水稻孕穗期耐冷性相关蛋白CTB4b及编码基因与应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种水稻孕穗期耐冷性相关蛋白ctb4b及编码基因与应用。
背景技术：
：水稻是一种重要的粮食作物，全世界有超过一半以上的人以其为主食。水稻又是一种起源于热带和亚热带地区的低温敏感作物。随着水稻种植面积的不断扩大，低温成为限制水稻种植的主要因素之一。在我国，东北地区平均3-4年中就会有一年遭受低温冷害。长江中下游及华南地区的稻作会受到“寒露风”和“倒春寒”的影响。2009年我国东北地区的持续低温阴雨天气，造成农作物生长发育延迟，水稻结实率降低，严重影响产量。几乎在中国所有的种植地区中，水稻在各个生长时期都容易遭受到冷害影响，由此每年可以造成300-500万吨的粮食减产。水稻低温冷害主要指水稻遭遇连续或短期低温最低临界温度以下的低温影响，从而使水稻生育延迟，严重时还造成营养或生殖器官遭到破坏，从而导致水稻不能正常发育而减产。水稻在全生育期都容易遭遇低温冷害。根据低温发生的时期，可以分为芽期冷害、苗期冷害、孕穗期冷害和开花期冷害。孕穗期冷害是指水稻从生殖生长到开始抽穗开花期间受到低温冷害，最终导致花粉发育不正常继而影响正常开花授粉形成空粒。开花期冷害是指在水稻开花期遇到低温，导致花药不能正常裂开散粉、散落到柱头上的花粉不能正常地萌发受精，直接影响受精结实，产生空粒的一种冷害，由于这类冷害的发生时期与孕穗期冷害十分接近，生产实际中有时较难将两者严格分开来，常将两者合称为孕穗开花期冷害。这其中因孕穗期时遭遇的冷害将会对产量造成不可逆的损失而显的尤为重要。因此，孕穗期冷害是影响水稻产量最严重的时期，对水稻孕穗期耐冷性研究具有十分重要的意义。但是利用传统育种方法培育耐冷水稻品种周期长，进展比较缓慢，而利用基因工程技术可以直接在基因水平上改造植物的遗传背景，定向改造植物的遗传性状。发掘水稻孕穗期耐冷基因对培育耐冷水稻新品种具有十分重要的理论和实践意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种水稻孕穗期耐冷性相关蛋白ctb4b及编码基因与应用。第一方面，本发明要求保护一种蛋白质。本发明所要求保护的蛋白质来源于水稻(oryzasatival.)，命名为ctb4b，具体可为如下任一：(a1)seqidno.2所示的蛋白质；(a2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(a3)与(a1)或(a2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。进一步地，所述标签包括但不限于如下所示：表：标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl第二方面，本发明要求保护编码所述蛋白质的核酸分子。所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。在本发明中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因；所述基因具体为如下任一所示dna分子：(b1)seqidno.1所示的dna分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质的dna分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述蛋白质的dna分子。第三方面，本发明要求保护含有上述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pmdc32、pcambia3301、pcambia1300、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛素基因ubiquitin启动子(pubi)、胁迫诱导型启动子rd29a等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。在本发明中，所述重组载体中启动所述基因表达的启动子为35s启动子。更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述重组载体为在pmdc32载体多克隆位点(如kpni和paci)中插入所述基因(seqidno.1)后得到的重组质粒。第四方面，本发明要求保护所述蛋白质或所述核酸分子或所述表达盒或所述重组载体或所述重组菌在调控植物耐低温性中的应用。在所述应用中，所述蛋白质在所述植物中活性越高所述植物的耐低温性越强；所述蛋白质在所述植物中的活性越低，所述植物的耐低温性越弱。第五方面，本发明要求保护如下方法i或方法ii：方法i：一种培育耐低温性增强的植物的方法，具体可包括使受体植物中所述蛋白质的表达量和/或活性升高的步骤。方法ii：一种培育耐低温性减弱的植物的方法，具体可包括使受体植物中所述蛋白质的表达量和/或活性降低的步骤。在所述方法i中，所述使受体植物中所述蛋白质的表达量和/或活性升高是通过向所述受体植物中导入所述核酸分子来实现的。进一步地，可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。如通过重组载体的形式(如前文所述的重组载体)将所述核酸分子导入所述受体植物中。在所述方法ii中，所述使受体植物中所述蛋白质的表达量和/或活性降低是通过对所述受体植物中所述核酸分子进行敲除或抑制表达来实现的。进一步地，可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如crispr/cas9核酸酶)对所述核酸分子进行特异性编辑，从而敲除其在所述受体植株中的表达，或者通过rnai手段对所述核酸分子进行抑制表达。在所述方法i和所述方法ii中，将携带有所述核酸分子的所述重组载体或者用于对所述受体植物中所述核酸分子进行敲除或抑制表达时采用的基因编辑工具导入所述受体植物，具体可为：通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。在第四方面所述的应用和第五方面所述的方法中，所述耐低温性具体可为孕穗期对低温的耐受性。在本发明的一个实施例中，所述耐低温性增强具体体现为转入所述蛋白质的编码基因(ctb4b基因)的植株在孕穗期受到低温胁迫后，其结实率高于未经转基因的受体植株。在第四方面所述的应用和第五方面所述的方法中，所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物。进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。更进一步地，所述禾本科植物可为水稻。更加具体地，在本发明的一个实施例中，所述水稻为水稻品种towada。本发明所提供的ctb4b基因可以高水稻孕穗期耐冷性，利用该基因可以对水稻品种的孕穗期耐冷性进行改良，从而扩大水稻的种植区域，保障我国晚季稻及其寒地水稻种植区域的稳产性。附图说明图1为亲本kmxbg、towada及近等基因系nil1913在北京(正常温度)和云南(生育期低温，cs-haa)的表型图。图2为亲本kmxbg、towada及近等基因系nil1913在北京(正常温度)和云南(生育期低温，cs-haa)的结实率统计图。图3为ctb4b在nil1913和towada不同组织中的表达模式分析图。内参为osactin1基因。stem为茎，leaf为成熟的叶片，youngleaf为幼叶，sheath为叶鞘，root为根，node为茎节，yp10为10cm穗，yp15-20为15-20cm穗。图4为ctb4b在nil1913和towada穗部冷诱导下表达模式分析图。内参为osactin1基因。图5为pcr鉴定t0代ctb4b过表达植株。图6为ctb4b过表达植株不同转基因株系实时荧光定量pcr检测结果。图7为不同的冷处理方式表示图。图8为ctb4b过表达植株孕穗期自然低温处理后田间和穗部表型图。图9为ctb4b过表达植株及对照植株在高海拔地区种植、冷水灌溉处理、人工气候室冷处理后结实率统计图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。水稻品种kmxbg：文献：戴陆园等.云南稻种昆明小白谷耐冷性指标性状的遗传分析.中国水稻科学,1999,13(2):73-76.公众可从中国农业大学获得。水稻品种towada：文献：戴陆园等.云南稻种昆明小白谷耐冷性指标性状的遗传分析.中国水稻科学,1999,13(2):73-76.公众可从中国农业大学获得。水稻近等基因系nil1913：本实验室构建和保存。文献：zhanyingzhang*,jinjieli*,yinghuapan*,jilongli*,leizhou*,honglishi*,yawenzeng,haifengguo,shumingyang,weiweizheng,jianpingyu,xingmingsun,ganglingli,yanglinding,liangma,shiquanshen,luyuandai,hongliangzhang,shuhuayang,yanguo,zichaoli#.naturalvariationinctb4aenhancesriceadaptationtocoldhabitats.naturecommunications,2017,8:14788.公众可以从中国农业大学获得。过表达载体pmdc32：文献:markd.curtisandueligrossniklaus.agatewaycloningvectorsetforhigh-throughput.plantphysiology,october2003,vol.133,pp.462–469.公众可从中国农业大学获得。根癌农杆菌eha105：文献：高世武等.影响根癌农杆菌eha105感受态细胞转化效率因素的研究.热带生物学报.2012年3月第3卷第1期，公众可从中国农业大学获得。实施例1、ctb4b基因的定位及克隆1、ctb4b基因的获得利用耐冷品种kmxbg和冷敏感品种towada构建的耐冷的近等基因系(nil1913)，进而用近等基因系nil1913与towada构建分离群体，考察亲本在北京和昆明的结实率，作为定位的表型数据(图1，图2)。同时，从均匀分布在水稻12条染色体上的1000对ssr标记中筛选出的多态性标记，对定位群体进行基因分型。利用mapmaker3.0进行标记连锁作图，kosambi方法计算遗传距离。qtl扫描采用qtlicimapping3.0(王建康等，2009)，以lod值3.0作为qtl存在的阈值，同时计算加性和显性效应。最终在两个环境中均能检测到微效qtlqctb4-1，该qtl位于rm518-rm6770之间，解释表型的贡献率分别为0.9％和3.93％。然后利用qctb4-1两侧标记rm2146和rm6770对3102个单株bc6f2群体筛选，并且利用f3家系进行表型确定。最终将目的基因定位在标记rm16349和sts12之间，物理距离为134.8kb。该区间内共有4个候选基因，其中基因os04g0131900编码一个udp-葡萄糖甾醇葡糖基转运蛋白。该基因只在nil1913和towada中的编码区中均存在2处snp差异，是可能的候选基因，命名为ctb4b。ctb4b基因的核苷酸序列为seqidno.1，其编码的蛋白为ctb4b，该蛋白的氨基酸序列为seqidno.2。2、内源ctb4b基因的表达模式正常处理：取nil1913和towada正常种植条件下不同组织的样品，包括根、茎、茎节，幼叶，成熟叶、叶鞘、10cm穗、15-20cm穗。取样后用液氮速冻，-80℃保存备用。低温胁迫处理：将正常条件下生长至孕穗期的nil和towada移栽至18度的人工气候室内，分别取处理0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d时叶片和穗部样品，液氮速冻，-80℃保存备用。提取上述各种处理的样品取总rna，利用反转录酶m-mlv反转录合成cdna第一链，以该cdna第一链为模板，采用引物进行实时定量分析，以osactin1为内参基因；ctb4b扩增引物：ctb4b-rt42-3f：5′-ctggtattcctttcaaagtggat-3′；ctb4b-rt42-3r：5′-ccaagccaaatcatagagtcaac-3′。osactin1扩增引物：actin1-f：5′-acaggtattgtgttggactctgg-3′；actin1-r：5′-agtaaccacgctccgtcagg-3′。ctb4b组织表达模式如图3，可以看出，ctb4b基因是一个在不同组织中均表达的基因，尤其在根、茎节和穗中表达丰度最高。ctb4b冷诱导表达分析如图4，可以看出，在nil1913和towada中都受到低温诱导，说明ctb4b基因是一个与低温胁迫相关的基因。实施例2、ctb4b基因的功能验证一、ctb4b过表达重组载体的构建提取水稻品种kmxbg的rna并反转录成cdna，随后以该cdna为模板，用ctb4b-1f和ctb4b-1r进行pcr扩增，得到1830bp的pcr产物，经过测序，该pcr产物为ctb4b基因cds序列，为序列表序列1所示。ctb4b-1f：5′-cggggtaccatggcctccgccgccgagg-3′(下划线部分为限制性内切酶kpni的识别序列)；ctb4b-1r：5′-ccttaattaactatgagcaaccaagacattta-3′(下划线部分为限制性内切酶paci的识别序列)。将seqidno.1所示dna片段取代表达载体pmdc32上kpni和paci酶切位点间的片段，得到重组载体35s::ctb4b，即为ctb4b过表达重组载体，其中ctb4b基因插入双烟草花叶病毒启动子35s下游。二、转ctb4b水稻的获得1、重组菌将上述一制备的重组载体35s::ctb4b冻融法转化根癌农杆菌eha105，得到重组菌eha105/35s::ctb4b，用于侵染转基因受体品种的愈伤。2、转ctb4b水稻采取经典的农杆菌介导的愈伤侵染方法，具体步骤如下：(1)胚性愈伤的获得：将成熟的towada种子(以下也称为野生型水稻)去壳后用75％酒精消毒2min，再用20％naclo消毒40min，无菌水漂洗3-5次，风干。接种于诱导培养基，28℃暗培养2周，将胚性愈伤剥下，继代至新的诱导培养基，继代培养2周(继代两次)。(2)制备侵染液：吸取保存的农杆菌液20μl，涂布到yep(含20mg/l利福平和相应抗生素)固体培养基上，28℃倒置暗培养2d，刮取少量农杆菌至aam液体培养基中(含10mm乙酰丁香酮)，菌液浓度od600约为0.3。(3)共培养：挑选自然分散、颜色鲜黄、直径约为3～5mm的颗粒状愈伤组织至三角瓶中，加入制备好的侵染液，侵染10min，用无菌滤纸吸取多余的侵染液，置于铺有一层滤纸的共培养培养基上，19℃共培养2-3d。(4)抗性愈伤组织的筛选：将共培养后的愈伤组织取出，用无菌水快速摇动清洗5～6次，再用含250mg/l头孢霉素和250mg/l羧苄青霉素的无菌水清洗20min，最后置于无菌滤纸上沥干3h。然后移到筛选培养基上。两周一次，筛选两次。(5)分化：将筛选获得的抗性愈伤组织接入预分化培养基中，26℃，暗培养2周，然后转移至分化培养基上，光照培养2-3周，得到再生转基因幼苗植株。(6)将幼苗移至生根培养基上，待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基，炼苗7d，移至大田栽种，直至成熟，得到t0代转ctb4b水稻。上述转基因过程中所用培养基配方如下：(1)胚性愈伤诱导及继代培养基：nb基本培养基(含2mg/l2,4-d)。(2)共培养培养基：nb基本培养基(含2mg/l2,4-d，10g/l葡萄糖，10mm乙酰丁香酮,ph5.6)。(3)筛选培养基：nb基本培养基(含2mg/l2,4-d，400mg/l特美汀和50mg/l潮霉素，ph5.8)。(4)预分化培养基：nb基本培养基(含1mg/l6-ba，2mg/lnaa，5mg/laba，50mg/l潮霉素，ph5.8)。(5)分化培养基：nb基本培养基(含2mg/l6-ba，1mg/lnaa，1mg/lkt，50mg/l潮霉素，ph5.8)。(6)生根培养基：1/2ms培养基基本成分(含0.5mg/lnaa,0.25mg/l多效唑，ph5.8)。(7)nb培养基基本成分包括n6大量元素，b5微量元素，b5有机成分，150mg/l肌醇，300mg/l水解酪蛋白，500mg/l谷氨酰胺，600mg/l脯氨酸，30g/l蔗糖，3g/l植物凝胶。采用同样的方法将空载体pmdc32转入野生型水稻中，得到t3代转pmdc32水稻(空载对照)。3、分子鉴定提取t0代转ctb4b水稻基因组dna，用引物为5′-aggaccagaaggcaagaatc-3′和5′-gatgtgctgcaaggcgatta-3′进行pcr扩增，得到1583bp的pcr产物(靶基因为hyg)为阳性t0代转ctb4b水稻，不含有目的片段的植株为阴性，部分样本的鉴定结果如图5所示(oe-234、oe-235、oe-236、oe-237、oe-238)。阳性t0代收种、播种，得到t3代。提取t3代转ctb4b水稻株系rna，反转录得到cdna，以ctb4b扩增引物ctb4b-rt42-3f：5′-ctggtattcctttcaaagtggat-3′；ctb4b-rt42-3r：5′-ccaagccaaatcatagagtcaac-3′。进行扩增，以osactin1为内参基因。osactin1扩增引物：actin1-f：5′-acaggtattgtgttggactctgg-3′；actin1-r：5′-agtaaccacgctccgtcagg-3′。结果如图6所示，可以看出，与野生型水稻(towada)相比，oe236、oe237株系中ctb4b基因表达量均提高10倍以上。后续选用表达较高的t3代转ctb4b水稻株系oe236和oe237进行耐冷鉴定实验。三、转ctb4b水稻的耐冷性鉴定耐冷性鉴定采用三种方法，分别是孕穗期大田(cs-dw)50cm深冷水池(18℃)7天，孕穗期人工气候室(cs-pt)18℃处理7天和云南自然(cs-haa)鉴定等方法多方验证ctb4b的孕穗期耐冷功能(图7)。选取野生型水稻(冷敏感品种towada)、t3代转ctb4b水稻株系oe236、oe237和t3代转pmdc32水稻(空载对照)处于孕穗期的主穗挂牌，做上记号。胁迫结束后，将参试材料复种到大田，恢复水稻生长，成熟后考察挂牌主穗的结实率，以正常生长的植株结实率为对照，计算相对结实率(相对结实率＝处理后的结实率/正常条件下结实率*100％)，作为耐冷性鉴定指标。云南自然鉴定则在云南黑龙潭地区，海拔1916米，常年气温19-22℃，从播种至孕穗期均处在自然低温状态下生长，成熟后考察主穗结实率。上述每个材料设置3个重复，每个重复10株。在云南全生育期的自然低温处理下结果如图8和图9所示，过表达株系的结实率均显著超过towada。孕穗期大田50cm深冷水池(18℃)7天结果如图9所示，可以看出，在大田冷水灌溉7天的胁迫下，过表达株系的结实率均显著超过towada。孕穗期人工气候室18℃处理7天结果如图9所示，towada的相对结实率为39.40％，超表达的相对结实率为69.80％和65.42％，也是显著高于towada。对于上述各方法，t3代转pmdc32水稻(空载对照)的结实率均与野生型基本一致，无统计学差异。上述结果表明，孕穗期遭遇低温主要影响了结实率的高低，不同地点、不同方式处理方式下，过表达株系的主穗结实率都显著高于冷敏感亲本towada，说明基因cbt4b具有提高孕穗期耐低温的功能，是一个起正向长效作用的基因，能够在冷胁迫下降低温度对结实率的影响。<110>中国农业大学<120>水稻孕穗期耐冷性相关蛋白ctb4b及编码基因与应用<130>gncln180362<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>1830<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>1atggcctccgccgccgaggaggccaagggcgtggaggaaggaggaggaggagccagcgcc60aacggcggcgacaaccccgccaccgccaccgcctccgcctccgccgcggccgcggcctcg120tcgtcttcccccgctgatgacaggggcctccccagatcaagcactatgccaggtgggatt180aataatgttgaaataaccaatgaaactgccggtccatctaatctggaaagatcaagaaca240gagaggcgtcgacaaaacaatccagctgatgatcctaccaaacagttatttgatgataaa300atttccctaaaaaagaagctcaaaatgataaatcggatagctacagtgaaacatgatgga360actgtggtggttgatgtgccaagttctctggaaacaagtacaactgatggtgtagcatat420gatggctatagtgatgttactgttgaggaaccattggatggagcagacatacctgtgagg480cctcctatgcaaattgttattcttattgtgggcacaagaggtgatgttcagccattcatt540gctataggcaaacgcttacaggattatggacaccgtgtgagattggcaacccatgcaaac600tttaaggagttcgttctaacggctggtctggagtttttccctcttggcggtgatccaaaa660atacttgctgaatacatggtgaagaataaaggattcttgccttctggtccttcagaaatt720cctattcagaggaaacagatgaaagaaattatattctctttgctacctgcgtgcaaggag780cctgatcctgacactggtattcctttcaaagtggatgctatcattgctaaccctccagca840tatggacatactcatgtggcagaggcactaaaagtacctattcatatattctttaccatg900ccatggacgccaactagtgaattcccccatcctctttctcgtgtgaaacaagcggctgga960tatcgactttcttatcaaattgttgactctatgatttggcttggtatccgagatatgata1020aatgaatttaggaagaagaagctgaagttgcgtccggtaacatacctaagtggtgcacag1080ggttctgggaatgacattcctcatggttacatctggagtcctcaccttgttccaaaaccg1140aaagattggggccccaagattgatgttgttggattttgctttcttgatcttgcttccaat1200tatgtgcctcctgaaccacttataaaatggcttgaagctggtgacaagcccatatacgtt1260gggtttggtagtcttccagttcaagatccagcaaagatgactgaagtcattgtcaaagca1320cttgaaataactggacagagaggtatcatcaacaaaggttggggtgggcttggaacattg1380gcagagccaaaagattttgtatatctacttgataactgcccccatgactggctcttcctg1440cagtgtaaagcagtggtacatcatggcggtgctggaacaacagctgctggcctcaaagca1500gcgtgccctacaactattgtacctttctttggtgaccaaccattctggggagaccgagtg1560catgctagaggggtagggcctctacctataccagttgatcaattcagcttgcaaaaattg1620gttgatgctataaacttcatgatggagccaaaggtgaaagacaatgccgtggagcttgcc1680aaggccatggaatctgaagatggtgtgtcaggtgcagtcagggcattcctcagacatcta1740ccttcaagagcagaggaaacagcacctcagcagacatccagcttcctggaattcttaggt1800cctgtaagtaaatgtcttggttgctcatag1830<210>2<211>609<212>prt<213>水稻（oryzasatival.）<400>2metalaseralaalagluglualalysglyvalglugluglyglygly151015glyalaseralaasnglyglyaspasnproalathralathralaser202530alaseralaalaalaalaalaserserserserproalaaspasparg354045glyleuproargserserthrmetproglyglyileasnasnvalglu505560ilethrasngluthralaglyproserasnleugluargserargthr65707580gluargargargglnasnasnproalaaspaspprothrlysglnleu859095pheaspasplysileserleulyslyslysleulysmetileasnarg100105110ilealathrvallyshisaspglythrvalvalvalaspvalproser115120125serleugluthrserthrthraspglyvalalatyraspglytyrser130135140aspvalthrvalglugluproleuaspglyalaaspileprovalarg145150155160proprometglnilevalileleuilevalglythrargglyaspval165170175glnpropheilealaileglylysargleuglnasptyrglyhisarg180185190valargleualathrhisalaasnphelysgluphevalleuthrala195200205glyleugluphepheproleuglyglyaspprolysileleualaglu210215220tyrmetvallysasnlysglypheleuproserglyprosergluile225230235240proileglnarglysglnmetlysgluileilepheserleuleupro245250255alacyslysgluproaspproaspthrglyileprophelysvalasp260265270alaileilealaasnproproalatyrglyhisthrhisvalalaglu275280285alaleulysvalproilehisilephephethrmetprotrpthrpro290295300thrserglupheprohisproleuserargvallysglnalaalagly305310315320tyrargleusertyrglnilevalaspsermetiletrpleuglyile325330335argaspmetileasngluphearglyslyslysleulysleuargpro340345350valthrtyrleuserglyalaglnglyserglyasnaspileprohis355360365glytyriletrpserprohisleuvalprolysprolysasptrpgly370375380prolysileaspvalvalglyphecyspheleuaspleualaserasn385390395400tyrvalproprogluproleuilelystrpleuglualaglyasplys405410415proiletyrvalglypheglyserleuprovalglnaspproalalys420425430metthrgluvalilevallysalaleugluilethrglyglnarggly435440445ileileasnlysglytrpglyglyleuglythrleualagluprolys450455460aspphevaltyrleuleuaspasncysprohisasptrpleupheleu465470475480glncyslysalavalvalhishisglyglyalaglythrthralaala485490495glyleulysalaalacysprothrthrilevalprophepheglyasp500505510glnprophetrpglyaspargvalhisalaargglyvalglyproleu515520525proileprovalaspglnpheserleuglnlysleuvalaspalaile530535540asnphemetmetgluprolysvallysaspasnalavalgluleuala545550555560lysalametglusergluaspglyvalserglyalavalargalaphe565570575leuarghisleuproserargalaglugluthralaproglnglnthr580585590serserpheleuglupheleuglyprovalserlyscysleuglycys595600605ser当前第1页12