抗原决定簇及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，特别涉及抗原决定簇及其应用。

背景技术：

肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae，mp)是介于病毒和细菌之间的原核细胞型微生物，是社区获得性肺炎的主要病原，且可导致人体血液、神经、消化、泌尿和循环等多系统病变。肺炎支原体的分离培养操作繁琐耗时，且分离阳性率低，因此难以做出早期诊断。目前临床中最常用的诊断方法是pcr检测特异性dna和elisa法检测血清中的igm抗体，但二者在特异性、敏感性和操作简便性方面都存在不足。因此，筛选mp的优势抗原表位，用于mp感染的血清学诊断尤为重要。

表位(epitope)又叫抗原决定簇(antigenicdeterminant)，通常只有位于抗原表面的位点易与抗体结合，其中优势表位一般只有5-7个氨基酸，是抗原与抗体结合的关键位点。长氨基酸链由于螺旋或折叠，通常存在亲和性低、显色背景高、易于交叉等问题，而模拟表位则是构象表位上不连续的氨基酸通过空间构象形成的结构，其序列可能与蛋白本身有一定同源性，也可能没有相似性，将其用于血清学诊断可克服传统抗原用于诊断存在的诸多缺点。

黏附蛋白是mp最主要的优势抗原，其中的p1蛋白能与呼吸道黏膜上皮细胞膜上的神经氨酸受体结合，协助mp粘附到细胞表面。研究表明mp的p1蛋白c端存在与宿主细胞黏附的功能域。p1蛋白还具有较强的免疫原性，在感染者的血清中均可检测到其相应抗体。rastawicki等以包含p1蛋白c端1160-1521位氨基酸的重组蛋白进行血清学诊断，发现其能与70％的mp阳性血清发生反应，但其特异性和敏感度仍不理想。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明表达并纯化p1蛋白上含亲水性氨基酸较丰富片段的蛋白，以其相应的多克隆抗体为靶分子，从噬菌体展示随机12肽库中筛选其优势表位，并检测其在mp血清学诊断中的应用价值。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗原决定簇，其选自至少一种以下多肽或其任一组合：

(i)、所述多肽的氨基酸序列如seqidno:1或2所示；

或(ii)、如(i)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；

或

(iii)、与(i)或(ii)所述氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。

在此基础上，本发明还提供了编码所述抗原决定簇的核苷酸。

本发明还提供了一种表达载体，包括编码所述抗原决定簇的核苷酸。

本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主细胞。

更重要的是，本发明还提供了所述抗原决定簇在制备肺炎支原体的检测试剂、检测试剂盒和/或检测装置中的应用。

在此基础上，本发明还提供了试剂盒，包括所述抗原决定簇以及检测领域可接受的试剂。

此外，本发明还提供了抗体，由包含所述抗原决定簇的蛋白制得的多克隆抗体。

在此基础上，本发明还提供了所述抗体在制备治疗和/或预防肺炎支原体的药物中的应用。

此外，本发明还提供了所述抗体的制备方法，包括：培养所述的宿主细胞、诱导抗体的表达。

本发明还提供了所述抗原决定簇诱导表达的肺炎支原体的p蛋白。

在上述研究的基础上，本发明还提供了一种药物，包括所述抗体以及药学上可接受的辅料。

本发明选取肺炎支原体黏附蛋白p1基因上的亲水性好、抗原指数高的dna片段，原核表达并纯化其重组蛋白p1’，将其免疫新西兰兔后用溴化氰活化的琼脂糖法亲和纯化其相应的多克隆抗体。以纯化的抗体为靶分子，对噬菌体展示随机12肽库进行4轮亲和淘选，提取经4轮淘选后的噬菌体单链dna，经测序并推导出其氨基酸序列，结果表明hlqmrltklrmp为与p1’多克隆抗体特异结合的12肽，且与肺炎支原体p1蛋白的1266-1272位氨基酸(qvrtklr)具有75％的同源性，斑点免疫与elisa试验均证实其能与肺炎支原体p1蛋白的多克隆抗体特异结合，经固相法合成的该12肽与不同临床血清进行elisa试验，结果表明其能与肺炎支原体阳性血清特异结合，敏感度为81.87％，特异度为95％。这些结果表明hlqmrltklrmp可能是p1蛋白上的优势表位，具有潜在的血清学诊断价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示重组蛋白的p'的制备；其中，图1(a)示重组质粒的ecori和xhoi双酶切鉴定图；m：dnamarker；1：用ecori和xhoi酶切后的质粒电泳图；2：质粒dna；图1(b)示重组蛋白p1'的表达与纯化；重组细菌和空的表达菌分别在30℃，1mmol/liptg诱导4小时，然后通过sds-page电泳进行分析；m：蛋白marker；1：纯化并浓缩的p1'；2：超声破碎阳性克隆后的上清液；3：超声波破碎阳性克隆混合沉淀物；4-6：含有pet-30a(+)/蛋白质的三个阳性克隆；7：空的表达菌；

图2示重组蛋白的鉴定；其中，图2(a)示westernblot鉴定重组蛋白(以鼠源性抗his标签的单克隆抗体，以hrp标记的羊抗鼠igg；c-对照；1-破菌上清液；2-纯化后的p1’蛋白)；图2(b)示westernblot鉴定重组蛋白p1’的抗原性(以p1’蛋白免疫后的新西兰兔血清作为一抗，以羊抗兔igg为二抗；c-对照；1-阴性血清；2-阳性血清)；

图3示纯化的抗体sds-page电泳(1-兔血清亲和纯化后的多克隆抗体，m-蛋白marker)；

图4示琼脂糖凝胶电泳检测噬菌体的单链dna(m：dna-marker；1～10：从随机挑取的噬菌体克隆中提取的单链dna)；

图5示噬菌体斑点免疫印迹鉴定(a1-a4：代表性噬菌体phage1-phage4；b1：空白对照；b2：纯化的mp阳性血清对照；b3：mp阴性血清对照；b4：野生型vcsm13噬菌体对照)；

图6示合成12肽的血清学反应；其中图6的左图以合成的12肽为包被物，检测肺炎支原体阳性血清和阴性血清的血清学反应；图6的右图为根据elisa结果，采用graphpadprism件绘制的roc曲线)。

具体实施方式

本发明公开了一种抗原决定簇及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

利用生物信息学方法预测表位主要根据氨基酸序列的亲水性、是否处于结构表面和是否位于有弹性的自由活动区域等，可保证重组蛋白的抗原性。一般来说蛋白质的n端及c端是很好的抗原决定簇区域。研究表明肺炎支原体p1蛋白是重要的血清诊断分子，其主要的抗原性位于c端。本研究选择的序列基本符合以上原则，因此重组蛋白免疫新西兰兔后，其血清经亲和纯化得到的igg抗体与重组蛋白能特异性结合，表现出良好的免疫反应性，为噬菌体展示筛选提供了合适的靶分子。

噬菌体展示技术是将编码外源dna序列插入到噬菌体衣壳蛋白结构基因的适当位置，使其与衣壳蛋白结构基因表达为融合蛋白，被展示的外源多肽可保持相对独立的空间结构和生物学活性。经生物淘选的表位与原始抗原结构并不完全相同，但模拟了其抗原属性，因此被广泛应用于研究分子间相互作用、抗原性或酶活性等，如larralde等从噬菌体展示随机12肽库中筛选出14个hev衣壳蛋白的模拟表位，将其用于hev的血清学诊断具有较高的特异性；wang等从噬菌体随机12肽库中筛选出结核分枝杆菌的模拟表位，将其用于结核病的诊断，具有较高的灵敏度和特异度。

噬菌体展示技术根据“吸附－洗脱－扩增”的生物淘选模式，使靶蛋白分子特异结合的噬菌体逐渐得到富集，可在不了解抗原结构的情况下得到模拟表位，避免多肽在体外形成的构象表位未必与抗体结合。本研究共进行了4轮生物淘选，并用阴性血清和空的elisa板进行负筛选，尽量去除非特异结合的噬菌体，同时逐渐降低血清的包被浓度、增加洗涤液中吐温的浓度、降低孵育时间和延长洗脱时间，因而逐渐使高度特异的噬菌体克隆得到富集。

本发明获得的代表性噬菌体1展示的12肽即hlqmrltklrmp，与肺炎支原体黏附蛋白p1的qvrtklr段具有75％的同源性，该序列位于p1蛋白的1266-1272位，说明qvrtklr是p1蛋白上的关键位点，斑点免疫试验证明其能与纯化的p1’多克隆抗体特异结合，暗示该表位极有可能是p1蛋白上的优势表位。beghettoe用噬菌体展示技术筛选mp的抗原表位，证实了p1粘附素是mp的主要免疫原，认为其免疫原优势区主要位于第1125-1131位氨基酸和1382-1394位氨基酸，本发明筛选到的12肽同源段位于二者之间，进一步证实了p1蛋白的c端是重要的抗原决定区。

总之，本发明以亲和纯化的肺炎支原体p1’蛋白的多克隆抗体为靶分子，从噬菌体展示随机12肽库中筛选出hlqmrltklrmp为其优势表位，经固相合成的该表位与肺炎支原体阳性血清反应具有良好的敏感性和特异性，可用于肺炎支原体感染的血清学诊断。

本发明提供的抗原决定簇及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

材料及试剂：

hrp标记的羊抗人igg抗体购自invitrogen公司，新西兰兔购自南华大学动物实验中心，肺炎支原体阳性及阴性血清样本来自郴州市第一人民医院，采用serodia-mycoⅱdiagnostickit(fujirebio，japan)鉴定，抗体滴度≥1:80。本研究由南华大学伦理委员会批准。

统计学分析：

应用血清学评价来分析研究核心噬菌体及其多肽的灵敏度和特异度，以及受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristic，roc)。灵敏度＝真阳性数/(真阳性数+假阴性数)，特异度＝真阴性数/(假阳性数+真阴性数)。auc为roc曲线下面积，当auc＞0.9时，说明准确性较高，elisa结果有参考意义。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1目标蛋白的表达纯化

在genebank中选取编码肺炎支原体p1蛋白的基因序列(gi号：15213522)，利用dnastar.lasergenev7.1软件分析其编码蛋白的亲水性和抗原性，选取其亲水性高、抗原性好的1160-1498位氨基酸作为目标蛋白，命名为p1’。p1’对应的dna序列即p1基因的3601-4617位核苷酸序列，根据支原体密码子表，在设计pcr引物时，将“tga”密码子(在大肠杆菌中为终止密码子)设计为“tgg”密码子，使其在大肠杆菌中编码色氨酸。委托华大基因公司合成该dna序列，并引入酶切位点ecori和xhoi，将其与载体pet-30a(+)混合16℃连接过夜以构建重组载体pet-30a(+)-p1’，将该重组载体转化入大肠杆菌bl21(de3)中，以1mm的iptg在30℃条件下诱导4h，菌体经超声破碎，采用蛋白纯化系统(geaktapure)纯化重组蛋白，取破菌上清、沉淀、全菌及纯化产物进行sds-page检测。重组蛋白经超滤离心后用bca法测定蛋白浓度，以westonblot印迹法鉴定目的蛋白。

为了表达p1蛋白上抗原性好、亲水性高的蛋白序列，构建了含有p1基因中3601-4617位dna序列(编码p1蛋白1160-1498位氨基酸)的原核表达载体，经ecori和xhoi双酶切显示载体构建正确(图1a)，将正确的原核表达载体转化至bl21(de3)大肠杆菌，经iptg诱导以表达目标蛋白(1160-1498位氨基酸，命名为p1’)，结果如图1b所示，在约38kd的条带附近均有明显的蛋白条带出现(图1b)。采用akta系统对重组蛋白进行纯化，如图所示，在第1泳道约38kd处出现了相对单一的条带。以上结果说明成功表达并纯化了p1’蛋白。

为了确定纯化的重组蛋白是否为目标蛋白，采用westernblot印迹法，分别以鼠源性抗his标签单克隆抗体和p1’蛋白免疫后的新西兰兔血清作为一抗，hrp标记的羊抗鼠igg和羊抗兔igg为二抗，分析其免疫反应性，如图2a所示：在位于38kd附近观察到单一清晰的特异性条带，与预期的分子量大小一致，说明目标蛋白表达成功，且能刺激机体产生对应的多克隆抗体。

实施例2p1’多克隆抗体的制备与纯化

将200μg重组蛋白p1’与弗氏完全佐剂混合并充分乳化，经背部皮下多点注射新西兰兔(2月龄重约2kg)，同时设置pbs对照组，每组免疫3只，每隔二周进行加强免疫，共免疫3次。末次免疫后14天经心脏采血，血清用饱和(nh4)2so4法进行初步纯化，用millipore超滤离心管浓缩并去除无机盐离子。用溴化氰活化的琼脂糖对经初步纯化的兔血清进行亲和层析，获取与靶蛋白亲和的多克隆抗体，其步骤简述如下：溴化氰活化的琼脂糖与重组蛋白p1’混合，4℃偶联过夜，用封阻液(0.1mol/ltris-hcl，ph8.0)封阻残留活性基团；用偶联缓冲液(0.5mol/lnacl,ph为8.3)和醋酸盐缓冲液(0.1mol/lnaac，0.5mol/lnacl，ph4.0)循环洗涤偶联介质4次，装入层析柱洗涤，加入经饱和硫酸铵初步纯化的血清，用pbs洗脱后向层析柱中缓慢加入0.1mol/l的甘氨酸－hcl缓冲液(ph＝2.4)以解吸附目标抗体，产物进行sds-page电泳。

为了纯化靶蛋白相应的多克隆抗体，将经该蛋白免疫的兔血清用饱和(nh4)2so4法初步纯化，再以溴化氰活化的琼脂糖法对其进行进一步纯化，产物经sds-page电泳，如图3所示：在分子量约55kd附近的位置出现明显条带，此为igg的重链，在分子量约26kd附近的位置出现一微弱条带，此为igg的轻链，因此，该多克隆抗体的分子量约为162kd。这些结果说明成功纯化了p1’蛋白特异的igg抗体。

实施例3噬菌体展示随机12肽库的淘选

对噬菌体展示随机12肽库进行生物淘选，步骤简述如下：第一轮淘选以100μg纯化的p1’抗体包被elisa板，以封阻液(0.1mnahco3，5mg/mlbsa)于4℃封阻3h，0.1％tbst洗涤10次，投入约4×10¹⁰pfu的原始噬菌体文库，轻轻晃动以结合1h，0.1％tbst洗涤8次，用100μl洗脱缓冲液(0.2m甘氨酸-hcl，ph＝2.2)洗脱10min，收集洗脱物。第二、三轮分别用空的elisa板和阴性血清进行反向吸附，以排除与elisa板吸附或与阴性血清亲和的非特异噬菌体。第四轮筛选与第一轮步骤相似，但适当降低多克隆抗体的包被浓度至60μg/ml，同时tbst浓度增至0.5％。最终获得的噬菌体进行滴度测定后扩增备用。根据产出与投入的噬菌体滴度，计算每轮生物淘选的产率。

为了富集p1’抗体特异的噬菌体，以纯化的igg抗体为靶分子，对噬菌体展示随机12肽库进行4轮生物淘选，每轮淘选的噬菌体投入、产出及其产率如表1所示：随着筛选次数的增加，噬菌体的产出量和产率逐渐增加，说明p1’抗体特异的噬菌体逐渐得到富集。

表1通过亲和力筛选产出与投入的比率

实施例4dna测序与序列分析

将第4轮淘选后的产物进行铺板培养，从噬菌斑小于100个的平板上随机挑取32个克隆，经扩增后用碘化钠法提取噬菌体单链dna，送上海生工公司测序，推导出噬菌体展示的外源性dna序列，并将其翻译为相应的氨基酸序列，进行blast在线比对。

为了推导出经富集的噬菌体对应的外源性多肽序列，从第4轮淘选后的产物中随机挑取了32个单克隆噬菌斑并提取其单链dna，琼脂糖电泳可见噬菌体dna条带均清晰的出现在分子量约为3000bp的位置(fig4)。将插入到噬菌体的外源性dna序列翻译成氨基酸序列(见表2)，结果表明随机挑选的32个噬菌体的外源序列共包括4种不同序列，即代表性噬菌体1-4，其中代表性噬菌体1重复出现23次，出现频率达71.87％。以代表性噬菌体1展示的外源性多肽peptide1进行blast比对(将种属设置为mycoplasmapneumoniae,taxid:2104)。结果发现q-r-tklr与肺炎支原体p1蛋白(sequenceid:bav20738.1)的第99-105位qvrtklr序列具有75％的同源性。另外，peptide2的与肺炎支原体黏附素有4个氨基酸(pphr)完全一致，且在9-12位(llnq)与细胞粘附相关蛋白(sequenceid:wp_054174974.1，第168-171位)有4个氨基酸同源，总的同源率达67％。peptide3所展示的外源序列与细胞粘附相关蛋白(sequenceid:wp_081000520.1)有5个氨基酸(rs-lp)有80％的同源性。以上结果表明，这4个代表性噬菌体所展示的12肽可能为肺炎支原体p1蛋白的表位，其中12肽peptide1肽为其优势表位。

表2噬菌体测序推导的12肽

实施例5elisa检测代表性噬菌体与阳性血清的特异结合

选取重复出现次数较多的几个代表性噬菌体，经扩增后测定滴度，取4.0×10¹⁰个噬菌体包被elisa板，棋盘法摸索elisa条件，确定以20μg/ml的浓度200μl包被空板4℃过夜，5％的脱脂牛奶封闭3h，待测血清稀释10倍后加入50μl，37℃孵育45min，0.5％pbst洗涤5次后加入1:5000的hrp标记的抗m13piii单克隆抗体(neb,beverly,ma,usa)37℃孵育15min，洗涤，显色10min，终止反应，分别以阳性血清，阴性血清进行结合，经孵育显色后检测od450值，以验证代表性噬菌体能否与p1’多克隆抗体特异结合。

实施例6斑点免疫印迹实验检测代表性噬菌体与多克隆抗体的特异结合

用斑点免疫印迹法验证代表性噬菌体与p1’多克隆抗体的特异结合，取大约2×10¹⁰个噬菌体溶液点于pvdf，以等量肺炎支原体阳性血清作阳性对照，同时设置bsa、阴性血清和野生型vcsm13噬菌体对照，待液体被pvdf膜吸收后，经封闭过夜与纯化的多克隆抗体孵育；tbst洗膜6次；然后以1:5000稀释的hrp标记的羊抗兔igg室温环境下浸膜1h；用tbst洗膜8次后进行显和定影。

图5显示代表性噬菌体phage1-phage4均能与纯化的p1’抗体特异结合，且代表性噬菌体p1呈现的斑点更为清晰，进一步证实了这4个代表性噬菌体展示的相应多肽能与肺炎支原体p1’抗体特异结合，可能为其相应的模拟表位，且代表性噬菌体phage1展示的多肽为肺炎支原体p1蛋白上的优势表位。

实施例7核心多肽的合成与血清学检测

根据重复次数、同源性和斑点免疫试验的结果等综合分析，选取12肽序列h-p交由上海吉尔生化有限公司采用固相法进行合成，采用反相高效液相色谱法(rp-hplc)进行纯化后，用质谱分析进行鉴定。然后采用elisa检测合成多肽与不同临床血清的反应性，包括160份肺炎支原体阳性血清、20份mp阴性血清和bsa，步骤简述如下：100μg/ml的合成多肽100μl加入96孔板于4℃包被过夜，37℃封闭2h；tbst洗板5次后，加入1:20稀释的肺炎支原体阳性血清，37℃孵育30min，洗板8次，加入hrp标记的羊抗人igg抗体(用封闭液以1:5000的比例稀释)于37℃孵育15min；依次加入显色剂显色10min后终止反应，用酶标仪(tecan,infinitef50,swiss)检测od450值，评估合成多肽的血清学反应性。

为了评价出现频率最高的phage1所展示的外源性多肽的血清学诊断价值，利用间接elisa法检测固相合成的多肽分别与肺炎支原体阳性血清、阴性血清和bsa的反应性，如图6a、表3所示，合成多肽与阳性血清的结合的od450值显著高于阴性血清和bsa对照组。另外，经graphpadprism软件分析可得，该elisa反应的敏感度为81.87％，特异度为95％，auc值为0.942(图6b)，这些结果说明该合成多肽用于肺炎支原体感染诊断具有较好的应用价值。

表3

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>南华大学

<120>抗原决定簇及其应用

<130>mp1830757

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>7

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

glnvalargthrlysleuarg

15

<210>2

<211>12

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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1510