本发明属于植物病害纯化分离领域，具体地说，涉及一种植物病原菌物的纯化分离方法。
背景技术：
植物病原菌物纯化分离技术是植物病害研究的基础性技术，现有的技术主要有：单胞直接挑取法、琼脂块直接切取法、毛细管分离法、组织捣碎法等。单胞直接挑取法是在低倍显微镜(10×或20×)下，利用自制挑孢针(由缝线针、昆虫针、细钢丝、眉毛等制成)针尖直接沾取单胞并转移至培养基中的方法；琼脂块直接切取法是在低倍显微镜(10×或20×)下，利用微型切刀切取仅含单孢琼脂块并将其转移至培养基中的方法；毛细管分离法是在低倍显微镜(10×或20×)下，利用毛细管(φ＝0.3mm)在单胞处打取圆饼并转移至培养基中或直接用毛细管吸取孢子悬浮液在培养基上点样进行分离的方法；组织捣碎法是将病原子实体等组织通过机械磨碎制成悬浮液后，直接进行涂布分离的方法。以上方法在单胞分离前均要进行孢子悬浮液的制备，并通过一定方法将孢子均匀分散于琼脂块上，以供单胞分离使用。目前，单胞分离方法虽然众多，但仍然存在不完善之处，如单胞直接挑取法中挑孢针沾取单胞成功率难以保证，有时一沾即成、有时半天也难以成功一次，且针尖较粗，难以准确定位目标；琼脂块直接切取法在切取含单孢的琼脂块时存在错位的问题，因为需要脱离显微镜进行徒手切块；毛细管分离法与琼脂块直接切取法存在同样的问题，而且点样时也存在漏点或多点的问题；组织捣碎法则较为粗放，获得纯培养菌物的几率较低。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种植物病原菌物的纯化分离方法，本发明结合以往单孢分离方法基础上进行了改进与优化，该方法更具有实用性，且器具简单易获得、成本低廉、操作便捷、成功率较高。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种植物病原菌物的纯化分离方法，包括以下步骤：
步骤1、培养纯培养菌物单孢：取纯培养菌物，利用接种针挑取菌块接种于pda培养基中，接种1-3皿，转移至恒温培养箱中，25℃恒温培养，1-7d，待其产孢；在纯培养菌物培养过程中，定时显微观察，若已产孢，即可进行下一步，若未产孢继续培养，若长时间培养均未产孢，需考虑更换培养基，重复上述步骤，直至产孢；
步骤2、挑取单孢前期准备：取出一无菌载玻片，用擦镜纸擦拭干净，镊子夹取一块wa培养基，置于载玻片中央待用；
步骤3、于wa培养基上，滴1-2滴无菌浮载液，用接种针在产孢菌落组织中轻微晃动，避免挑取菌丝，将接种针针头黏附的孢子置于无菌浮载液中，释放孢子于无菌浮载液中，使用接种针轻微扰动，在不破坏wa培养基的基础上，使孢子尽量分散开来；放置于低倍显微镜下观察，每视野内，以单个孢子分散排开为准，各孢子间隔以大于200μm为宜；将载玻片放置于无菌培养皿中，室温放置数分钟，直至wa培养基上的无菌浮载液蒸发完全，备用；
步骤4、使用微型挑孢针挑取单孢：将载玻片放置于显微镜载物台上，低倍镜(4×)下寻找单孢，锁定单孢，转换高倍镜(10×)，调节视觉清晰，稳定载物台，眼手并用，使用无菌微型挑孢针缓慢接近单孢，轻微碰撞单孢使其黏附于针头尖端；若针头尖端难以黏附单孢时，事先将针头浸没于无菌浮载液中；
步骤5、单孢转移与培养：单孢黏附成功后，将其转移至pda培养基中，后放置于恒温培养箱中进行培养；重复步骤2-步骤5，以实现大量单孢的分离；
步骤6、菌物观察：单孢分离结束后，定期观察孢子萌发与生长情况，若单孢分离成功，培养基中会形成单一菌落，若失败，则需重新进行单孢分离。
进一步地，所述微型挑孢针包括手柄，所述手柄的一端设置有针头，所述手柄长度为10cm，直径为0.5cm；所述针头的长度为1.5-3.0cm，直径为15-25μm，针头上且距头部300μm处折成30-45°角。
进一步地，所述手柄选自带橡皮擦铅笔、接种针手柄、解剖针、玻璃棒或细秆中的一种；所述针头选自昆虫针、缝线针、细钢丝、发尖、眉毛或睫毛中的一种；当针头选自昆虫针、缝线针或细钢丝中的一种时，针头的头部用磨砂纸将针尖磨细。
进一步地，所述pda培养基通过以下方法制备得到：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、蒸馏水1000ml，灭菌后倒平板前，以每300ml培养基中加入12mg/ml的硫酸链霉素1ml，混匀后，倒平板备用。
进一步地，所述wa培养基，即3％水琼脂培养基，通过以下方法制备得到：由蒸馏水与琼脂粉配制而成，配置好后，灭完菌后倒平板，平板厚度控制在3mm，待凝固后，用刀片划取若干长4cm×宽2cm琼脂块，备用。
进一步地，所述无菌浮载液，由蒸馏水和硫酸链霉素制成，通过以下方法制备得到：将蒸馏水灭菌取出，以300ml蒸馏水中加入12mg/ml的硫酸链霉素1ml，混匀备用。
本发明还公开了一种基于纯培养菌物的植物病原菌物的纯化分离方法，采用微型吸取管，包括以下步骤：
步骤1、培养纯培养菌物单孢：取纯培养菌物，利用接种针挑取菌块接种于pda培养基中，接种1-3皿，转移至恒温培养箱中，25℃恒温培养，1-7d，待其产孢；在纯培养菌物培养过程中，定时显微观察，若已产孢，即可进行下一步，若未产孢继续培养，若长时间培养均未产孢，需考虑更换培养基，重复上述步骤，直至产孢；
步骤2、吸取单孢前期准备：取出一无菌载玻片，用擦镜纸擦拭干净待用；于载玻片上，滴1-2滴无菌浮载液，用接种针在产孢菌落组织中轻微晃动，避免挑取菌丝，将接种针针头黏附的孢子置于无菌浮载液中，释放孢子于无菌浮载液中，使用接种针轻微扰动无菌浮载液，使孢子尽量分散开来；
步骤3、放置于低倍显微镜下观察，每视野内，以单个孢子分散排开为准，各孢子间隔以大于400μm为宜；各孢子间隔应尽可能大，且液层不易过厚，以1mm为宜；
步骤4、使用微型吸取管吸取单孢：将载玻片放置于显微镜载物台上，低倍镜(4×)下寻找单孢，锁定单孢，转换高倍镜(10×)，调节视觉清晰，稳定载物台，眼手并用，使用无菌微型吸取管缓慢靠近单孢，在进入液层前需轻微挤压滴头，保持挤压程度不变，吸头缓慢接近孢子，接触孢子后缓慢释放滴头，孢子吸入吸头后，立即停止释放滴头，并迅速转移孢子于培养基中；
步骤5、单孢转移与培养：单孢黏附成功后，将其转移至pda培养基中，后放置于恒温培养箱中进行培养；重复步骤2-步骤5，以实现大量单孢的分离；
步骤6、菌物观察：单孢分离结束后，定期观察孢子萌发与生长情况，若单孢分离成功，培养基中会形成单一菌落，若失败，则需重新进行单孢分离。
进一步地，所述的微型吸取管采用玻璃制微型吸取管或塑料制微型吸取管，所述玻璃制吸管由胶头滴管加工而成，利用酒精喷灯将胶头滴管尖端软化后拉长拉细并稍微拉弯，胶头滴管尖端与胶头滴管的管体成30-45°角，再借助低倍显微镜将其制成不同规格的微型吸头，微型吸头的直径为10-100μm，微型吸头前端不易过长，1-2cm为宜；塑料制微型吸取管由塑料毛细管加工而成，借助实验用电炉将塑料毛细管加热软化，并迅速拉细拉长并拉成一定弧度，如此反复，直至不能拉细为止，再利用刀片将其截取所需长度，吸头前端1-2cm为宜，此种塑料制微型吸取管内径为100-300μm，将其接于玻璃制微型吸取管前端，并将接合处封死即能够使用。
本发明还公开了一种基于植物组织样品的植物病原菌物的纯化分离方法，其特征在于，采用上述的微型挑孢针，包括以下步骤：
步骤1、植物组织样品获得与前期处理：植物组织样品通常为野外采集样品，因此在单胞分离开始前，需要对其进行显微制片检测，检测其是否具有成熟的孢子产生，若无且子囊果未成熟，需对其进行诱导产孢，若有则需对样品进行表面消毒，即使用75％乙醇溶液消毒30sec，必要时使用升汞二次消毒，而后用无菌浮载液清洗数次，再用无菌滤纸擦拭吸干，备用；
步骤2、组织切片与单孢获得：组织切片前，需确定分生孢子器或子囊果的准确位置，而后使用解剖刀或刀片横向切取1～2块组织薄片，将其转移至无菌载玻片中央，滴1-3滴无菌浮载液，使用解剖针反复挤压薄片，以此释放单个孢子；
步骤3、单孢挑取前期准备：取出一无菌载玻片，用擦镜纸擦拭干净，镊子夹取一块wa培养基，置于载玻片中央待用，使用微量滴管将事先准备好的单孢悬浮液吸取转移至wa培养基上，避免将组织残渣吸入，使用接种针轻微扰动，在不破坏wa培养基的基础上，使孢子尽量分散开来；放置于低倍显微镜下观察，每视野内，以单个孢子分散排开为准，各孢子间隔以大于200μm为宜；将载玻片放置于无菌培养皿中，室温放置数分钟，直至wa培养基上的无菌浮载液蒸发完全，备用；
步骤4、使用微型吸取管吸取单孢：将载玻片放置于显微镜载物台上，低倍镜(4×)下寻找单孢，锁定单孢，转换高倍镜(10×)，调节视觉清晰，稳定载物台，眼手并用，使用无菌微型吸取管缓慢靠近单孢，在进入液层前需轻微挤压滴头，保持挤压程度不变，吸头缓慢接近孢子，接触孢子后缓慢释放滴头，孢子吸入吸头后，立即停止释放滴头，并迅速转移孢子于培养基中；
步骤5、单孢转移与培养：单孢黏附成功后，将其转移至pda培养基中，后放置于恒温培养箱中进行培养；重复步骤2-步骤5，以实现大量单孢的分离；
步骤6、菌物观察：单孢分离结束后，定期观察孢子萌发与生长情况，若单孢分离成功，培养基中会形成单一菌落，若失败，则需重新进行单孢分离。
本发明还公开了一种基于植物组织样品的植物病原菌物的纯化分离方法，采用上述的微型吸取器，包括以下步骤：
步骤1、植物组织样品获得与前期处理：植物组织样品通常为野外采集样品，因此在单胞分离开始前，需要对其进行显微制片检测，检测其是否具有成熟的孢子产生，若无且子囊果未成熟，需对其进行诱导产孢，若有则需对样品进行表面消毒，即使用75％乙醇溶液消毒30sec，必要时使用升汞二次消毒，而后用无菌浮载液清洗数次，再用无菌滤纸擦拭吸干，备用；
步骤2、组织切片与单孢获得：组织切片前，需确定分生孢子器或子囊果的准确位置，而后使用解剖刀或刀片横向切取1～2块组织薄片，将其转移至无菌载玻片中央，滴1-3滴无菌浮载液，使用解剖针反复挤压薄片，以此释放单个孢子；
步骤3、吸取单孢前期准备：取出一无菌载玻片，用擦镜纸擦拭干净待用。使用微量滴管将事先准备好的单孢悬浮液吸取转移至载玻片上，避免将组织残渣吸入，使用接种针轻微扰动，使孢子尽量分散开来。放置于低倍显微镜下观察，每视野内，以单个孢子分散排开为准，各孢子间隔以大于400μm为宜；各孢子间隔应尽可能大，且液层不易过厚，以1mm为宜；
步骤4、使用微型吸取管吸取单孢：将载玻片放置于显微镜载物台上，低倍镜(4×)下寻找单孢，锁定单孢，转换高倍镜(10×)，调节视觉清晰，稳定载物台，眼手并用，使用无菌微型吸取管缓慢靠近单孢，在进入液层前需轻微挤压滴头，保持挤压程度不变，吸头缓慢接近孢子，接触孢子后缓慢释放滴头，孢子吸入吸头后，立即停止释放滴头，并迅速转移孢子于培养基中；
步骤5、单孢转移与培养：单孢黏附成功后，将其转移至pda培养基中，后放置于恒温培养箱中进行培养；重复步骤2-步骤5，以实现大量单孢的分离；
步骤6、菌物观察：单孢分离结束后，定期观察孢子萌发与生长情况，若单孢分离成功，培养基中会形成单一菌落，若失败，则需重新进行单孢分离。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)使用器具较易制作和获得，适用性更广；
2)分离方法多样，根据不同分离对象可做灵活选择与调整；
3)分离操作更为简化，节约了时间和成本；
4)分离所用器具的制作更为精巧，制作规格能够确保在微米级，最小能够达到10μm甚至更低。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明基于纯培养菌物的植物病原菌物的纯化分离方法的工艺流程图；
图2是本发明基于植物组织样品的植物病原菌物的纯化分离方法的工艺流程图；
图3是本发明微型挑孢针的结构示意图；
图4是本发明微型挑孢针的另一种结构示意图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明所用器具如下：
显微镜、解剖镜、超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、微型吸取管(或微型挑孢针)、微量滴管、解剖刀(或刀片)、解剖针、载玻片、硫酸链霉素(100万单位)、pda培养基(或wa培养基)、无菌浮载液、75％乙醇溶液(或升汞)。
本发明所用的关键器具如下：
微型吸取管：微型吸取管分两种，一种为玻璃制吸管，一种为塑料制吸管。玻璃制微型吸取管由胶头滴管加工而成，即利用酒精喷灯将胶头滴管尖端软化后拉长拉细并稍微拉弯(30-45°角)，再借助低倍显微镜将其制成不同规格的微型吸头(φ＝10-100μm)，微型吸头前端不易过长，1-2cm为宜。塑料制微型吸取管由塑料毛细管(分硬管与软管两种)加工而成，即借助实验用电炉将塑料毛细管加热软化，并迅速拉细拉长并拉成一定弧度，如此反复，直至不能拉细为止，再利用刀片将其截取所需长度(吸头前端1-2cm为宜)，此种微型吸头内径为100-300μm，将其接于玻璃制微型吸取管前端，并将接合处封死即可使用。
微型挑孢针：如图3所示，由针头2和手柄1两部分组成，用昆虫针、缝线针、细钢丝等作针头，也可以用发尖、眉毛、睫毛(如图4所示)等作针头，用带橡皮擦铅笔、接种针手柄、解剖针、玻璃棒、细秆(木质、塑料或高分子材料制)等作手柄。针头需用磨砂纸将针尖磨细(发尖、眉毛、睫毛除外，其直径为15-25μm)，保证尖端300μm长度均较细，并将尖端基部靠后约300μm处折成30-45°角，针头部分不易过长，总长约1.5-3.0cm最佳。手柄应尽可能细长(φ＝0.5cm，长10cm)，以玻璃棒最佳，用酒精喷灯软化玻璃棒后将针头嵌入其中即可，另对于发尖、眉毛或睫毛制针头，以解剖针为手柄最佳，用粘合物(502、白乳胶等)将其贴于解剖针针尖处即可。
pda培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、蒸馏水1000ml，灭菌后倒平板前，以每300ml培养基中加入12mg/ml的硫酸链霉素1ml(硫酸链霉素用于抑制多数细菌生长)，混匀后，倒平板备用。
wa培养基：即3％水琼脂培养基，由蒸馏水与琼脂粉配制而成。配置好后，灭完菌后倒平板，平板厚度控制在3mm左右，待凝固后，用刀片划取若干长4cm×宽2cm琼脂块，备用。
无菌浮载液：由蒸馏水和硫酸链霉素制成。即将蒸馏水灭菌取出，以300ml蒸馏水中加入12mg/ml的硫酸链霉素1ml，混匀备用。wa培养基用于在显微镜下挑取目标物使用，制作时要求wa培养基尽量薄且透明，过薄不易挑取目标物也容易损坏，过厚其透明度不够，难以发现目标物，厚度易控制在2-4mm。
单孢分离技术的操作流程因分离材料不同存在一些差异，分离材料主要有：纯培养菌物、植物组织样品两种。纯培养菌物基本为无性孢子，而植物组织样品除此以外，还存在有性孢子。因此，操作流程分两种情况进行，具体操作见实施例1-4。
实施例1基于纯培养菌物的植物病原菌物的纯化分离方法
本方法采用微型挑孢针，包括以下步骤：步骤1、制备纯培养菌物单孢：取纯培养菌物，利用接种针挑取菌块接种于pda培养基中(视情况，也可用其他培养基)，接种1-3皿，转移至恒温培养箱中，25℃恒温培养，1-7d，待其产孢；在纯培养菌物培养过程中，定时显微观察，若已产孢，即可进行下一步，若未产孢继续培养，若长时间培养均未产孢，需考虑更换培养基，重复上述步骤，直至产孢；
步骤2、挑取单孢前期准备。取出一无菌载玻片，用擦镜纸擦拭干净，镊子夹取一块wa培养基，置于载玻片中央待用；
步骤3、于wa培养基上，滴1-2滴无菌浮载液，用接种针在产孢菌落组织中轻微晃动(避免挑取菌丝)，将接种针针头黏附的孢子置于无菌浮载液中，释放孢子于无菌浮载液中，使用接种针轻微扰动，在不破坏wa培养基的基础上，使孢子尽量分散开来。放置于低倍显微镜下观察，每视野内，以单个孢子分散排开为准，各孢子间隔以大于200μm为宜(若孢子产量较多，需使用无菌浮载液进行稀释)。将载玻片放置于无菌培养皿中，室温放置数分钟，直至wa培养基上的无菌浮载液蒸发完全，备用。
步骤4、使用微型挑孢针挑取单孢：将载玻片放置于显微镜载物台上，低倍镜(4×)下寻找单孢，锁定单孢，转换高倍镜(10×)，调节视觉清晰，稳定载物台，眼手并用，使用无菌微型挑孢针缓慢接近单孢，轻微碰撞单孢使其黏附于针头尖端。若针头尖端难以黏附单孢时，可事先将针头浸没于无菌浮载液中，以此增加黏附力度。
步骤5、单孢转移与培养：单孢黏附成功后，将其转移至pda培养基中，后放置于恒温培养箱中进行培养。反复第四至六步操作，以实现大量单孢的分离。
步骤6、菌物观察：单孢分离结束后，定期观察孢子萌发与生长情况，若单孢分离成功，培养基中会形成单一菌落，若失败，则需重新进行单孢分离。
实施例2基于纯培养菌物的植物病原菌物的纯化分离方法
本方法采用微型吸取管，包括以下步骤：
步骤1、培养纯培养菌物单孢：取纯培养菌物，利用接种针挑取菌块接种于pda培养基中，接种1-3皿，转移至恒温培养箱中，25℃恒温培养，1-7d，待其产孢；在纯培养菌物培养过程中，定时显微观察，若已产孢，即可进行下一步，若未产孢继续培养，若长时间培养均未产孢，需考虑更换培养基，重复上述步骤，直至产孢；
步骤2、吸取单孢前期准备。取出一无菌载玻片，用擦镜纸擦拭干净待用；于载玻片上，滴1-2滴无菌浮载液，用接种针在产孢菌落组织中轻微晃动(避免挑取菌丝)，将接种针针头黏附的孢子置于无菌浮载液中，释放孢子于无菌浮载液中，使用接种针轻微扰动无菌浮载液，使孢子尽量分散开来。
步骤3、放置于低倍显微镜下观察，每视野内，以单个孢子分散排开为准，各孢子间隔以大于400μm为宜。各孢子间隔应尽可能大，且液层不易过厚，以1mm为宜。
步骤4、使用微型吸取管吸取单孢：将载玻片放置于显微镜载物台上，低倍镜(4×)下寻找单孢，锁定单孢，转换高倍镜(10×)，调节视觉清晰，稳定载物台，眼手并用，使用无菌微型吸取管缓慢靠近单孢，在进入液层前需轻微挤压滴头，保持挤压程度不变，吸头缓慢接近孢子，接触孢子后缓慢释放滴头，孢子吸入吸头后，立即停止释放滴头，并迅速转移孢子于培养基中。
步骤5、单孢转移与培养：单孢黏附成功后，将其转移至pda培养基中，后放置于恒温培养箱中进行培养；重复步骤2-步骤5，以实现大量单孢的分离；
步骤6、菌物观察：单孢分离结束后，定期观察孢子萌发与生长情况，若单孢分离成功，培养基中会形成单一菌落，若失败，则需重新进行单孢分离。
实施例3基于植物组织样品的植物病原菌物的纯化分离方法
本方法采用微型挑孢针，包括以下步骤：
步骤1、植物组织样品获得与前期处理：植物组织样品通常为野外采集样品，因此在单胞分离开始前，需要对其进行显微制片检测，检测其是否具有成熟的孢子产生，若无且子囊果未成熟，需对其进行诱导产孢，若有则需对样品进行表面消毒，即使用75％乙醇溶液消毒30sec.，必要时使用升汞二次消毒，而后用无菌浮载液清洗数次，再用无菌滤纸擦拭吸干，备用。
步骤2、组织切片与单孢获得：组织切片前，需确定分生孢子器或子囊果的准确位置，而后使用解剖刀或刀片横向切取1～2块组织薄片，将其转移至无菌载玻片中央，滴1-3滴无菌浮载液，使用解剖针反复挤压薄片，以此释放单个孢子。
步骤3、单孢挑取前期准备。取出一无菌载玻片，用擦镜纸擦拭干净，镊子夹取一块wa培养基，置于载玻片中央待用。使用微量滴管将事先准备好的单孢悬浮液吸取转移至wa培养基上(避免将组织残渣吸入)，使用接种针轻微扰动，在不破坏wa培养基的基础上，使孢子尽量分散开来。放置于低倍显微镜下观察，每视野内，以单个孢子分散排开为准，各孢子间隔以大于200μm为宜(若孢子产量较多，需使用无菌浮载液进行稀释)。将载玻片放置于无菌培养皿中，室温放置数分钟，直至wa培养基上的无菌浮载液蒸发完全，备用。
步骤4、使用微型吸取管吸取单孢：将载玻片放置于显微镜载物台上，低倍镜(4×)下寻找单孢，锁定单孢，转换高倍镜(10×)，调节视觉清晰，稳定载物台，眼手并用，使用无菌微型吸取管缓慢靠近单孢，在进入液层前需轻微挤压滴头，保持挤压程度不变，吸头缓慢接近孢子，接触孢子后缓慢释放滴头，孢子吸入吸头后，立即停止释放滴头，并迅速转移孢子于培养基中；
步骤5、单孢转移与培养：单孢黏附成功后，将其转移至pda培养基中，后放置于恒温培养箱中进行培养；重复步骤2-步骤5，以实现大量单孢的分离；
步骤6、菌物观察：单孢分离结束后，定期观察孢子萌发与生长情况，若单孢分离成功，培养基中会形成单一菌落，若失败，则需重新进行单孢分离。
实施例4基于植物组织样品的植物病原菌物的纯化分离方法
本方法采用微型吸取器，包括以下步骤：
步骤1、植物组织样品获得与前期处理：植物组织样品通常为野外采集样品，因此在单胞分离开始前，需要对其进行显微制片检测，检测其是否具有成熟的孢子产生，若无且子囊果未成熟，需对其进行诱导产孢，若有则需对样品进行表面消毒，即使用75％乙醇溶液消毒30sec，必要时使用升汞二次消毒，而后用无菌浮载液清洗数次，再用无菌滤纸擦拭吸干，备用；
步骤2、组织切片与单孢获得：组织切片前，需确定分生孢子器或子囊果的准确位置，而后使用解剖刀或刀片横向切取1～2块组织薄片，将其转移至无菌载玻片中央，滴1-3滴无菌浮载液，使用解剖针反复挤压薄片，以此释放单个孢子；
步骤3、吸取单孢前期准备：取出一无菌载玻片，用擦镜纸擦拭干净待用。使用微量滴管将事先准备好的单孢悬浮液吸取转移至载玻片上(避免将组织残渣吸入)，使用接种针轻微扰动，使孢子尽量分散开来。放置于低倍显微镜下观察，每视野内，以单个孢子分散排开为准，各孢子间隔以大于400μm为宜(若孢子较多，需用无菌浮载液进行稀释，或用接种针在植物组织中直接沾取)。各孢子间隔应尽可能大，且液层不易过厚，以1mm为宜。
使用微型吸取管吸取单孢：将载玻片放置于显微镜载物台上，低倍镜(4×)下寻找单孢，锁定单孢，转换高倍镜(10×)，调节视觉清晰，稳定载物台，眼手并用，使用无菌微型吸取管缓慢靠近单孢，在进入液层前需轻微挤压滴头，保持挤压程度不变，吸头缓慢接近孢子，接触孢子后缓慢释放滴头，孢子吸入吸头后，立即停止释放滴头，并迅速转移孢子于培养基中；
步骤5、单孢转移与培养：单孢黏附成功后，将其转移至pda培养基中，后放置于恒温培养箱中进行培养；重复步骤2-步骤5，以实现大量单孢的分离；
步骤6、菌物观察：单孢分离结束后，定期观察孢子萌发与生长情况，若单孢分离成功，培养基中会形成单一菌落，若失败，则需重新进行单孢分离。
本发明的优点还在于：1、微型吸取管制备：目前，对于超微量吸管还没有市场产品可以购买，因此，只能进行人工制作。玻璃制吸取管借助酒精喷灯将胶头滴管管头软化，并迅速拉长拉细，同时弯曲形成一定角度，拉制过程中，注意快速、准确、平稳，这样拉制出来的微型吸头最佳；塑料制吸取管同样需注意以上问题。相比较而言，塑料制吸取管更具有实用性，其微型吸头具韧性不易折断损毁，重复利用率较高，一旦制成可长期使用，但其内径最低仅达100μm，而玻璃制微型吸头可达10μm，这是目前塑料制微型吸头尚需改进的地方。
2、微型挑孢针制备：微型挑孢针针头的制作是关键，针头需反复在磨砂纸上磨蹭，一旦制成可长期使用；发尖或眉毛制作针头，其制作较为简单。
3、wa培养基：wa培养基在使用微型挑孢针挑取单孢时才使用，培养基要求透明且具韧性，因此琼脂粉加入量比常规培养基多，同时需经过多次过滤直至无色透明为止，方可灭菌备用。
4、单孢分散：单孢分散是获取单胞的前提，也是挑取单孢成功与否的关键。无论是在载玻片上还是在wa琼脂块上，均应尽可能的将孢子分散开，以为挑取单孢提供可能。此外，在用微型吸取管吸取单孢前，除将单孢分散开外，还应使浮载液尽可能平铺于载玻片表面，使液层不易过厚。
5、单孢挑取(或吸取)与转移：单孢挑取(或吸取)是整个过程中难度最大的环节，但一旦上手其操作也较简单。操作过程中，在显微镜下，需眼、手协调并用，最好在载物台旁放置一个撑手垫，略高于载物台即可，以防治手臂挑取单孢时晃动，同时也防治手臂压碰载物台使视觉模糊，同时在载物台上适宜位置安置一个临时“丫”形小支架，用以支撑微型吸取管或微型挑孢针，进一步稳固防治晃动。单孢挑取(或吸取)成功后，转移至pda培养基中即可。
6、无菌环境：无菌环境包括三个层面，一是整个操作环境的无菌，需在超净工作台中进行，二是操作过程中所用器具的灭菌处理，三是操作者的消毒处理。
7、分离对象
单孢分离技术虽然是针对单孢分离而来的技术，但在实际操作中，根据研究目的和分离对象的不同，借助实验器具，对菌物的分生孢子器、分生孢子、子囊果、子囊、子囊孢子等均能进行单独分离。
为对比本纯化分离方法的有益效果，实验选取了琼脂块直接切取法、毛细管分离法(打菌饼)两种方法与之对比，实验分离对象为：植物组织样品为竹生节菱孢菌(arthriniumsp.)；纯培养菌物为拟盘多毛孢菌(pestalotiopsissp.)。以单个平板接入单个孢子，单孢萌发即为成功，单孢未萌发或被污染即为失败，以此对比分离效果。实验对比结果见下表1。
表1各方法的纯化分离效果
注：分离时间是指在显微镜下寻找单孢开始，直至单孢分离转移至pda培养基中为止，这一过程所用时间。此外，依据文献资料，采用琼脂块直接切取法和毛细管分离法其整个操作过程所需时间要远长于本方法，本方法在保证单孢分离前提下做了完善与简化。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。