一种葡萄籽蛋白基水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明属于高分子材料技术领域，涉及一种水凝胶材料，具体涉及一种葡萄籽蛋白基水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

高分子材料也称聚合物材料，其中除了聚合物作基本组份外，为了改善加工性能和使用性能，往往添加有多种助剂或添加剂。高分子水凝胶通常是指聚合物交联形成的三维网络结构吸收溶剂溶胀但不溶解所形成的一类介于液体与固体之间的物质。水凝胶作为一种备受关注的“软材料”，因其网络中通常含有大量的水，使其具有随外界环境而改变自身形状或状态的特性，从而可吸附、脱吸附、透过物质，即具有载持、分离、缓释物质的功能，所以在农林、园艺、日用品、食品、医药、化妆品、石油化工等行业具有广阔的发展和应用前景。

传统水凝胶是通过在水溶性单体中加入双官能团交联剂的方法合成。利用这种方法得到的水凝胶是单网络水凝胶，交联密度不均匀，较短的聚合物链在外界拉力较小时就会发生断裂，强度较低；由于交联剂化学键不可逆，使所得水凝胶不具备自愈合能力；而且，这种方法采用的水溶性单体大都属于乙烯衍生物，原料来源受限，且原料本身不可降解，使用中会带来环境污染问题。

近年来在水凝胶的制备研究中，越来越多的研究者开始采用来源丰富、成本较低、可生物降解的水溶性天然高分子材料，如海藻酸钠、纤维素、壳聚糖、琼脂等，这些材料在微生物作用下可以降解为对环境无害的小分子。而且，用天然高分子材料和聚丙烯酰胺(PAM) 构筑双网络水凝胶，可提高强度，其效果尤为显著。中国专利申请CN201510097717.7公开了一种丝胶蛋白一海藻酸盐复合水凝胶，取蚕丝经处理得到丝胶蛋白水溶液，加海藻酸盐和交联剂，得丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶，获得的复合水凝胶具有荧光特性，形变记忆性和弹性模量可调控性，但力学性能未知。中国专利申请CN201710434722.1公开了一种大豆分离蛋白基天然高分子水凝胶，将大豆分离蛋白和氧化葡聚糖溶液混合制备水凝胶，其最大可承受90%的压缩形变，其压缩强度达400 kPa，在药物释放方面有一定的应用，但是功能较单一。

与大豆蛋白类似，葡萄籽蛋白质（GsP）也是由氨基酸组成的多肽。我国是葡萄生产大国，葡萄的栽培主要分布于新疆、甘肃、宁夏、山东、河北等产区。葡萄籽约占葡萄重量的5%左右，按每667m²酿酒葡萄产量800kg计，我国每年仅葡萄酒生产中产生的葡萄籽就达数万吨。葡萄籽作为葡萄酒、葡萄果汁饮料生产中产生的资源性副产物，含有丰富的营养素。随着对葡萄籽利用研究的逐渐深入，葡萄籽蛋白质的研究与利用已引起了广泛的重视（任继波，胡文效.葡萄籽蛋白质利用研究进展.中外葡萄与葡萄酒.2014,03:58-61+66.）。

已有研究者利用葡萄籽蛋白质制备土壤保水材料。例如，中国专利申请CN201710384659.5公开了一种种植用土壤保水剂，由膨润土、木薯淀粉、保水材料、酿酒葡萄渣、十六烷基溴化铵、正硅酸乙酯等原料制成，该土壤保水剂保水效果强，高温处理膨润土结合保水材料的使用作为保水剂的核心成分，能提高保水剂颗粒的强度，提高对土壤盐碱和氧化的冲击力，实现长期稳定的保水效果。

文献报道，葡萄籽蛋白质的等电点（PI值）为3.8，分子量分布在40000-70000 Da之间，氨基酸种类有18种，人体必需氨基酸有7种（吴芳.赤霞珠葡萄籽蛋白质提取工艺研究[D] .新疆·石河子：石河子大学,2015）。葡萄籽蛋白具有保湿、抗菌、抗氧化、抗凝血以及促进细胞粘附和增殖等生物特性；同时，葡萄籽蛋白具有亲水性和可降解性，可用于生物医用材料领域。然而，利用葡萄籽蛋白构筑水凝胶，用于生物医药材料领域尚未见报道。

综上所述，现有技术存在的主要问题有：（1）传统乙烯衍生物单体和交联剂聚合制备水凝胶的方法原料来源受限且原料本身不可降解，还会带来环境污染问题，所得水凝胶交联密度不均匀，强度和断列伸长率均较低，且功能单一；（2）现有利用水溶性天然蛋白质材料如丝蛋白-海藻酸钠、大豆蛋白等制备水凝胶的方法得到的水凝胶功能较单一，使其在生物医药材料领域的应用受限。

因此，研究利用葡萄籽蛋白构筑水凝胶，以克服现有技术的不足，提高传统聚丙烯酰胺水凝胶（PAM）的力学性能，同时发挥葡萄籽蛋白的功效，拓展其应用领域，具有重要意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种葡萄籽蛋白基水凝胶的制备方法，该方法使用酿酒废弃物葡萄籽为原料，其来源丰富、环境友好程度高。

本发明的另一个目的是提供一种葡萄籽蛋白基水凝胶，该水凝胶具有pH响应性，拉伸强度高达0.3～0.6MPa，具有提高药物释放率以及自由基清除率的效果。该水凝胶可用于生物医药材料领域。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种葡萄籽蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S01. 葡萄籽蛋白（GsP）的提取和纯化，包括以下步骤：

1) 预处理：称取葡萄籽，用0.05mol/L的NaOH溶液浸泡10-20min，冲洗，干燥，粉碎；

2) 脱脂：将葡萄籽用石油醚脱脂，干燥；

3) 脱色脱酚：用聚乙烯吡咯烷酮脱色，用酸化乙醇脱酚，离心去除上清液，干燥，冷藏；

4) 碱液浸提：将脱色脱酚后的粉末用0.1mol/L的NaOH溶液溶解，置40-50℃水浴中40-60min，离心去除残渣，得上清液；

5) 酸液沉积：向上清液中滴加1.0mol/L HCl调pH值至3-4沉淀，离心去除上清液，得絮状沉淀；

6) 纯化：用去离子水洗涤絮状沉淀至中性，冷冻干燥，即得葡萄籽蛋白。

S02. 葡萄籽蛋白基水凝胶（GsP/PAM）的制备：

按重量份称取葡萄籽蛋白0.1-1.0 份，溶于去离子水10份，加1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0-10.0， 加表面活性剂A 0.1-1.0 份，丙烯酰胺（Am）1.0-5.0 份，疏水单体B 0.1-0.4 份， 25-45 ℃下搅拌30-90 min，通惰性气体E除氧15-30 min后，加水溶性引发剂C 0.01-0.08 份和金属离子交联剂D 0.03-0.1份后，迅速转移至模具中；于30-80℃下保温反应24-48h，即得葡萄籽蛋白基水凝胶。

进一步，所述步骤S01葡萄籽蛋白（GsP）的提取和纯化，包括以下步骤：

1) 预处理：取葡萄籽，加0.05mol/L的NaOH溶液，在45℃水浴中浸泡10min，用去离子水冲洗，干燥，粉碎；所述葡萄籽与0.05mol/L的NaOH溶液的比例为葡萄籽︰0.05mol/L的NaOH溶液=1︰10-20（g︰ml）；

2) 脱脂：将葡萄籽粉用石油醚脱脂60min，重复两次，干燥；所述葡萄籽粉与石油醚的比例为葡萄籽︰石油醚=1︰5（g︰ml）；

3) 脱色脱酚：用聚乙烯吡咯烷酮脱色，用酸化乙醇脱酚，脱色脱酚分别重复两次，离心去除上清液，干燥，4℃冷藏；

4) 碱液浸提：将脱色脱酚后所得粉末用0.1mol/L的NaOH溶液，在45℃水浴中浸提45min，重复两次，离心去除残渣，留上清液；所述脱色脱酚后所得粉末与0.1mol/L的NaOH溶液的比例为脱色脱酚后所得粉末︰0.1mol/L的NaOH溶液=1︰16（g︰ml）；

5) 酸液沉积：向上清液中滴加1.0mol/L HCl 调pH值至等电点3.8，产生沉淀，离心除去上清液，得絮状沉淀物；

6) 纯化：用去离子水洗涤絮状沉淀物至中性，冷冻干燥，得葡萄籽蛋白。

进一步，所述步骤S02.葡萄籽蛋白基水凝胶（GsP/PAM）的制备：

具体为：按重量份称取葡萄籽蛋白0.3-1.0 份，溶于去离子水10份，加1 mol/L NaOH溶液调节pH值至8.0-9.0， 加表面活性剂A 0.4-0.7 份，丙烯酰胺（Am）3.0-4.0 份，疏水单体B 0.2-0.4 份， 25-45 ℃下搅拌45-60 min，通惰性气体E除氧15-25 min后，加水溶性引发剂C 0.01-0.08 份和金属离子交联剂D 0.03-0.1份后，迅速转移至模具中；于60-70℃下保温反应24-36h，即得葡萄籽蛋白基水凝胶。

进一步，步骤S02中所述表面活性剂A为十二烷基硫酸钠（SDS），十二烷基苯磺酸钠（SDBS），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）中至少一种。

进一步，步骤S02中所述疏水单体B为碳原子数在14以上的（甲基）丙烯酸酯衍生物，优选甲基丙烯酸十八烷基酯（SMA），甲基丙烯酸月桂酯（LMA）。

进一步，步骤S02中所述水溶性引发剂C为过硫酸钾、过硫酸铵、偶氮二异丁脒盐酸盐，偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐中至少一种。

进一步，步骤S02中所述离子交联剂D为钙离子，铝离子，三价铁离子，二价锰离子的一种。

一种葡萄籽蛋白基水凝胶，其特征在于：由上述方法制备得到。

进一步，一种葡萄籽蛋白基水凝胶，其特征在于：所述水凝胶的拉伸强度为0.3-0.6 MPa，断裂伸长率大于等于1200%，断裂后残余应变大于等于70%。

进一步，一种葡萄籽蛋白基水凝胶，其特征在于：所述水凝胶药物释放率高达32.1%。

进一步，一种葡萄籽蛋白基水凝胶，其特征在于：所述水凝胶自由基清除率高达60%。

进一步，一种葡萄籽蛋白基水凝胶，其特征在于：所述水凝胶具有pH响应性。

由上述方法制得的葡萄籽蛋白基水凝胶，应用领域更加广泛，可用于生物医药领域，提高药物释放率以及自由基清除率。

本发明的一种葡萄籽蛋白基水凝胶的制备方法的机理是，首先用碱溶酸沉法从葡萄籽中提取葡萄籽蛋白，然后用NaOH溶液调节葡萄籽蛋白水溶液的pH值，再加入丙烯酰胺、疏水单体、引发剂和金属离子交联剂进行聚合，从而得到多功能葡萄籽蛋白基水凝胶。

本发明主要利用农业废弃物葡萄籽来合成水凝胶。葡萄籽来源广泛，价格低廉，具有抗氧化、美容等功能，还具有生物相容性和环境友好性。从葡萄籽中提取具有功能活性的物质合成水凝胶，可以提升葡萄籽的附加值。

本发明的有益效果：

本发明与现有技术相比具有如下突出的实质性特点：

（1）与传统乙烯衍生物单体和交联剂聚合而成的水凝胶相比，本发明使用葡萄籽为原料，其来源丰富、价格低廉、环境友好程度高，还具有生物相容性。葡萄籽含有丰富的蛋白质、粗脂肪、各种氨基酸、维生素及矿物质等，具有一定的营养及药用价值。我国葡萄酒和葡萄果汁饮料产区有大量廉价的葡萄籽资源，大多丢弃或发酵后做肥料，造成资源浪费。本发明利用从葡萄籽中提取的葡萄籽蛋白来制备水凝胶，不仅可以降低材料成本，还能提高葡萄籽的附加值，同时可以提高聚丙烯酰胺水凝胶强度。

（2）与现有水溶性天然高分子材料如海藻酸钠、纤维素、壳聚糖、琼脂等复合物水凝胶相比，本发明使用葡萄籽为原料，聚合过程中将葡萄籽蛋白的优点引入水凝胶材料中，葡萄籽蛋白赋予了水凝胶pH响应性、提高了药物释放率以及自由基清除率，也提高了水凝胶材料的附加值，拓宽了水凝胶材料的应用领域，在生物医药领域可用于控制药物释放和自由基清除。

与现有技术相比，本发明具有以下显著进步：

与传统聚丙烯酰胺水凝胶相比，（1）本发明不使用双官能团交联剂；（2）本发明首先利用从葡萄籽中提取到的葡萄籽蛋白，与丙烯酰胺（AM）共聚，制备了强度高达0.3～0.6MPa的双网络水凝胶；由于葡萄籽蛋白的引入，该复合双网络水凝胶与聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）相比，强度、断裂伸长率和断裂后残余应变均显著提高，拓宽了水凝胶的应用领域；（4）本发明葡萄籽蛋白基双网络水凝胶与聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）相比，具有pH响应性，24h药物累计释放率和自由基清除率显著提高，提高了水凝胶材料的附加值；（3）本发明使用疏水单体与金属离子交联剂对葡萄籽蛋白基水凝胶进行二次交联，进一步提高了水凝胶的强度和断裂伸长率。

附图说明

图1为由本发明实施例1所得聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）和实施例2所得葡萄籽蛋白基水凝胶红外光谱图。

图2为由本发明实施例1所得葡萄籽蛋白基水凝胶（GsP/PAM）合成机理图。

图3为由本发明实施例1所得聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）以及实施例2所得葡萄籽蛋白基双网络水凝胶（GsP/PAM）的拉伸曲线。

图4为由本发明实施例4所得葡萄籽蛋白基水凝胶（GsP/PAM）拉伸曲线。

图5为由本发明实施例5所得不同离子交联剂的葡萄籽蛋白基双网络水凝胶（GsP/PAM）的拉伸强度及断裂伸长率。

图6为由本发明实施例2所得葡萄籽蛋白基水凝胶以及实施例1所得聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）在不同pH水溶液里的平衡溶胀率。

见图7为由本发明实施例1所得聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）和实施例2所得葡萄籽蛋白基双网络水凝胶（GsP/PAM）的药物释放曲线。

见图8为由本发明实施例1所得聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）和实施例2所得葡萄籽蛋白基双网络水凝胶（GsP/PAM）的自由基清除率。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案进行详细说明，但本发明的实施并不局限于此。

实施例1：

丙烯酰胺单网络疏水缔合水凝胶的制备

称取0.7g 十二烷基硫酸钠（SDS），溶于10ml 去离子水中，加入1M的NaOH溶液调节pH值为8.0，加入4.0 g丙烯酰胺，0.38 g 疏水单体甲基丙烯酸十八烷基酯（SMA），45℃搅拌60 min，加入0.04 g引发剂过硫酸铵，氩气除氧15min后迅速转移至模具中。在烘箱中加热至70℃保温反应24h，得到单网络水凝胶PAM。

由本发明实施例1所得聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）红外光谱图，见图1。

实施例2：

S01. 从葡萄籽中提取并纯化分离葡萄籽蛋白：

1) 预处理：取葡萄籽100.0 g，加0.05mol/L的NaOH溶液1000 mL在45℃水浴中浸泡10min，用去离子水冲洗，干燥，粉碎；

2) 脱脂：将葡萄籽粉用石油醚脱脂60min，重复两次，干燥；所述葡萄籽粉与石油醚的比例为葡萄籽︰石油醚=1︰5 （g︰ml）；

3) 脱色脱酚：用聚乙烯吡咯烷酮脱色，用酸化乙醇脱酚，脱色脱酚分别重复两次，离心去除上清液，干燥，4℃冷藏；

4) 碱液浸提：将脱色脱酚后所得粉末用0.1mol/L的NaOH溶液，在45℃水浴中浸提45min，重复两次，离心去除残渣，留上清液；所述脱色脱酚后所得粉末与0.1mol/L的NaOH溶液的比例为脱色脱酚后所得粉末︰0.1mol/L的NaOH溶液=1︰16（g︰ml）；

5) 酸液沉积：向上清液中滴加1.0mol/L HCl 调pH值至等电点3.8，产生沉淀，离心除去上清液，得絮状沉淀物；

6) 纯化：用去离子水洗涤絮状沉淀物至中性，冷冻干燥，得葡萄籽蛋白3.0 g，其得率为3.0 wt%。

S02. 葡萄籽蛋白基水凝胶的制备

称取冷冻干燥后的葡萄籽蛋白0.3 g，置反应容器中，加纯化水10 ml溶解，加1mol/L的NaOH溶液调节pH值至8.0，加十二烷基硫酸钠（SDS） 0.7 g、疏水单体甲基丙烯酸十八烷基酯（SMA） 0.38 g、丙烯酰胺4.0 g。将反应容器置45℃水浴中，剧烈搅拌60 min。氮气除氧15 min后，加引发剂过硫酸钾0.04 g，十八水硫酸铝 0.08 g，然后将溶液迅速转移至模具中。再将模具置烘箱中，加热至70℃，保温反应24h，即得葡萄籽蛋白基水凝胶（GsP/PAM）。

由本发明实施例2所得葡萄籽蛋白基双网络水凝胶（GsP/PAM）的红外光谱图，见图1。

由本发明实施例2所得葡萄籽蛋白基双网络水凝胶（GsP/PAM）的合成机理图，见图2。

实施例3：

对由实施例1所得丙烯酰胺单网络水凝胶和由实施例2所得葡萄籽蛋白基水凝胶进行拉伸试验。

采用上海益环仪器科技有限公司YHCS-200Kg型电子拉力机。拉伸试样尺寸为50 mm×10 mm×1.5 mm，以初始横截面积计算拉伸强度。拉伸的速度为100 mm/min。每组进行五组实验取平均，按下式计算拉伸强度：

σ= F / (10×1.5×10^-6)

式中：σ为拉伸强度，单位Pa；F为最大力，单位N。

实验结果表明：实施例1所得单网络水凝胶拉伸强度为0.15 MPa，断裂伸长率为1050%，断裂后残余应变42%。实施例2所得葡萄籽蛋白-丙烯酰胺复合水凝胶拉伸强度为0.3 MPa，断裂伸长率为1600%，断裂后残余应变95%。

由本发明实施例1所得聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）以及实施例2所得葡萄籽蛋白基双网络水凝胶（GsP/PAM）的拉伸曲线，见图3。

实施例4：

在实施例2的基础上，称取由实施例2得到的葡萄籽蛋白1.0 g，置反应容器中，加纯化水10 ml溶解，加1mol/L的NaOH溶液调节pH值至9.0，加乳化剂CTAB 0.4g、疏水单体甲基丙烯酸十八烷基酯（SMA） 0.38 g、丙烯酰胺3.0 g。将反应容器置45℃水浴中，剧烈搅拌45 min；氮气除氧15 min后，加引发剂过硫酸钾 0.04 g、十八水硫酸铝 0.08 g，将溶液迅速转移至模具中。再将模具置烘箱中，加热至60℃，保温反应24h，即得葡萄籽蛋白基水凝胶。

采用实施例3所述方法对由实施例4所得葡萄籽蛋白基水凝胶进行拉伸试验。结果表明：由实施例4所得葡萄籽蛋白基水凝胶的拉伸强度为0.6 MPa，断裂伸长率为1750%，断裂后残余应变为70%。

由本发明实施例4所得葡萄籽蛋白基水凝胶（GsP/PAM）的拉伸曲线，见图4。

实施例5：

在实施例2的基础上，将十八水硫酸铝0.08 g分别替换为四水氯化锰0.03 g，六水氯化铁0.04 g和二水氯化钙0.02 g，得到不同离子交联剂的葡萄籽蛋白基双网络水凝胶（GsP/PAM）。

采用实施例3所述方法对由实施例5所得不同离子交联剂的葡萄籽蛋白基水凝胶进行拉伸试验。结果表明：Al³⁺交联剂的葡萄籽蛋白基水凝胶的拉伸强度较高，为0.3 MPa，而Fe³⁺交联剂的葡萄籽蛋白基水凝胶的断裂伸长率较大，约为2200%。

由本发明实施例5所得不同离子交联剂的葡萄籽蛋白基双网络水凝胶（GsP/PAM）的拉伸强度及断裂伸长率，见图5。

实施例6：

水凝胶在不同pH水溶液里的平衡溶胀率试验：

取由实施例1与实施例2所得水凝胶，在去离子水中浸泡一周，每12小时更换一次去离子水，将泡胀后的水凝胶冷冻干燥，得到凝胶样品。配置pH1-pH7的水溶液。分别取上述干凝胶0.1-0.2 g，称重，记为 Wd；浸入上述不同pH值的水溶液中120h，待其质量基本不变、凝胶溶胀平衡后取出凝胶，用滤纸吸干表面水分，称重，记为Ws；平衡溶胀率（ESR）按下式计算：

ESR=(Ws-Wd)×100/ Wd

由本发明实施例2所得葡萄籽蛋白基水凝胶以及实施例1所得聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）在不同pH水溶液里的平衡溶胀率，见图6。丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）浸泡120 h后分解；而葡萄籽蛋白基复合水凝胶浸泡120 h后依旧完整，在等电点时平衡溶胀率最小，且表现出pH敏感性。

实施例7：

水凝胶的药物释放试验：

配制1mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、10 mg/L的罗丹明B溶液。以蒸馏水作空白，于波长 554 nm 测定溶液吸光值，在 1.0~10.0mg/L 浓度范围内其吸光度线性关系良好。其回归方程为：

y = 0.1042x - 0.0115 R² = 0.9997

分别准确称取由实施例1和实施例2所得干凝胶0.20 g 和0.21 g，浸入100ml浓度为10mg/L罗丹明B（RhB）溶液中，于避光处溶胀载药，直至溶液吸光度不再变化，达到最大载药量。小心将凝胶表面水分吸干，称其质量，并依据溶液浓度及标准曲线计算其载药量。将载药凝胶置于定量去离子水中，定时从体系中取定量溶液测吸光值，根据标准曲线计算RhB累积释放率。以药物累积释放率对时间作图，得释放曲线。

由本发明实施例1所得聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）和实施例2所得葡萄籽蛋白基双网络水凝胶（GsP/PAM）的药物释放曲线，见图7。可以看出，5h时葡萄籽蛋白基水凝胶中RhB释放效率达到了32.1%，而聚丙烯酰胺水凝胶（PAM）RhB释放效率仅为14.3%。

实施例8：

水凝胶的自由基清除试验：

精密量取2mmol/L的四水氯化亚铁溶液45 mL，质量分数为30 wt%的双氧水0.15 mL，6mmol/L的水杨酸45ml。摇匀，置37℃水浴中30min，取出，以蒸馏水为空白，在波长 510 nm 处测定吸光度 A0；分别准确称取由实施例1以及实施例2所得干凝胶1g、2g、3g、4g、5g，浸入溶液，摇匀，置37℃水浴中30min，取出，测定吸光度 A，取三次重复测定的平均值。按下式计算自由基清除率：

Clear ratio (%)=(A0-A)×100/A0

由本发明实施例1所得聚丙烯酰胺单网络水凝胶（PAM）和实施例2所得葡萄籽蛋白基双网络水凝胶（GsP/PAM）的自由基清除率，见图8。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非用以限制本发明的权利范围。任何以本申请专利范围所涵盖的权利范围实施的技术方案，或者任何熟悉本领域的技术人员，利用上述揭示的方法内容做出许多可能的变动和修饰的方案，均属于本发明的保护范围。