本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种nk细胞的无血清培养方法。
背景技术：
自然杀伤细胞(nk细胞)是固有免疫系统中最重要的效应细胞，nk细胞具有强大的抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节等功能，在肿瘤免疫治疗相关领域具有良好的应用前景。
nk细胞具有特殊的靶细胞识别机制，无须接触抗原分子即可杀伤肿瘤细胞，并且不同于t细胞的mhc限制性杀伤特性，nk细胞是非mhc限制性，通过释放杀伤介质主要有颗粒酶素和穿孔素使肿瘤细胞发生凋亡，表达tnf家族分子启动adcc抗体依赖的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。
外周血中nk细胞含量较少，并且目前市面上多采用含血清培养基培养nk细胞，由于血清成分非常复杂、血清批次间差异大，并且可能含有病原性物质，对细胞制品质量造成严重影响。
据此，目前急需一种细胞纯度高、扩增倍数大的nk细胞的无血清培养方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种细胞纯度高、扩增倍数大的nk细胞的无血清培养方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种nk细胞的无血清培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的分离
从25-35ml外周血分离单个核细胞，重悬于无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至(1-3)x106细胞/ml，培养箱中静置培养过夜；
(2)nk细胞的分离培养
第2天，从获得的培养液中吸出悬浮细胞，接种于新的细胞培养瓶中，并补加无血清培养基至45-55ml，同时添加150-250ng/ml抗cd16抗体、450-550u/mlil2(白细胞介素-2)和15-25ng/mlil3(白细胞介素-3)；
第4天，补加无血清培养基至95-105ml，同时添加450-550u/mlil2(白细胞介素-2)、15-25ng/mlil3(白细胞介素-3)，继续培养至第6天；
(3)nk细胞的继续培养
第7天，补加无血清培养基至195-205ml，并添加45-55ng/mlil15(白细胞介素-15)、95-105ng/mlnk细胞激活剂α-半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；
(4)离心收集nk细胞
第14天，离心收集nk细胞，使用流式抗体鉴定nk细胞表型。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中于36-38℃、4％-6％co2培养箱中静置培养过夜。
作为本发明的优选方式之一，所述培养箱的具体培养条件为37℃，5％co2。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中细胞培养瓶为t175细胞培养瓶。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中添加的il15具体浓度为50ng/ml。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中添加的α-半乳糖神经酰胺具体浓度为100ng/ml。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中于500gx10min离心条件下收集nk细胞。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中同时使用fitc-anti-cd3、pe-anti-cd16和percp-anti-cd56流式抗体鉴定nk细胞表型。
作为本发明的优选方式之一，所述无血清培养基具体为kbm581无血清培养基。
作为本发明的优选方式之一，所述kbm581无血清培养基直接购自市场，且成分具体包括：50-200u/mlil-2、100-200mmβ-巯基乙醇、2-5mm丙酮酸钠、5-15mg/l转铁蛋白、5-15mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)制备过程简单、方便，提供了一种nk细胞的无血清培养方法，通过14天的体外培养，可以获得90％纯度以上、扩增倍数达到80倍以上的nk细胞；
(2)nk细胞的继续培养阶段采用nk细胞因子与nk细胞激活剂共同刺激nk细胞培养；其中，更是采用α-半乳糖神经酰胺作为nk细胞激活剂，其通过与cd-1d配体的限制性结合，可特异激活自然杀伤(nk)细胞。
附图说明
图1是实施例1-3中的nk细胞的无血清培养方法流程图；
图2是实施例4中各实验条件下nk细胞的细胞扩增曲线图；
图3是实施例4中各实验条件下nk细胞的纯度柱状对比图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例的一种nk细胞的无血清培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的分离
从25ml外周血分离单个核细胞，重悬于kbm581无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至1x106细胞/ml，36℃、4％co2培养箱中静置培养过夜；
(2)nk细胞的分离培养
第2天，从获得的培养液中吸出悬浮细胞，接种于新的t175细胞培养瓶中，并补加kbm581无血清培养基至45ml，同时添加150ng/ml抗cd16抗体、450u/mlil2和15ng/mlil3；
第4天，补加kbm581无血清培养基至95ml，同时添加450u/mlil2、15ng/mlil3，继续培养至第6天；
(3)nk细胞的继续培养
第7天，补加kbm581无血清培养基至195ml，并添加45ng/mlil15、95ng/mlnk细胞激活剂α-半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；
(4)离心收集nk细胞
第14天，500gx10min离心收集nk细胞，同时使用fitc-anti-cd3、pe-anti-cd16和percp-anti-cd56流式抗体鉴定nk细胞表型。
实施例2
如图1所示，本实施例的一种nk细胞的无血清培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的分离
从35ml外周血分离单个核细胞，重悬于kbm581无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至3x106细胞/ml，38℃、6％co2培养箱中静置培养过夜；
(2)nk细胞的分离培养
第2天，从获得的培养液中吸出悬浮细胞，接种于新的t175细胞培养瓶中，并补加kbm581无血清培养基至55ml，同时添加250ng/ml抗cd16抗体、550u/mlil2和25ng/mlil3；
第4天，补加kbm581无血清培养基至105ml，同时添加550u/mlil2、25ng/mlil3，继续培养至第6天；
(3)nk细胞的继续培养
第7天，补加kbm581无血清培养基至205ml，并添加55ng/mlil15、105ng/mlnk细胞激活剂α-半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；
(4)离心收集nk细胞
第14天，500gx10min离心收集nk细胞，同时使用fitc-anti-cd3、pe-anti-cd16和percp-anti-cd56流式抗体鉴定nk细胞表型。
实施例3
如图1所示，本实施例的一种nk细胞的无血清培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的分离
从30ml外周血分离单个核细胞，重悬于kbm581无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至2x106细胞/ml，37℃、5％co2培养箱中静置培养过夜；
(2)nk细胞的分离培养
第2天，从获得的培养液中吸出悬浮细胞，接种于新的t175细胞培养瓶中，并补加kbm581无血清培养基至50ml，同时添加200ng/ml抗cd16抗体、500u/mlil2和20ng/mlil3；
第4天，补加kbm581无血清培养基至100ml，同时添加500u/mlil2、20ng/mlil3，继续培养至第6天；
(3)nk细胞的继续培养
第7天，补加kbm581无血清培养基至200ml，并添加50ng/mlil15、100ng/mlnk细胞激活剂α-半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；
(4)离心收集nk细胞
第14天，500gx10min离心收集nk细胞，同时使用fitc-anti-cd3、pe-anti-cd16和percp-anti-cd56流式抗体鉴定nk细胞表型。
实施例4
本实施例用以说明上述实施例中“nk细胞的继续培养”步骤中采用不同浓度il15(0ng/ml、50ng/ml、150ng/ml)及α-半乳糖神经酰胺(0ng/ml、100ng/ml、300ng/ml)对所得nk细胞的纯度、扩增倍数的影响，实验条件组合如表1所示。
表1不同浓度il15及α-半乳糖神经酰胺对所得nk细胞的纯度、扩增倍数的影响
结果：将各实验条件下的nk细胞扩增倍数绘制成如图2所示的细胞扩增曲线图，将各实验条件下的nk细胞纯度绘制成如图3所示的柱状图；
由图2和3可知：(1)nk细胞的继续培养阶段，采用nk细胞因子(il15)与nk细胞激活剂(α-半乳糖神经酰胺)共同刺激nk细胞培养，可明显提高最终细胞的纯度及扩增倍数；(2)按照实验条件1的浓度，nk细胞的纯度可达90％以上，并且其扩增倍数也最大，达到80倍以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。