本发明涉及基因工程
技术领域：
，特别涉及一种拟南芥ftshi5基因在调控拟南芥叶绿体发育中的应用。
背景技术：
：叶绿体是普遍存在于陆地植物、藻类和部分原生生物中的半自主性细胞器，是光合作用的场所。植物光合作用几乎是所有生物赖以生存和发展的物质基础。因此对叶绿体发育及调控机制的研究，有助于更好地了解光合作用的调控机理。叶绿体作为植物重要的细胞器，尽管其发育及调控机制一直受到广泛研究学者的关注，但基于其复杂性，目前还有许多调控分子机制尚不清楚。ftsh(filamentationtemperature-sensitiveh)是广泛存在于原核生物和真核生物中的一类atp依赖型金属蛋白酶，在拟南芥中还有与ftsh相似的ftshi(i:proteolyticinactivation)基因，因其缺少zn2+结合结构域而不具有蛋白酶活性。目前关于ftshi生物学功能的研究报道还较少。ftshi似乎与ftsh12近源，因而推测其功能与ftsh12具有相似性。在最近的研究报道中发现atftshi1是叶绿体发育和胚胎发生必需的，atftshi1可能在质体分裂和发育的过程当中发挥作用，是拟南芥叶绿体发育的必需基因。此外，ftshi2，ftshi4和ftshi5基因敲除后会导致胚胎发育缺陷，这也与ftsh12基因敲除后会导致胚胎致死的现象相似。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种拟南芥ftshi5基因在调控拟南芥叶绿体发育中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明提供一种拟南芥ftshi5基因在调控拟南芥叶绿体发育中的应用。进一步，本发明提供一种拟南芥ftshi5基因在植物育种中的应用。更进一步的，本发明提供一种拟南芥ftshi5基因在培育转基因植物中的应用。所述的植物包括但不限于拟南芥、水稻、小麦、玉米、高粱、谷子、甘蔗、棉花、番茄、苜蓿和象草；所述的拟南芥ftshi5基因，其氨基酸序列如seqidno：2所示。所述的拟南芥ftshi5基因，其序列是下列核苷酸序列之一：1)序列表中seqidno：1所示的dna序列；2)与序列表中seqidno：1编码蛋白质相同的蛋白质的dna序列；本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过构建拟南芥ftshi5基因的干涉载体，然后转染野生型拟南芥，获得ftshi5干涉突变体在添加dex时表现出黄化矮小，叶绿素含量下降，叶绿体中类囊体结构受到损伤。实验证明拟南芥ftshi5基因参与了对叶绿体发育的调控，可以用于调控叶绿体发育。附图说明图1是ftshi5干涉株系的鉴定图；其中，wt：野生型拟南芥col-0；#6、#1、#2，分别表示干涉株系dex:rnai-ftshi5的6号株系、1号株系、2号株系；-dex：不经地塞米松(dex)诱导剂处理；+dex：经dex诱导剂处理。图2是叶绿素含量分析图；其中，wt：野生型拟南芥col-0；#6、#1、#2，分别表示干涉株系dex:rnai-ftshi5的6号株系、1号株系、2号株系；-dex：不经地塞米松(dex)诱导剂处理；+dex：经dex诱导剂处理图3是ftshi5干涉株系dex:rnai-ftshi56号株系的叶绿体发育观察图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。野生型拟南芥columbia(col-0)购自arabidopsisbiologicalresourcecenter(http://www.arabidopsis.org/)。实施例1：ftshi5干涉株系的构建和鉴定1.1载体构建1)扩增目的基因ftshi5片段：以col-0的cdna为模板，扩增目的片段1；目的片段1位于seqidno：1的第157位～587位。引物序列如下(5′→3′)：rnai-ftshi5-f：cgactctagcctcgagtgcccattagaggctgcttt；rnai-ftshi5-r：accaattggggtaccgcaacctctccattttcctttctaact；pcr反应体系如表1：表1pcr反应体系(50μl)组分用量2×primerstarmix25μlrnai-ftshi5-f(10μm)2.5μlrnai-ftshi5-r(10μm)2.5μlcdna2μlddh2o18μlpcr扩增程序：98℃10s；98℃10s，55℃5s，72℃1min/kb(26个循环)；72℃10min；4℃保存。pcr产物回收：pcr产物跑1％琼脂糖胶，切胶回收，具体方法参照利用天根公司的dna回收试剂盒进行操作。以col-0的cdna为模板，利用rnai-ftshi5-f′和rnai-ftshi5-r′扩增目的片段1的反向序列，记为目的片段2。rnai-ftshi5-f′：gaaatcgataagcttgcaacctctccattttcctttctaact；rnai-ftshi5-r′：gcctggatcgactaggtgcccattagaggctgcttt。pcr反应体系、扩增程序及产物回收，按照上述方法进行。2)扩增pdk内含子片段：以phannibal载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心biovectorsciencelab)为模板，用引物f和引物r扩增目的片段3，引物序列如下(5′→3′)：引物f：ggtaccccaattggtaaggaaataatt；引物r：aagcttatcgatttcgaacccaatttcc；pcr反应体系如表2：表2pcr反应体系组分用量2×primerstarmix25μl引物f(10μm)2.5μl引物r(10μm)2.5μlphannibal载体100ngddh2oupto50μlpcr扩增程序：98℃10s；98℃10s，55℃5s，72℃1min/kb(26个循环)；72℃10min；4℃保存pcr产物回收：pcr产物跑1％琼脂糖胶，切胶回收，具体方法参照利用天根公司的dna回收试剂盒进行操作。注明：以上2×primerstarmix高保真酶购自takara公司。3)双酶切线性化pta7002-avrpto载体酶切反应体系如表3：表3酶切反应体系组分用量10×buffer3μlenzyme1(xhoi)1μlenzyme2(spei)1μlpta7002-avrpto载体1μgddh2oupto30μl酶切条件：37℃，酶切4h。酶切产物回收：酶切完成后，往酶切产物中加入3μl10×loadingbuffer，混匀。用1％琼脂糖凝胶进行电泳，切胶回收，回收步骤参照天根公司的dna纯化回收试剂盒的说明书进行。所用的pta7002-avrpto载体购自addgene公司。4)同源重组构建ftshi5干涉载体同源重组反应体系如表4：表4反应体系组分用量线性化pta7002-avrpto载体xng目的片段1yng目的片段2mng目的片段3wng5×ce∥buffer6μlexnase∥3μlddh2oupto30μl说明：最适载体使用量x＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng；最适片段使用量y＝[0.04×插入片段碱基对数]ng最适片段使用量m＝[0.04×插入片段碱基对数]ng最适片段使用量w＝[0.04×插入片段碱基对数]ng。重组反应条件：37℃，30min，置于冰上5min。-20℃中保存。注明：重组酶exnase∥试剂盒购自takara公司。5)转化：将连接产物加入大肠杆菌dh5α感受态细胞(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中，温和混匀后冰浴20min，42℃热击90s，再次冰浴5min，加入400μl液体无抗lb，37℃，200rpm培养1h，取200μl涂在卡那(kan)霉素抗性(50μg/ml)lb板，37℃培养过夜。6)菌落pcr检测：挑选单菌落进行菌落pcr检测，排除假阳性重组子。将检测正确的单菌落送往生工公司测序。测序正确则是说明重组载体构建成功，即构建得到ftshi5干涉载体。7)杆菌转化将1μg重组质粒加入农杆菌gv3101感受态细胞(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中，温和混匀后，冰浴30min，液氮速冻5min，37℃水浴2min，加入500μl液体无抗lb，28℃摇床100rpm培养3h；涂于含有利福平(50μg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)和卡那霉素抗性(50ug/ml)的平板，28℃培养2天。1.2转基因阳性苗的获取和筛选1)农杆菌浸花转化重组质粒转化农杆菌gv3101后，采用浸花法转到拟南芥。将含有目的基因的农杆菌单菌落接种到3ml含目的基因载体抗性的液体lb，28℃，200rpm培养12h；将种子液按1：100接种至300ml含利福平(50μg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)抗性的液体lb中，28℃，200rpm培养12h；离心收集菌体；用农杆菌转化液将菌体重悬，调节至od600＝0.8～1.0；将拟南芥花在转化液中浸泡1min；材料处理完后横放，黑暗环境培养24h。2)筛选：转化植株的种子为t1代，将t1代种子播种在潮霉素(50μg/ml)抗性ms培养基(购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)，在正常光照培养箱中培养约1周，观察并筛选阳性苗。将生长良好的t1代抗性苗转移到正常的植物培养基中培养2～3天后，将抗性苗移栽到营养土(所述的营养土是荷兰进口捷菲泥炭土，购自jiffy公司，网站：https://www.jiffygroup.com/)中，待种子成熟后，单株收种，即得t2代。将t2代继续用含潮霉素抗性的ms培养基中继续筛选，直至得到纯合的转基因株系。为研究ftshi5基因对拟南芥叶绿体发育的影响，本实验通过构建ftshi5诱导型干涉株系。选取ftshi5基因全长cdna中的一段片段(431bp)和phannibal载体上pdk(pyruvateorthophosphatedikinase)内含子，利用同源重组反应连接到诱导载体pta7002-avrpto。将测序正确的重组质粒转化农杆菌gv3101，采取浸花法将ftshi5干涉载体转入野生型拟南芥columbia(col-0)中。最后通过筛选获得多个干涉株系，分别命名为dex:rnai-ftshi51号株系、dex:rnai-ftshi52号株系、dex:rnai-ftshi56号株系，分别简写为#1、#2、#6。经鉴定，干涉株系经地塞米松(dex，浓度为5μmol/l)诱导剂处理7天后，生长发育受到严重影响，ftshi5转录水平出现不同程度下调(图1a)，叶片出现相应的黄化表型(图1b)。而在不添加诱导剂的培养基中(对照组)，干涉株系dex:rnai-ftshi5和野生型无明显差别。实施例2：叶绿素含量的测定及叶绿体超微结构观察在添加和不添加dex(浓度为5μmol/l)诱导的ms培养基中，生长2周的野生型拟南芥col-0和干涉株系dex:rnai-ftshi5(#1、#2、#6)的叶绿素含量。由图2可知，通过测定野生型拟南芥col-0和干涉株系dex:rnai-ftshi5(#1、#2、#6)在添加和不添加dex时的叶绿素含量，发现破坏或下调ftshi5转录表达，叶片叶绿素含量下降。由图3可知，通过透射电镜对dex:rnai-ftshi5#6植株的叶绿体超微结构进行观察，相比对照组，经dex(30μmol/l)诱导7天和14天的干涉株的叶绿体中发现下调ftshi5转录表达后，内囊体结构受到损伤，进一步说明ftshi5基因参与对叶绿体发育的调控。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>拟南芥ftshi5基因在调控拟南芥叶绿体发育中的应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>3963<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ftshi5基因编码序列<400>1atggatttcatttccgcttcttccttatcttcacccttttccacacagttgtctccgatt60tatttgagctcaggtatagtatcgttaaagcctagacatcgagtcaaaaatcgaaacttt120gggtctagagaatccaataataaatctaggaaaattgtgcccattagaggctgctttggt180ttttccgggagttttttgaggtcgaaacagtctgattacggtagtgaagctgtttcggaa240tcattgagattatgtggagagggaaatgagcttgtgctatcttccgagtataatagcgca300aagacgagagagagcgtaatacagtttgttaccaagcctctagtttacgccttgttttgt360attgcaattggactttctccgattcgctcttttcaagctccagctttagctgtgcctttc420gtcagtgatgttatttggaagaaaaagaaagagagagtgagagagaaagaggtggttttg480aaagcagttgatcatgagttctcggattatactcggagattgttggagacagtctcggtt540ttactgaagactattgagatagttagaaaggaaaatggagaggttgctgaagtgggagcg600gctttggatgcagttaaggtggagaaggagaaactgcagaaggagataatgagtgggtta660tatcgtgatatgaggcggttgaggaaggagagagatttgttaatgaaacgagctgataaa720attgtagatgaggccctaagtttgaagaaacagagtgaaaaactgttgagaaaaggtgct780agggagaaaatggagaaactggaagagagtgtggatattatggagagcgagtacaataag840atatgggaaagaatagatgagattgatgatatcattttaaagaaagagacaacaacattg900agttttggggttagggagcttattttcattgaaagagagtgtgtagagttggttaagagc960ttcaaccgagaattgaatcaaaaaagttttgaaagtgttcctgaaagctccattacaaaa1020ctctcgaggtctgagattaagcaggaattagtgaacgctcaaagaaagcacttggaacaa1080atgatactgcccaatgttttggaactagaggaggttgatccctttttcgatcgtgactca1140gtggatttttctctacgcatcaaaaaacgccttgaggaatcaaaaaagctgcagagagat1200cttcagaatcgtatcagaaaacgtatgaaaaagtttggtgaagaaaagctttttgttcaa1260aagactccagaaggtgaagctgtcaagggatttcctgaagcagaggtgaaatggatgttt1320ggagagaaagaggtggttgttccgaaagctatccagctccatctacgccatggttggaaa1380aagtggcaggaagaagcaaaagccgatttaaaacagaaacttttggaagatgttgatttt1440ggcaaacaatatattgcgcagagacaggaacaagttctcctggatcgagatagagttgtt1500tcgaagacttggtataacgaagacaaaagtaggtgggagatggaccctatggctgttccc1560tacgcagtttccaggaagctgattgacagtgccaggattaggcatgattatgctgtaatg1620tatgttgcattaaaaggagatgacaaggagttttacgttgatatcaaggaatatgagatg1680ctatttgagaaatttggagggtttgatgctctgtacctcaaaatgcttgcttgtggaatc1740ccaacttctgttcatctgatgtggatacccatgtcagagctaagtcttcaacaacagttt1800ctgttggttacaagggtggtttctcgagtctttaacgcattgaggaagactcaagttgta1860tcaaatgcgaaggatacagtattagagaaaataaggaatataaacgatgacattatgatg1920gcggttgtgtttccagttatcgaatttatcattccttaccagttaaggctgcgtctggga1980atggcttggccagaagaaatagaacagactgttggctcaacatggtacttacaatggcag2040tctgaagcagaaatgaatttcaagtcccgcaatacagaagattttcagtggttcctctgg2100tttctaattcgaagttctatatacgggtttgttttgtatcacgttttccgctttctaaaa2160agaaaggttccaagacttcttggctatggacccttccgccgagatcccaacgtacggaaa2220ttctggagagtgaaatcatatttcacttatagaaaaaggagaatcaaacaaaagagaaag2280gctggaatcgaccccataaaaactgcattcgacagaatgaagagagtgaaaaatccacct2340atcccattaaagaactttgctagtattgagtctatgagagaagaaatcaacgaggttgtg2400gcatttttacagaatccaaaggcatttcaggagatgggagcccgcgcacctcggggcgtt2460cttattgtgggtgagagaggaacgggaaagacgtcactggcgctcgctatagcagccgaa2520gcaagagtgcctgttgtcaatgttgaagctcaagagttggaagctgggctatgggttggt2580caaagtgcagcgaatgtcagggaactctttcaaactgcaagagacttggcacctgtaatc2640atttttgtggaggattttgacctctttgctggtgtacgcgggaagtttgtacatacaaaa2700cagcaagatcatgaatcgttcattaatcagcttcttgttgaacttgatggctttgagaaa2760caggatggcgtagttttgatggcgacgacacgaaatcataagcaaattgatgaggcgcta2820agaaggccaggtcgtatggatagagtattccatcttcaaagtccaactgaaatggaaagg2880gagaggattttacacaacgctgcagaagaaaccatggaccgagaactcgttgatctagtg2940gattggcgtaaggtttcagagaagacaactttattaagaccgatagaactgaaacttgtt3000ccaatggctctcgaaagtagtgccttcagaagcaaatttctggacactgacgaacttctg3060agttacgttagctggtttgcgacgtttagccatatagtgcccccatggctgcgaaaaact3120aaagttgcaaagacaatgggcaaaatgcttgtgaatcatcttggacttaacttaaccaaa3180gatgatttggagaatgtggttgatctgatggaaccatatggacaaataagtaatggaata3240gaacttttgaatcctactgttgattggacgagggagacaaagttcccacatgctgtctgg3300gcggctggtcgtgctctcatcacacttctaataccaaactttgatgttgtggaaaatctt3360tggcttgagcctagttcctgggaaggaattgggtgtacaaaaatcaccaaggtcacaagt3420ggaggctccgcgattgggaacacggaatcaagatcatatcttgaaaagaagctcgttttc3480tgctttggatctcacattgcatcccaaatgcttcttcctcccggagatgaaaattttctt3540tcttcttcagaaataactaaagcgcaggagattgcaacacgtatggtgcttcaatatggc3600tggggacccgatgacagtcctgcagtatactatgctactaacgcggtttcagctttgagt3660atggggaacaatcacgaatatgaaatggcgggtaaagttgaaaagatttatgacttagcg3720tacgaaaaggcaaagggaatgctccttaaaaatcgacgtgtccttgagaaaatcacagag3780gagctactcgaatttgagattttaactcataaggatttggaaagaattgttcatgagaat3840ggtgggattcgggagaaggaacctttctttctatcaggaaccaattacaatgaggcattg3900tcaaggagttttcttgatgttggagatccgccagaaactgcacttcttagtgcaccaacc3960taa3963<210>2<211>1320<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ftshi5基因氨基酸序列<400>2metasppheileseralaserserleuserserpropheserthrgln151015leuserproiletyrleuserserglyilevalserleulysproarg202530hisargvallysasnargasnpheglyserarggluserasnasnlys354045serarglysilevalproileargglycyspheglypheserglyser505560pheleuargserlysglnserasptyrglyserglualavalserglu65707580serleuargleucysglygluglyasngluleuvalleuserserglu859095tyrasnseralalysthrarggluservalileglnphevalthrlys100105110proleuvaltyralaleuphecysilealaileglyleuserproile115120125argserpheglnalaproalaleualavalprophevalseraspval130135140iletrplyslyslyslysgluargvalargglulysgluvalvalleu145150155160lysalavalasphisglupheserasptyrthrargargleuleuglu165170175thrvalservalleuleulysthrilegluilevalarglysgluasn180185190glygluvalalagluvalglyalaalaleuaspalavallys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