羰基还原酶(ec1.1.1.184)耦合作用，实现高立体选择性，使底物高效的转换为r型的产物，具有手性纯度高的效果，生物催化制备的r,r-cla的立体选择性达到99％以上，纯度达到99％以上，收率达到90％以上。
2.通过使反应体系在弱碱性的条件下进行，能够有效中和反应过程中产生的葡萄糖酸，有效避免其抑制酶活性，使进一步的提高底物的转化效率，提高产物收率的效果。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
本发明通过在辅助底物葡萄糖和辅助因子的存在下，将如下式i化合物(clk)的底物经羰基还原酶(ec1.1.1.184)和葡萄糖脱氢酶(ec1.1.1.47)作用进行不对称催化反应，得到式ⅱ化合物(r)-2-氯-1-(-6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇(cla)；
所述羰基还原酶的氨基酸序列如seqidno：1所示。
在上述的葡萄糖和辅助因子的具有用量可以根据实际情况进行适当的调整，并没有具体的限定要求，一般最好使底物式i化合物与葡萄糖质量比为1：1～1：1.5之间，还可以使辅助因子的用量为底物质量的0.002wt％～0.01wt％。对于葡萄糖脱氢酶和羰基还原酶(ec1.1.1.184)的用量使反应体系的保持在酶活力和条件使反应能够进行即可。一般使反应体系的酶活力在10～30u/ml之间，最好为25u/ml。这里的羰基还原酶(ec1.1.1.184)可以是采用游离形式酶、固定化酶或菌体形式的酶均可，最好是采用游离形式酶，也可以是采用湿菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶等，为了获得更好的转化效率，优选采用粗酶液，如通过一般的方法在重组大肠杆菌进行诱导培养后，将得到的菌泥进行破碎，得到含本羰基还原酶(ec1.1.1.184)的粗酶液即可。
对于上述(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法的具体反应历程可以采用以下反应方程式更直观的表示：
这里的辅助因子nad+还可以采用nadp+代替等，同样能够实现基本相同的作用效果。
进一步的，当采用手性底物时，如采用s型的clk，对应的得到的产物为(r)-2-氯-1-((s)-6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇。对于反应历程则可以采用以下反应方程式表示：
作为另一种实施方式，当采用采用r型的clk，对应的得到的产物为(r)-2-氯-1-((r)-6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇。对于反应历程则可以采用以下反应方程式表示：
对于上述的葡萄糖脱氢酶可以采用本领域一般的原料即可，如可以通过购买得到，也可以采用常用的方法诱导得到。
对于上述的羰基还原酶还可以采用对seqidno.1所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行至少一个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加所得到的氨基酸序列进行代替。同样，能够高效的实现底物的手性选择性转化，使得到相应的r型的产物。
作为最优的实施过程，以下仅列举选用氨基酸序列如seqidno.1所示的羰基还原酶进行具体实施。
实施例1
本实施例中葡萄糖脱氢酶(ec1.1.1.47)的具体培养制备过程如下：
其中，tb培养基的具体为：
磷酸二氢钾：2.31g/l；磷酸氢二钾：16.43g/l；酵母膏：24g/l；蛋白胨：12g/l；甘油：5g/l，加入适量的去离子水溶解，最后定容至500ml，得到相应的500ml的tb培养基。
配制完后，分装至5支250ml的锥形瓶中，每瓶100ml培养基，121℃灭菌30min，当tb培养基冷却至室温后，移入可以产生葡萄糖脱氢酶(ec1.1.1.47)的重组大肠杆菌bl21(de3)保藏液100ul，这里相当于是以重组大肠杆菌bl21(de3)以宿主进行导入诱导，于37℃、200rpm进行摇瓶诱导培养8h后加入取至无菌操作台上，加入300uliptg溶液(浓度为28g/l)，于200rpm、28℃条件下培养16h。最后进行高速离心，转速为10000rpm，离心10min后，收集含有葡萄糖脱氢酶(ec1.1.1.47)的菌泥，备用。
实施例2
本实施例中羰基还原酶(ec1.1.1.184)的培养过程如下：
其中，tb培养基的具体为：
磷酸二氢钾：2.31g/l；磷酸氢二钾：16.43g/l；酵母膏：24g/l；蛋白胨：12g/l；甘油：5g/l，加入适量的去离子水溶解，最后定容至500ml，得到相应的500ml的tb培养基。
配制完后，分装至5支250ml的锥形瓶中，每瓶100ml培养基，121℃灭菌30min，当tb培养基冷却至室温后，移入可以产生羰基还原酶(ec1.1.1.184)的重组大肠杆菌bl21(de3)保藏液100ul，这里相当于是以重组大肠杆菌bl21(de3)以宿主进行导入诱导。于37℃、200rpm进行摇瓶诱导培养8h后加入取至无菌操作台上，加入300uliptg溶液(浓度为28g/l)，于200rpm、28℃条件下培养16h。最后进行高速离心，转速为10000rpm，离心10min后，收集含有本羰基还原酶(ec1.1.1.184)的菌泥，备用。其中，羰基还原酶(ec1.1.1.184)的氨基酸序列如seqidno.1所示。
实施例3
细胞破碎：选取上述实施例1和实施例2得到的相应菌泥，具体为选取1g含葡萄糖脱氢酶菌泥与5g含羰基还原酶菌泥菌泥混合放入50ml烧杯中，加入150ml去离子水搅匀后，于冰水浴中进行超声破碎，破碎条件为：电压400w，超声时间3s，间隔时间5s，工作次数80次，得到相应的破碎酶液。
取洁净的500ml圆底烧瓶，分别加入r型clk25g，然后,加入一水葡萄糖27.5g，辅助因子nad+0.05g，去离子水50ml，最后上述得到的加入破碎酶液；
调整反应体系的ph值，用5m的naoh水溶液调节控制反应体系的ph值为7.5，并控制催化还原反应的温度为30℃，保温反应24h后，取样，检测底物和产物，至反应完全；再将得到的反应液在10000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，取下层沉淀，加入250ml二氯甲烷，并控制温度在20℃的条件下进行打浆漂洗1h，抽滤，收集滤液。将得到的滤液在30℃的条件下进行减压蒸馏除去溶剂，得到油状物产物(r)-2-氯-1-((r)6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇。转化率为99.55％，手性hplc纯度为99.6％，手性gc纯度为98.5％，摩尔收率为91％。
实施例4
细胞破碎：选取上述实施例1和实施例2得到的相应菌泥，具体为选取1g含葡萄糖脱氢酶菌泥与5g含羰基还原酶菌泥菌泥混合放入50ml烧杯中，加入150ml去离子水搅匀后，于冰水浴中进行超声破碎，破碎条件为：电压400w，超声时间3s，间隔时间5s，工作次数80次，得到相应的破碎酶液。
取洁净的500ml圆底烧瓶，分别加入s型clk25g，然后,加入一水葡萄糖25g，辅助因子nad+0.03g，去离子水50ml，最后上述得到的加入破碎酶液；
调整反应体系的ph值，用5m的naoh水溶液调节控制反应体系的ph值为8.0，并控制催化还原反应的温度为35℃，保温反应22h后，取样，检测底物和产物至反应完全；再将得到的反应液在10000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，取下层沉淀，加入250ml二氯甲烷，并控制温度在25℃的条件下进行打浆漂洗1h，抽滤，收集滤液。将得到的滤液在30℃的条件下进行减压蒸馏除去溶剂，得到油状物产物(r)-2-氯-1-((s)-6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇。转化率为99.52％，手性hplc纯度为99.7％，手性gc纯度为98.8％，摩尔收率为92％。
实施例5
本实施例的细胞破碎具体处理方法同实施例4一致，这里不再赘述，区别仅在于，选取含葡萄糖脱氢酶菌泥与含羰基还原酶菌泥菌泥的用量根据反应的酶活力范围内即可，得到相应的破碎酶液，对于以下催化还原反应过程中使酶活力的要求在10～30u/ml。
取洁净的500ml圆底烧瓶，分别加入r型clk25g，然后,加入一水葡萄糖37.5g，辅助因子nad+0.01g，去离子水50ml，最后上述得到的加入破碎酶液；
调整反应体系的ph值，用5m的naoh水溶液调节控制反应体系的ph值为7.0，并控制催化还原反应的温度为25℃，保温反应28h后，取样，检测底物和产物至反应完全；再将得到的反应液在10000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，取下层沉淀，加入250ml二氯甲烷，并控制温度在25℃的条件下进行打浆漂洗1h，抽滤，收集滤液。将得到的滤液在30℃的条件下进行减压蒸馏除去溶剂，得到油状物产物(r)-2-氯-1-((r)-6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇。转化率为99.48％，手性hplc纯度为99.5％，手性gc纯度为98.7％，摩尔收率为91.5％。
实施例6
本实施例的细胞破碎具体处理方法同实施例4一致，这里不再赘述，区别仅在于，选取含葡萄糖脱氢酶菌泥与含羰基还原酶菌泥菌泥的用量根据反应的酶活力范围内即可，得到相应的破碎酶液，对于以下催化还原反应过程中使酶活力的要求在10～30u/ml。
取洁净的500ml圆底烧瓶，分别加入r型clk25g，然后,加入一水葡萄糖30g，辅助因子nad+0.02g，去离子水50ml，最后上述得到的加入破碎酶液；
调整反应体系的ph值，用5m的koh水溶液调节控制反应体系的ph值为7.6，并控制催化还原反应的温度为28℃～30℃，保温反应25h后，取样，检测底物和产物至反应完全；再将得到的反应液在10000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，取下层沉淀，加入250ml二氯甲烷，并控制温度在25℃的条件下进行打浆漂洗1h，抽滤，收集滤液。将得到的滤液在30℃的条件下进行减压蒸馏除去溶剂，得到油状物产物(r)-2-氯-1-((r)-6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇。转化率为99.42％，手性hplc纯度为99.6％，手性gc纯度为98.6％，摩尔收率为91.3％。
实施例7
本实施例的细胞破碎具体处理方法同实施例4一致，这里不再赘述，区别仅在于，选取含葡萄糖脱氢酶菌泥与含羰基还原酶菌泥菌泥的用量根据反应的酶活力范围内即可，得到相应的破碎酶液，对于以下催化还原反应过程中使酶活力的要求在10～30u/ml。
取洁净的500ml圆底烧瓶，分别加入式i化合物clk25g，然后,加入一水葡萄糖32g，辅助因子nad+0.04g，去离子水50ml，最后上述得到的加入破碎酶液；
调整反应体系的ph值，用5m的koh水溶液调节控制反应体系的ph值为7.1，并控制催化还原反应的温度为25℃～30℃，保温反应30h后，取样，检测底物和产物至反应完全；再将得到的反应液在10000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，取下层沉淀，加入250ml二氯甲烷，并控制温度在25℃的条件下进行打浆漂洗1h，抽滤，收集滤液。将得到的滤液在30℃的条件下进行减压蒸馏除去溶剂，得到油状物产物(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇。转化率为99.38％，手性hplc纯度为99.5％，手性gc纯度为98.7％，摩尔收率为91.1％。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
序列表
<110>江苏八巨药业有限公司
<120>一种(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法
<160>1
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<213>羰基还原酶(ec1.1.1.184)
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