一种基因芯片检测单克隆质控标准株的制备的制作方法

本发明涉及医学领域的一种产前基因芯片检测单克隆质控标准株的制备，主要应用于胎儿染色体拷贝数异常或单核苷酸多态性异常检测的室内质控或室间质评。

背景技术：

基因芯片是最近发展起来的一项高通量的基因表达分析技术，是在尼龙膜表面打印点阵或硅玻片表面合成能代表不同基因的成千上万个寡核苷酸作为探针.与放射性同位素或荧光素标记的待测材料中的DNA或cDNA互补结合，采用放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描杂交信号，最后由计算机集中进行分析处理。获得的杂交信号强度及分布模式，可以反映被检样本中有关基因的表达情况。

基因芯片的应用取决于探针的设计，根据探针及探针组合的不同，基因芯片可分为CNV+SNP芯片、CNV芯片和SNP芯片。SNP芯片可以检测单核苷酸多态性及染色体数目异常和SNPs(杂合性缺失/单亲二倍体)，SNP+CNVs芯片可以检测拷贝数变异(缺失、重复、非平衡易位、等臂染色体)，CNV可以检测拷贝数变异。目前基因芯片已成为产前诊断的主流技术，尤其应用于生长发育迟缓、先天性疾病、自闭症患儿、超声异常病例和流产物的检测。

产前诊断的质量控制是确保诊断结果准确性的前提，[卫医发]1997第31号文件、《临床实验室管理办法》、《医院评审标准实施细则》等均指出，实验室必须有规范的质量控制标准。产前诊断的质量控制也是许多学者致力于研究的重要课题。Sikkema-Raddatz B等研究了产前细胞遗传学诊断的细胞培养及制片过程的影响因素，提出了室内质量控制的方法。Fries N和Merz E等提出了影像学产前诊断的质量控制方法。Pihlk等认为必须加强产前筛查的质量控制。Bastien P等在2002～2004年期间对法国23家实验室作了弓形虫产前分子诊断的室间质量评价，认为室间质评对促进实验室间的技术交流、发现问题、提高实验诊断质量起到重要的作用。国内也有较多的产前诊断质控物研究的文献报道，包括以EB病毒转染疑难染色体异常细胞而构建染色体核型分析的质控细胞株、以EB病毒转染或以脂质体介导SV40和/或hTERT基因转染染色体数目异常细胞而构建染色体非整倍体荧光原位杂交检测的质控细胞株，但这些方法由于质控细胞株构建的成功率低下等原因，难以满足产前基因芯片检测的质控物需求，目前尚无理想的产前基因芯片检测的质控物，因开展基因芯片检测的室内质控和室间质评需要大量的同种类基因异常细胞，而这种基因异常的原代细胞很难传代扩增且很难获取，造成了该质控细胞的缺乏而限制了该项质控的开展。所以将基因异常的原代细胞转化为能无限扩增的细胞株，是解决质控细胞缺乏的理想方法。

细胞融合是20世纪发展起来的一种细胞工程技术，可以在一定条件诱导下使两个或多个细胞(原生质体)相互接触，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，形成杂种细胞。细胞融合所形成的新细胞(杂合细胞)得到了来自两个父本细胞的遗传物质，因而具有新的遗传学或生物学特性。细胞融合已成为细胞工程的核心技术之一，它不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫学、医药、食品以及农业等领域具有广泛的应用价值，它已成为杂交育种、单克隆抗体制备、动物克隆以及抗癌疫苗研发等现代生物医学研究中的一项关键技术。

1974年发现了聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，当加入一定分子量的PEG时，融合效率较病毒诱导法可提高1000倍以上，经过研究发现PEG在融合过程中起着稳定和诱导凝集作用。后来人们又发现还有许多其他的化学剂可使细胞凝集并融合，如磷酸盐、高级脂肪酸衍生物、脂质体等，但以聚乙二醇的效果较好。所以1975年以后，利用PEG诱导细胞融合逐渐发展成为一种重要的化学融合方法，PEG法一直沿用至今，即使到了近年来已不断发展为电穿孔或电融合的电场诱导法、激光诱导法、微流控芯片法、高通量芯片法的今天，因新方法的设备和实验费用昂贵等原因，PEG法依然以其低廉的实验成本和相对较高的融合率而在许多实验中依然被大量应用，最常用的是淋巴细胞杂交瘤技术，又称为单克隆抗体技术，是将特异抗原免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞株在含有PEG(1000-2000)的选择培养基中进行融合，得到既能产生单克隆抗体又能在体外无限扩增的杂交瘤细胞株。以此制备的单克隆抗体已经商品化，已广泛应用于研究许多疾病的诊断、治疗和预防。

但至今仍未见将细胞融合技术应用于制备产前基因芯片检测的质控细胞以开展该项检测的室内质控和室间质评的文献报道。

技术实现要素：

为了制备一种基因芯片检测单克隆质控标准株以便开展该项检测的室内质控和室间质评，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供一种基因芯片检测单克隆质控标准株的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：通过CD138单抗的靶向捕获，使CD138单抗的IgGFc端与具有IgGFc受体的基因组异常的有核细胞结合，而CD138单抗的IgGFab端与瘤细胞结合，形成骨髓瘤细胞-CD138单抗-有核细胞的结合物，并在聚乙二醇的共同作用下促使胞膜接触和特异融合，使全异常基因组被植入瘤细胞并随着瘤细胞的扩增而扩增，进而筛选并制备基因组异常的单克隆质控标准株，以基因芯片、高分辨染色体核型分析、荧光原位杂交、PCR或测序验证目标异常基因，用以替代国外基因数据库进行已知变异基因组的比对和基因芯片检测新方法的建立，并用于基因芯片检测的室内质控和室间质评。

本发明首次发现基因异常细胞与鼠瘤细胞融合能形成同具两者性质的融合细胞并能借助鼠瘤细胞的无限扩增而扩增全异常基因组的方法，将其应用于制备基因芯片检测的质控标准株，解决了长期以来该项检测无室内和室间质评物的问题，并将以可比性较差的基因数据库为参照的传统基因筛查方法优化为以可比性较好的质控标准标为参照的基因诊断新方法，以提高其检测质量和可靠性。而且本发明根据B细胞等有核细胞具有IgGFc的结合受体和瘤细胞具有CD138单抗的IgGFab结合受体的特性，在细胞融合中通过CD138单抗对B细胞和瘤细胞的靶向捕获，使CD138单抗的IgGFc端与有IgGFc结合受体的B细胞结合，而CD138单抗的IgGFab端与瘤细胞结合，形成骨髓瘤细胞-CD138单抗-B细胞的结合物，从而易于胞膜接触和特异融合，增加了有效融合率，减少了B细胞与B细胞、瘤细胞与瘤细胞的无效融合。

具体实施方式

图1是本发明的CD138单抗助融示意图。

图2是本发明的细胞融合实拍图。

如图1，1表示具有CD138单抗Fab受体的骨髓瘤细胞，2表示CD138单抗(IgG)，3表示具有CD138单抗Fc受体的基因突变细胞，CD138单抗(IgG)的另一个Fab端还可结合一个骨髓瘤细胞，通过CD138单抗将待融合的细胞连接在一起，有利于在PEG的作用下融合。

如图2，在CD138单抗的助融下，经HAT筛选2周，在倒置显微镜下拍摄(40X)，得到杂交瘤细胞克隆。

下面结合图1和图2，对本发明的实施方案作具体的描述。

1、待融合细胞(含致病性的目标变异基因)：包括单基因病、多基因病、染色体病、线粒体病或体细胞病的基因缺失、重复、突变及拷贝数变异的淋巴细胞、单核细胞、羊水细胞和绒毛组织细胞。本发明采集人β-地中海贫血患者的淋巴细胞；骨髓瘤细胞采用鼠Sp2/0瘤细胞。

2、实验试剂

(1)预融合剂：在10％胎牛血清的DMEM培养基中配入与鼠SP2/0瘤细胞等价的CD138单抗(骨髓瘤细胞∶CD138单抗＝1∶1)。

(2)其他试剂：DMEM培养基、HAT选择培养基购自Sigma公司，胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；DMSO(--甲基亚砜)方国产分析纯试剂；CD138单抗可自制或商品购得。

3、细胞融合方法

(1)骨髓瘤细胞的准备：融合前一周从液氮罐内取出冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)，立即放入热水解冻。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合时将SP2/0从培养瓶上吹下，转入离心管中，1000r/m离心5-10min，重复洗涤细胞2次，轻轻敲打混匀，取少量悬液计数，调整好密度，使融合时的密度为80％左右(应用最多的是Sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×10⁵/ml，倍增时间通常为10～15h；与人体相关的实际应用中考虑选择同源细胞株，如上海复祥生物科技有限公司向ATCC细胞库引进的NCI-H929人骨髓瘤细胞株)。

(2)待融合的基因组异常细胞的准备：淋巴细胞、单核细胞、羊水细胞、绒毛组织细胞以DMEM培养液(基础培养基)调整总细胞数到1×10⁸～2×10⁸，以台盼兰染色、相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

(3)预融合处理：①对于含IgGFc结合受体的有核细胞(B细胞)，在预融合处理中使CD138单抗与骨髓瘤细胞以1∶1调配，使骨髓瘤细胞的CD138受体刚好被CD138单抗结合，通过CD138单抗的IgGFc段靶向捕获B细胞，形成骨髓瘤细胞-CD138单抗-B细胞的结合物。②对于没有IgGFc结合受体的有核细胞，不做预融合处理。③预融合处理方法：将骨髓瘤细胞与CD138单抗按等效价配制于DMEM，37℃2-5小时，1000r/min离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，加入5-10倍的B淋巴细胞混和均匀，1000r/min离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀。

(4)细胞融合：在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后在无菌条件下将预热的1000μL的30％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中，同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，转置56℃水浴放散抗体5分钟(除去结合的抗体)，立即以1500r/m离心5min，弃去上清，加入50mL HAT培养基，适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。

(5)融合细胞(杂交瘤细胞株)的筛选：观察96孔板细胞生长情况，7-10天后仅为有效融合细胞能够生长，此时弃去HAT培养基，更换完全培养基。

(6)单克隆杂交瘤细胞株的筛选(亚克隆)：当细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，选择杂交瘤细胞生长状态良好的培养孔，显微镜下标记细胞生长位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置将细胞克隆吸取到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，使后面每个孔中的细胞数为0-1个，37℃，5％CO2培养箱内培养约1周，显微镜下观察细胞生长情况，待后面(倒数)孔中的细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，选择(倒数)后面孔中的细胞再行单克隆筛选，制备单克隆杂交瘤细胞株。

4、单克隆杂交瘤细胞株的染色体核型分析：对比分析SP2/0骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞的染色体核型，观察杂交瘤细胞中染色体数目的变化。计数50个分裂象，SP2/0骨髓瘤细胞的染色体数目为62条，杂交瘤细胞的染色体数目为87条，有部分人染色体在细胞融合后没有独立存在，已与鼠骨髓瘤细胞的染色体发生融合。

5、单克隆杂交瘤细胞株变异基因的基因芯片检测：按常规基因芯片检测试剂盒的说明书，在相同条件下检测SP2/0骨髓瘤细胞、单克隆杂交瘤细胞株和杂交前的基因组异常细胞，对比检测结果，观察杂交前的基因组异常细胞与单克隆杂交瘤细胞株的基因组变化，确定基因组的拷贝数变异。检测的主要步骤包括DNA提取、DNA浓度测定、限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接、PCR扩增DNA、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测、磁珠法回收纯化DNA、DNA定量、DNA片段化、DNA末端标记、PCR扩增、杂交炉杂交、洗涤、染色、芯片扫描仪扫描和生物学分析。

6、单克隆杂交瘤细胞株变异基因的验证：采用高分辨染色体核型分析和/或荧光原位杂交(FISH)技术和/或PCR技术(QF-PCR/RT-PCR/荧光定量PCR/实时PCR)和/或测序技术(一代测序/Hiseq测序/目标区域测序/深度测序/GC校正及信息对比判定CNV/滑动窗口分析测序数据/二元分割一双向节段调节阈值分析测序数据)进一步验证变异基因组的基因芯片检测结果，确证单克隆杂交瘤细胞株的变异基因组。

7、单克隆杂交瘤细胞株变异基因的定量、分装和冻存：按DNA提取试剂盒说明书，提取单克隆杂交瘤细胞株DNA，测定DNA的浓度，按基因芯片检测试剂盒规定的DNA用量，换算为相当的细胞含量，据DNA浓度和细胞含量的关系，配制、分装单克隆杂交瘤细胞株，置-196℃液氮中冻存备用。

8、单克隆杂交瘤细胞株变异基因的稳定性监测

(1)变异基因的定期检测：每隔1个月取3支冻存的细胞株，进行基因芯片检测及高分辨染色体核型分析、荧光原位杂交、PCR或测序，检测和验证变异基因。

(2)杂交瘤细胞株的定期培养：每隔1个月取3支冻存的细胞株，进行复苏培养，传5-10代后进行基因芯片检测及高分辨染色体核型分析、荧光原位杂交、PCR或基因测序，检测和验证变异基因，稳定者继续冻存。

9、单克隆杂交瘤细胞株的应用

本发明按上述制备的变异基因组稳定的单克隆杂交瘤细胞株就是本发明所指的单克隆质控标准株，可应用于基因芯片检测的室内质控和室间质评。

(1)用于室内质控：在基因芯片的检测中，按临床表现或家系的特征，评估和推测可能的基因变异，分别归类可能为相同基因变异的标本，并从冻存的单克隆质控标准株中选择2株相同或相近的基因变异的细胞株，与被检样本在相同条件下进行基因芯片检测，并比对检测结果，如果2株细胞株的检测结果均与各自所固有的变异基因一致，则样本的检测结果可靠，可以发出报告；如果2株细胞株的检测结果中有1株与各自所固有的变异基因一致，而另1株不一致，则需分析原因，找出误差原因后才可决定是否发放报告；如果2株细胞株的检测结果均不与各自所固有的变异基因一致，则需找出原因并重新检测。

(2)用于建立基因芯片检测的新方法：因国内没有可比对的基因数所库，所以传统的基因芯片检测方法是根据国外基因数据库有关染色体变异所致相应疾病的记载来评估国人类似染色体变异的致病性，由于人种等差异，这种比对结果误差大。本发明在上述室内质控的基础上，可以本发明的质控标准株替代国外数据库，建立新的更准确的基因芯片检测方法。

(3)用于室间质评：由质量管理机构定期抽取冻存的单克隆质控标准株，一般为3株，发放到各参评实验室，进行基因芯片检测后回报结果，根据各室的检测结果与质控标准株中所固有的变异基因组的相符程度，按常规评分各室的检测质量。

10、CD138单抗介导B淋巴细胞融合的效果

(1)常规化学剂诱导与CD138单抗介导细胞融合的预融合率无明显的差异：在细胞融合的过程中，除了B细胞与骨髓瘤细胞会发生融合外，还会发生B细胞与B细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合，只有B细胞与骨髓瘤细胞的融合，才能获得既具有B细胞产生抗体特性又具有骨髓瘤细胞无限增殖特性的B细胞杂交瘤细胞，才是有效的融合，而B细胞与B细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合都是无效融合。为了比较常规化学剂诱导与CD138单抗介导细胞融合的预融合率，取融合后但HAT培养前的细胞沉淀制片、染色、镜下观察，计数100个细胞，计算双核或多核细胞数/总细胞数，换算成百分比(表1)，其中常规化学剂诱导与CD138单抗介导细胞融合的预融合率分别为为41％、47％，CD138单抗介导细胞融合的预融合率高于常规化学剂诱导，但无显著性差异(p＞0.05)。

(2)常规化学剂诱导与CD138单抗介导细胞融合的有效融合率有明显的差异：经HAT选择培养10天后，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合(有效融合)的杂交瘤细胞才能稳定生长，而B细胞与B细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合(无效融合)以及未融合的细胞，均不能在HAT选择培养基中生长。为了比较两者的有效融合率，分别计数融合后并在96孔板中经HAT选择培养10天后仍能稳定生长的孔数/96孔，换算成百分比(表1)，其中常规化学剂诱导法在96孔中有26孔的细胞仍能稳定生长，而CD138单抗介导细胞融合在96孔中有43孔的细胞仍能稳定生长，两者的有效融合率各为为27.1％(26/96)、44.8％(43/96)，CD138单抗介导细胞融合的有效融合率高于常规化学剂诱导，有显著性差异(p＜0.05)。说明常规化学剂诱导法与CD138单抗介导细胞融合的预融合率虽然基本一致，但常规化学剂诱导法的无效融合的比例较高，而CD138单抗介导细胞融合因借助于CD138单抗特异性捕获骨髓瘤细胞与B细胞从而使两者融合，所以其有效的融合率就高。

(3)化学诱导剂毒性对融合细胞传代的影响：将常规化学剂诱导与CD138单抗介导所获的融合细胞接种在96孔板中经HAT选择培养10天后，当大多细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，各选5个细胞孔，去培养上清，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆，置新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面第10孔，37℃，5％CO2培养箱内培养约1周，显微镜下观察细胞生长情况，计数有细胞生长孔与细胞接种总孔数(50孔)，换算成百分比，结果常规化学剂诱导法在50孔中有16孔生长细胞，本发明在50孔中有26孔生长细胞，换算为百分比分别为32％和52％；按上法进而做重复传代试验，其中第2代的结果分别为62％和78％；第3代的结果分别为82％和88％，从试验结果(表2)可知，常规化学剂诱导法与CD138单抗介导的细胞融合在第1代和第2代的传代中，两者的融合细胞传代生长率有显著性差异，在第3代的传代中，两者的融合细胞传代生长率无显著性差异，说明CD138单抗介导的细胞融合因借助于CD138单抗特异性捕获骨髓瘤细胞与B细胞从而使两者融合，而且所含细胞毒性化学诱导剂(PEG)降为25％，对细胞毒性很低，所以在传代初期死亡细胞较少。而在常规化学诱导剂诱导法的细胞融合中，所含细胞毒性化学诱导剂(PEG)的浓度为50％，对细胞毒性作用较大，所以虽然细胞发生融合，但融合细胞因受毒性作用而易于在传代初期死亡。

表1 常规化学剂诱导与CD138单抗介导的细胞融合率比较

表2 PEG浓度对融合细胞传代生长率的影响