本发明属于液体活检领域，特别涉及一种微腔式多色荧光数字pcr芯片及应用。
背景技术：
：近年来，随着居民生活方式的改变以及环境污染等因素，恶性肿瘤已成为居民健康的最大杀手。在2012年，大约有1,410万人罹患癌症，并且造成820万人身亡(相当于全年总死亡人数的14.6％)。由于癌症的发病原因及发病机制极为复杂，且临床表现具有个体差异，多数患者就诊时已发展至晚期。临床统计数据显示，以肺癌为例，其总体5年生存率仅为10％-16％，而其中i期患者的5年生存率可达65-75％。因此，早发现、早治疗对延长癌症患者生存期有积极作用。但随着对肿瘤研究的深入，科学家发现在癌症的诊断和治疗过程中组织活检技术有一定的局限性。液体活检(liquidbiopsy)作为一种新的检测手段，可以较容易的，反复、多次获取患者的体液作为检测样品，从而可代替传统的检查方法。其优势在于能通过非侵入性取样降低活检的危害，而且有效延长患者生存期，性价比较高。目前液体活检的主要检测物包括检测血液中游离的循环肿瘤细胞(ctcs)，循环肿瘤dna(ctdna)碎片，循环rna(circulatingrna)和外泌体(携带有细胞来源相关的多种蛋白质，脂类，dna，rna等)。目前编码蛋白基因中的致癌性突变检测已被作为个体化诊疗的标志物，而新近研究发现，非编码rna(non-codingrna,ncrna)在癌症中扮演着很重要的角色，ncrna表达水平上的差异或某些癌症类型特异性ncrna的表达，可作为肿瘤诊断和治疗的新的分子标志物。因此，针对循环肿瘤相关ncrna表达与功能的研究，将为癌症的诊断、治疗及预后提供新的策略。数字pcr(digitalpcr，dpcr)技术是一种新的核酸检测和定量方法，与传统定量pcr(qpcr)技术不同，数字pcr采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样品，直接检测目标序列的拷贝数。数字pcr采用“分而治之”(divideandconquer)的策略，将一个标准pcr反应分配到成千上万个纳升或皮升级的微反应器中，每个反应器作为一个独立的扩增体系，绝大多数微腔中仅包含一个或零个目标分子的拷贝，从而实现了“单分子模板pcr扩增”，扩增结束后，通过阳性微反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。在实际的数字pcr实验中，是通过呈现两种信号类型“有和无”来体现微反应器的比例和数目进行统计学分析，计算出原始样品中的模板拷贝数。基于众多的优势，数字pcr技术也引起了科学界及商业界的追捧。目前基于微流控技术的数字pcr系统主要有两种，基于微腔的cdpcr技术(chamber-baseddpcr)和基于液滴的ddpcr技术(droplet-baseddpcr)，比较典型的并且已经得到实际应用的包括bio-rad公司推出qx200dropletdigitalpcr系统、raindance公司推出raindropdigitalpcr系统和life公司推出的quantstudio3ddigitalpcr系统等。然而目前的数字pcr系统主要存在以下不足：系统的集成度较低。qx200、raindrop、quantstudio系统均需要使用两到三台不同的仪器分别完成数字pcr的样品分散、扩增以及检测等步骤，操作繁琐，仪器设备昂贵。样品在这些仪器中的转移和切换过程中，存在污染风险，导致假阳性信号的出现。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种微腔式多色荧光数字pcr芯片及应用，该芯片使用多色荧光检测，可大幅提高单个芯片的检测通量，极大提高反应效率，操作方便，速度快，能够达到极高的检测灵敏度，具有良好的应用前景。本发明提供了一种微腔式多色荧光数字pcr芯片，所述芯片包括进液口、双侧微腔阵列区域和双侧废液仓；所述进液口包括样品入口和指示剂入口，所述废液仓包括样品废液仓和指示剂废液仓，所述微腔阵列区域包括微腔反应阵列组和微腔指示阵列组；所述进液口通过微管道连通微腔阵列区域中的各个微腔并进一步与废液仓相连。所述芯片材料为聚二甲基硅氧烷pdms。所述多色荧光包括fam(ex.495,em.521)、hex(ex.535,em.556)、rox(ex.586,em.607)、cy5(ex.646,em.669)。本发明还提供了一种微腔式多色荧光数字pcr芯片的应用，所述芯片用于微量癌症稀有突变分析、差异基因表达分析或高精度拷贝数变异分析。有益效果(1)本发明使用多色荧光检测，可大幅提高单个芯片的检测通量，极大提高反应效率；(2)本发明易用性强，外围的微腔指示阵列组既可以对液体进入过程起到指示作用，也能够保护内测样品反应液在pcr热循环过程中的对外蒸发；(3)本发明操作方便，速度快，双侧进样及双侧废液仓设计可大幅加快进样和分液速度；(4)本发明能够达到极高的检测灵敏度，适合微量癌症稀有突变分析、差异基因表达分析、高精度拷贝数变异分析，具有良好的应用前景。附图说明图1为本发明的结构示意图；图2为本发明的指示剂效果示意图；图3为本发明的微腔指示阵列组抗蒸发效果示意图；图4为本发明的多色荧光检测原理示意图；图5为本发明的多色荧光检测结果图；图6为不同浓度基因组dna的数字pcr结果，分别为105copy/μl、104copy/μl、103copy/μl、102copy/μl、101copy/μl，以及无样品阴性对照。图7为实施例1测得的dna目标片段实际测量浓度与dna目标片段梯度浓度线性关系曲线，误差棒代表三次独立复实验计算得到的标准差。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1(1)芯片结构如图1所示，本实施例提供了一种微腔式多色荧光数字pcr芯片，所述芯片材料为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,pdms)，芯片采用双侧分液及双侧废液仓设计，可大幅加快进样和分液速度，缩短实验时间。芯片结构包括进液口、微腔阵列区域和废液仓，所述进液口包括样品入口和指示剂入口，所述废液仓包括样品废液仓和指示剂废液仓，所述微腔阵列区域包括微腔反应阵列组和微腔指示阵列组；所述进液口通过微管道连通微腔阵列区域中的各个微腔并进一步与废液仓相连。其中，样品入口用于微腔反应阵列组中pcr反应液的进入，而指示剂入口用于微腔指示阵列组中指示剂的进入。整个芯片共有21,760个微腔，可将pcr反应液分成21,760份，每一份反应液可以在微腔内独立的进行pcr扩增。其中微管道宽约30-70μm，高约20-40μm，微腔的直径约100μm，高度约100μm。(2)芯片制作首先向硅基模具上浇筑聚二甲基硅氧烷预聚体(pdms)与交联剂的混合物(质量比10:1)；然后经过静置、加热过程，使pdms固化；将固化后的pdms从模具上剥离，并与玻片键和，即完成了芯片的制作过程。(3)芯片指示功能设计由于pcr反应液为无色透明液体，进液的过程缺乏直观的显示，设置微腔指示阵列组可以对液体进入过程，起到指示的作用，方便操作人员控制进液过程；同时，pdms为类海绵多孔结构，所以在热循环的过程中，微腔中的液体会受热蒸发，导致微腔内的水分损失，玻片保护的部分不会受此影响，而靠近芯片边缘部分的微腔会因水分损失而影响pcr扩增反应的结果。因此，本实施例在芯片外侧增加如图2，图3所示的微腔指示阵列组。在芯片进液的过程中可以充当指示剂(如图2所示)，在热循环的过程中可以作为内侧微腔的保护层，防止内侧微腔内液体的蒸发(如图3所示)。如图3所示，使用有色液体测试芯片的抗蒸发能力。经40个pcr热循环过程，仅有最外侧微腔指示阵列组的部分微腔被蒸发，而内部的微腔阵列区域，没有明显的水分损失。上述实验结果证明，该芯片的微腔指示阵列组设计，不但能有效的对进液过程进行指示，也能够较好的抵抗热循环过程中微腔水分的蒸发。(4)阳性信号计数整个pcr过程中，含有目的核酸片段的微腔会发出终点信号(荧光)，称为阳性信号；而没有目的核酸片段存在的微腔则不存在终点信号(无荧光)，称为阴性信号。为了对目的核酸片段进行定量，首先必须对芯片内的阳性信号微腔数目进行计数，并使用泊松模型对阳性信号数进行校正，最终得到阳性核酸目的片段的绝对数量。(5)本实施例芯片的实际测试1.试剂与仪器：试剂：superscripttmiiifirst-strandsynthesissystem(美国thermofisher公司)；lightcycler480probesmaster(德国roche公司)。仪器：真空干燥器(上海越磁电子科技有限公司)；eppendorfmastercyclernexuspcr仪(德国eppendorf公司)；bx51荧光显微镜(日本olympus公司)；。dna序列：实验中所用dna序列见表1。标记有荧光基团与淬灭基团的taqman探针序列由上海占标生物科技有限公司合成。pcr引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并由该公司经过聚丙烯酰胺凝胶电泳法(page)进行纯化。表1实验所用dna序列2.pcr反应体系：为了测试该芯片的线性范围与检测灵敏度，对actb基因的标准品进行了梯度稀释，配制了不同浓度的标准品(浓度从105copy/μl到10copy/μl)。实验前，取1μl标准品与19μlpcr反应组配制成20μlpcr反应混合液。将混合液加入数字pcr芯片，并进行pcr热循环反应。反应混合液的体系如表2所示，pcr参数如表3所示。pcr过程在eppendorfmastercyclernexuspcr仪上进行。表2数字pcr体系组分体积(μl)水(pcr级)7.5lightcycler480probesmaster10前引物f(10μm)0.5后引物r(10μm)0.5taqman探针(10μm)0.5cdna1表3数字pcr热循环参考值3.实验结果：pcr循环后，实验结果如图6所示，随着加入标准品浓度的梯度减少，阳性信号的数目也相应减少。并且，在阴性对照组中(未加入标准品)，没有观察到任何阳性信号。通过阳性信号的数目，能够计算出待测标准品中核酸拷贝数。具体计算方法为：设芯片总阳性信号数目为n，设芯片微腔数目设为n。由于核酸分子在微腔中的个数x满足泊松分布，则根据泊松分布的分布函数：公式3.1中λ为泊松分布的期望，而p(x)为每个微腔中核酸分子数目为x时的概率。由于阴性信号的微腔中含有0个目标核酸分子，则有：通过公式3.2可以推出泊松分布的期望值λ的计算公式：当微腔中分子数x≥1时，该微腔将产生荧光而成为阳性信号的微腔，所以有下式：将公式3.4带入式3.3中，即可得出：λ是泊松分布中的期望，即单个微腔里面出现阳性分子数目的期望值，所以只需要用λ乘以总微腔的数目n即可得出目的核酸分子的总拷贝数(copynumber)：copynumber＝λ×n(3.6)将总拷贝数除以初始样品的体积v，即可得到目标核酸分子的初始浓度：至此，通过泊松模型校正，即可精确地得到了样品中目的核酸分子的拷贝数与浓度。图7为本实施例测得的目标核酸分子浓度与其实际浓度的线性关系曲线，如图所示，检测的线性范围为10copy/μl到105copy/μl(r2＝0.999)。该结果显示出，芯片对核酸分子的定量准确，线性度好。同时，最低检测限达到了10个分子。以上结果证明，该数字pcr芯片可以用于目标核酸分子的绝对定量检测。sequencelisting<110>中国科学院上海微系统与信息技术研究所<120>一种微腔式多色荧光数字pcr芯片及应用<130>1<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gcctgctcttttgcttctaa20<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2cctcacgtctgtcttcgtg19<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3tgacctttgtcccgctcctgcc22<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4ctttccctcgtcctctgcg19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gcaagcgtttgtgggtttca20<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<400>6tctctcctcaccatctctcggtgccc26<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7tcgcttggtcatcctggtaa20<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8aaagtgaggcttgctagagtgc22<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<400>9tctgttccaagaggcccacgcgcag25<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10cctgtacgccaacacagtgc20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11atactcctgcttgctgatcc20<210>12<211>25<212>dna<213>人工序列<400>12tgccctggcacccagcacaatgaag25当前第1页12