本发明属于医药技术领域，涉及到单克隆抗体纯化技术，具体涉及到一种无糖基化抗pd-1单克隆抗体的纯化方法。
背景技术：
pd-1是一种免疫抑制剂性受体，主要在激活的t细胞及b细胞中，功能是抑制细胞激活，在免疫应答中发挥负调控作用，pd-1的配体pdl-1与pdl-2高表达于肿瘤微环境中，导致肿瘤微环境pd-1通路持续激活，t细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞；同时pd-1的信号传导可以抑制b细胞增殖、分化ig类型转换，在建立和维护外周自身耐受中起重要作用。
抗pd-1单抗是针对pd-1的一种抗体蛋白，该抗体能特异性地与pd-1结合，阻断pdl-1与pd-1相结合部分，恢复t细胞功能，对肿瘤生长具有显著抑制作用，在治疗肿瘤方面具有很好的靶向潜能。针对这一优势，开发研制了一种重组人源化抗pd-1单克隆抗体，其上糖基化修饰被敲除。过去多年的抗体研究都强调糖基化对抗体功能的重要性，但带糖基化的抗体免疫原性和蛋白折叠凳也会存在很多不确定性，增加了工艺开发的难度。目前部分研究者发现无糖基化后的抗体开发比较稳定，均一性提高，且能降低抗体在体内引起的炎症及细胞毒性，同时抗体的fc片段更灵活，更易与fcyrs结合。然而构建的无糖基化的抗pd-1单克隆抗体由于去除糖基化而对胰蛋白酶等的敏感性显著增加，结构灵活性增强，在低ph情况下更容易有聚体形成的趋势，易聚集沉淀，急需一种纯化方法来解决蛋白聚集问题。
从重组表达的宿主中提取单克隆抗体，柱层析是关键。结合在柱上的蛋白可以通过调节流动相的类型、ph和浓度来被洗脱下来，在这些过程中，存在蛋白浓度或表面密度过高的情况，从而导致聚体形成以及蛋白的异质性。层析中的亲和层析通常有很高的配基密度高，更易在柱表面或柱上部形成高蛋白密度，且亲和层析通常用于粗纯对回收率要求较高，洗脱ph较低，蛋白易沉淀，更易产生聚体，故更需在纯化过程中减少聚体的产生，提高蛋白稳定性。抗体纯化过程中病毒灭活多采用低ph病毒灭活，在低ph条件下，目的蛋白容易产生聚体，这些聚体的产生大大威胁了抗体的稳定性，对临床用药也存在潜在威胁，因此很有必要提供一种抗体纯化方法来减少这些聚体的产生。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种可有效减少聚体产生的无糖基化抗pd-1单克隆抗体的纯化方法，该方法可有效减少聚体产生，提高抗pd-1单抗的稳定性和回收率。本发明的技术方案如下：
一种无糖基化抗pd-1单克隆抗体的纯化方法，包括亲和层析和病毒灭活步骤。
优选地，该方法具体包括如下步骤：
(1)对细胞培养液上清进行亲和层析：平衡、上样、洗涤、洗脱过程；
(2)收集步骤(1)洗脱流出液加入糖类物质，搅拌至完全溶解；
(3)将步骤(2)所得样品调ph进行低ph病毒灭活。
优选地，所述步骤(1)中亲和层析过程，平衡过程采用缓冲液平衡，缓冲液为含盐的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液(0.02mol/l，ph7.0～7.4)；洗涤过程包括三步，第一步平衡缓冲液复平衡，第二步所用的洗涤缓冲液为含盐的tris-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph8.0～8.5)；第三步洗涤所用的洗涤缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph4.5～5.5)；洗脱缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph2.7～3.1)。
优选地，所述的盐为氯化钠，氯化钾或氯化铵中的一种，平衡液所述含盐浓度为0.15mol/l，第二步洗涤所述含盐浓度为0.15～0.5mol/l。
优选地，步骤(2)所述的糖类物质选自蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨醇中的一种，优选蔗糖。
优选地，糖类物质的质量与步骤(1)洗脱流出液样品的质量体积比为0.02～0.08:1，其中质量以g计，体积以ml计。
优选地，步骤(3)的操作过程是采用ph调节剂调节ph3.5～3.9，灭活1h，然后再调节至ph6.0～7.0，其中ph调节剂为0.1～1mol/l柠檬酸或磷酸氢二钠。
另外，亲和层析过程，甘氨酸-盐酸缓冲液还可以是组氨酸-盐酸缓冲液。为了得到更高纯度的抗pd-1单抗，在亲和层析和病毒灭活后可进行离子交换层析、超滤等步骤，经过此进一步纯化后，聚体可减少到0.3％以下。
本发明所述的细胞培养液是cho细胞培养液，需要对其进行深层过滤，深层过滤滤膜和条件不做限制，只要能够得到满足下一步亲和层析的滤出液即可。本发明不对亲和层析填料进行限制，可以是mabselectsurelx，也可以是mabselectsure、proteina等填料。
本发明在亲和层析过程中，引入盐成分，能够显著地改善亲和层析性能，降低蛋白浊度。洗涤和洗脱过程引入甘氨酸-盐酸缓冲液，甘氨酸作为氨基酸，可以作为蛋白保护剂，在低ph洗涤洗脱条件下，可有效减少聚体产生，增加蛋白稳定性。在病毒灭活过程中，加入了糖类物质，可以减少聚体形成，使抗体在低ph灭活下聚体增加变缓；另外所加入的糖类物质本身就是药用辅料，增大了药用安全性。本发明很好的减少了无糖基化抗pd-1单克隆抗体纯化过程中聚体的形成，保护了蛋白的稳定性。
本发明操作简单，方便易行，安全性高，可使得抗pd-1单抗的纯度达到97％以上，浊度降低到60ntu以下，收率提高到99％以上，且成本低廉，可用于工业化大规模生产。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面通过具体的实施例来进一步说明本发明的技术方案，但这些实施例并不限制本发明。
实施例中所用的原料与耗材均可通过商业途径或公知方法制备获得。本发明实施例中所使用的样品是抗pd-1单克隆抗体是体外哺乳动物细胞发酵表达而得到，动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞(cho)，单克隆抗体为igg1类型，其fc片断的三个糖基化位点发生突变。本发明中样品为细胞培养液需通过深层过滤后得到的。
以下实施例亲和层析柱为xk16柱，购自ge公司，填料为：mabselectsurelx；样品为：通过深层过滤后的细胞培养液上清，其蛋白表达量为4.2g/l，以下实施例亲和层析上柱样品蛋白量为1500mg。柱子载样量为50g/l。cv为30ml，cv表示柱体积。
实施例1
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/l，ph7.0)平衡层析柱5cv，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3cv，流速5.6ml/min，然后用含0.15mol/l氯化钠的tris-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph8.0)洗涤5cv；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph4.5)洗涤3cv，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph2.7)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共100ml，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入5g蔗糖，搅拌至完全溶解，用0.5mol/l的柠檬酸调节ph至3.5灭活1h，再用1mol/l的磷酸氢二钠调ph至6.0，取样检测。各步骤中取样检测结果见表1。
表1实施例1各步骤检测结果
实施例2
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钾0.15mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/l，ph7.4)平衡层析柱5cv，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3cv，流速5.6ml/min；然后用含0.5mol/l氯化钾的tris-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph8.3)洗涤5cv；再用的甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph5.0)洗涤3cv，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph2.9)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共198ml，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入3.96g海藻糖，搅拌至完全溶解，用0.1mol/l的柠檬酸调节ph至3.9灭活1h，再用0.5mol/l的磷酸氢二钠调ph至7.0，取样检测。各步骤中取样检测结果见表2。
表2实施例2各步骤检测结果
阳离子层析
填料：p0roshs
(a)平衡：用20mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(ph6.0,3.0ms/cm)平衡5cv，流速为10ml/min。
(b)上样：病毒灭活步骤后的样品经过深层过滤和0.22um滤膜后，调ph6.0，以40mg/ml的载量上样。
(c)洗涤：先用上述平衡液洗涤3cv，再用20mmtris-hcl缓冲液(ph7.2)洗涤5cv，流速为10ml/min。
(d)洗脱：利用20mmtris-hcl缓冲液(ph8.0，5ms/cm)洗脱，收集流出液记为cexpro。
阴离子层析
填料：poros50pi
(e)平衡：利用20mmtris-hcl缓冲液(ph8.0，5ms/cm)平衡5cv
(f)上样：cexpro上样流穿，收集流出液记为aexpro。阳离子层析和阴离子层析取样检测结果见表3。
表3实施例2离子交换层析检测结果
以上离子交换层析过程仅用于例证的目的，并不限制本发明后续离子交换过程。
实施例3
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/l，ph7.0)平衡层析柱5cv，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3cv，流速5.6ml/min，然后用含0.3mol/l氯化钠的tris-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph8.0)洗涤5cv，再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph4.5)洗涤3cv，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸(0.02mol/l，ph2.7)缓冲液进行洗脱，流速5.6ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共94ml，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入7.52g甘露糖，搅拌至完全溶解，用1mol/l的柠檬酸调节ph至3.6灭活1h，再用1mol/l的磷酸氢二钠调ph至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表4。
表4实施例3各步骤检测结果
实施例4
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化氨0.15mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/l，ph7.2)平衡层析柱5cv，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3cv，流速为5.6ml/min；然后用含0.5mol/l氯化氨的tris-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph8.5)洗涤5cv；再用组氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph5.0)洗涤3cv，流速10ml/min；
(4)洗脱：用组氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph2.9)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共210ml，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入12.6g山梨醇，搅拌至完全溶解，用1mol/l的柠檬酸调节ph至3.9灭活1h，再用0.1mol/l的磷酸氢二钠调ph至6.0，取样检测。各步骤中取样检测结果见表5。
表5实施例4各步骤检测结果
实施例5
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/l，ph7.0)平衡层析柱5cv，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3cv，流速为5.6ml/min，然后用含0.15mol/l氯化钠的tris-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph8.0)洗涤5cv；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph5.5)洗涤3cv，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph2.7)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共176ml，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入7.04g蔗糖，搅拌至完全溶解，用0.5mol/l的柠檬酸调节ph至3.7灭活1h，再用1mol/l的磷酸氢二钠调ph至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表6。
表6实施例5各步骤检测结果
实施例6
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/l，ph7.2)平衡层析柱5cv，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3cv，流速为5.6ml/min，然后用含0.3mol/l氯化钠的tris-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph8.5)洗涤5cv；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph5.0)洗涤3cv，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph3.1)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共200ml，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入9.16g蔗糖，搅拌至完全溶解，用0.8mol/l的柠檬酸调节ph至3.7灭活1h，再用1mol/l的磷酸氢二钠调ph至6.8，取样检测。各步骤中取样检测结果见表6。
表7实施例6各步骤检测结果
对比实施例1
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/l磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/l，ph7.0)平衡层析柱5cv，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3cv，流速为5.6ml/min，然后用tris-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph8.0)洗涤5cv；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph5.5)洗涤3cv，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph2.7)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共189ml，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入7.44g蔗糖，搅拌至完全溶解，用0.5mol/l的柠檬酸调节ph至3.7灭活1h，再用1mol/l的磷酸氢二钠调ph至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表7。
表7对比实施例1各步骤检测结果
对比实施例2
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/l，ph7.4)平衡层析柱5cv，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3cv，流速为5.6ml/min，然后用含tris缓冲液(0.02mol/l，ph8.0)洗涤5cv；再用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.01mol/l，ph5.2)洗涤3cv，流速10ml/min；
(4)洗脱：用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.01mol/l，ph3.8)流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共130ml，取样检测。
病毒灭活
向步骤(4)收集的流出液加入5.20g蔗糖，搅拌至完全溶解，用0.5mol/l的柠檬酸调节ph至3.7灭活1h，再用1mol/l的磷酸氢二钠调ph至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表8。
表8对比实施例2各步骤检测结果
对比实施例3
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/l，ph7.0)平衡层析柱5cv，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3cv，流速为5.6ml/min，然后用含0.15mol/l氯化钠的tris-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph8.0)洗涤5cv；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph5.5)洗涤3cv，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph2.7)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共176ml，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液搅拌均匀，用0.5mol/l的柠檬酸调节ph至3.7灭活1h，再用1mol/l的磷酸氢二钠调ph至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表9。
表9对比实施例3各步骤检测结果
对比实施例4
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/l，ph7.0)平衡层析柱5cv，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3cv，流速为5.6ml/min，然后用含0.15mol/l氯化钠的tris-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph8.0)洗涤5cv；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph5.5)洗涤3cv，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/l，ph2.7)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共176ml，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入7.04g乳糖，搅拌至完全溶解，用0.5mol/l的柠檬酸调节ph至3.7灭活1h，再用1mol/l的磷酸氢二钠调ph至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表10。
表10对比实施例4各步骤检测结果
对比实施例5
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/l，ph7.4)平衡层析柱5cv，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3cv，流速为5.6ml/min，然后用的tris缓冲液(0.02mol/l，ph8.5)洗涤5cv；再用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.01mol/l，ph5.2)洗涤3cv，流速10ml/min；
(4)洗脱：用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.01mol/l，ph3.8)流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共130ml，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液搅拌均匀，用0.5mol/l的柠檬酸调节ph至3.7灭活1h，再用1mol/l的磷酸氢二钠调ph至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表11。
表11对比实施例5各步骤检测结果
阳离子层析
填料：p0roshs
(a)平衡：用20mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(ph6.0,3.0ms/cm)平衡5cv，流速为10ml/min。
(b)上样：病毒灭活步骤后的样品经过深层过滤和0.22um滤膜后，调ph6.0，以40mg/ml的载量上样。
(c)洗涤：先用上述平衡液洗涤3cv，再用20mmtris-hcl缓冲液(ph7.2)洗涤5cv，流速为10ml/min。
(d)洗脱：利用20mmtris-hcl缓冲液(ph8.0，5ms/cm)洗脱，收集流出液记为cexpro。
阴离子层析
填料：poros50pi
(e)平衡：利用20mmtris-hcl缓冲液(ph8.0，5ms/cm)平衡5cv
(f)上样：cexpro上样流穿，收集流出液记为aexpro。阳离子层析和阴离子层析取样检测结果见表12。
表12对比实施例5离子交换层析检测结果
以上离子交换层析过程仅用于例证的目的，并不限制本发明后续离子交换过程。