本发明属于生物医药领域，具体涉及一种制备达木林B的方法。
背景技术：
绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino又名甘茶蔓、神仙草、遍地生根等，是葫芦科绞股蓝属的多年生草质藤本植物，在我国主要生长在秦岭及长江以南的地区。其始载于明代的《救荒本草》，作野菜使用，《本草纲目》中开始将其以“乌蔹莓”之名入药。《中国壮药学》：“通调三道两路，清热解毒，止咳祛痰。用于慢性气管炎，病毒性肝炎，肾盂肾炎，胃肠炎，泄泻，高血压，动脉硬化症，高血脂，痈疮肿毒，蛇咬伤”。绞股蓝中主要化学成分为皂苷和多糖，另外还含有少量的黄酮类化合物、萜类、有机酸、蛋白质、维生素、脂肪、纤维等成分以及锌、铜、镁、铁、锰、硒等微量元素。绞股蓝具有抗肿瘤、降血糖、抗衰老、抗肝纤维化等药理作用，其主要有效成分绞股蓝皂苷过量服用亦无副作用，因而在保健食品和新型药品研发上都有巨大的应用前景，是一种新的药食两用植物资源。
绞股蓝中含有的皂苷成分众多，研究较多、活性较好的有绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A(DamulinA)和达木林B(Damulin B)。其中，绞股蓝皂苷LVI、XLVI含量较高，其他四种为含量极低的稀有皂苷(为绞股蓝皂苷LVI、XLVI的转化产物)。
目前，绞股蓝皂苷LVI、XLVI以绞股蓝为原料提取分离纯化得到，绞股蓝皂苷L、LI、达木林A和达木林B以经过加热炮制的绞股蓝为原料提取分离纯化得到(文献：Determination by UPLC-MS of four dammaranetype saponins from heat-processed Gynostemma pentaphyllum；Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry,2014；Vol.78,No.2,311-316)。以绞股蓝为原料制备绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A和达木林B存在两点不足：
第一，绞股蓝价格相对较高，成本高。自从1986年国家科委在“星火计划”中把绞股蓝列为待开发的“名贵中药材”之首位，绞股蓝的市场价格就明显上涨。
第二，未加热炮制的绞股蓝中绞股蓝皂苷L、LI、达木林A和达木林B非常低，分离纯化难度大；加热炮制费事，且加热后绞股蓝皂苷L、LI、达木林A和达木林B的含量并非同步增加，加热温度和时间难以掌控(上述引用文献也可体现这种现象)。
绞股蓝属共有2亚属13种2变种，2亚属为绞股蓝亚属、喙果藤亚属，上述的绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino即为绞股蓝亚属中的一种(文献：绞股蓝属植物的分类系统和分布，植物分类学报，1995)。研究发明，绞股蓝属植物基本都含有绞股蓝皂苷，且种类基本相同，但是该属不同植物中特定绞股蓝皂苷的含量差别较大。产自湖北西部、陕西南部和四川的心籽绞股蓝Gynostemma cardiospermum Cogn.ex Oliv属于喙果藤亚属，其主要特征是果为蒴果，成熟时顶端沿腹缝线开裂，具宿存的3枚喙状花柱，其他特征则与绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino基本一致。目前尚未有报道公开绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A、B在心籽绞股蓝Gynostemma cardiospermum Cogn.ex Oliv中的含量显著高于绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种制备达木林B的方法。
上述目的通过如下技术方案实现：
绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A和达木林B的制备方法包括如下步骤：
步骤S1，收集心籽绞股蓝Gynostemma cardiospermum Cogn.ex Oliv的叶，阴干，用乙醇水溶液加热回流提取，纱布过滤，合并滤液浓缩至无醇味；
步骤S2，将浓缩至无醇味的提取液上样于D101大孔吸附树脂柱，树脂径高比为1:10，拌样树脂占树脂总量的1/10，湿法装柱，拌树脂上样；先用10BV的30％乙醇以10BV/h的流速洗脱除杂，再用10BV的85％乙醇以10BV/h的流速洗脱，收集3-10BV洗脱液，浓缩至无醇味得到总皂苷水溶液；
步骤S3，将总皂苷水溶液调节pH值至6.0，加入壳聚糖/凹凸棒石黏土复合物，常温搅拌、静置、过滤，收集滤液，调节pH值至中性，冷冻干燥得到精制总皂苷粉末；
步骤S4，将精制总皂苷粉末上样于正相硅胶柱，硅胶径高比为1:10，拌样硅胶占硅胶总量的1/10，干法装柱，拌硅胶上样；依次用体积比为20:1:2、10:1:2、5:1:2、2:1:2的二氯甲烷/甲醇/丙酮混合溶剂以12BV/h的速度梯度洗脱，分别洗脱10BV、6BV、5BV、3BV；
步骤S5，分别收集20:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱7-8BV、9-10BV的洗脱液浓缩干燥得到达木林B、达木林A；分别收集10:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱3-4BV、5-6BV的洗脱液浓缩干燥得到绞股蓝皂苷L、绞股蓝皂苷LI；收集5:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱4-5BV的洗脱液浓缩干燥得到绞股蓝皂苷XLVI；收集2:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱2-3BV的洗脱液浓缩干燥得到绞股蓝皂苷LVI。
优选地，壳聚糖/凹凸棒石黏土复合物制备方法为：1g壳聚糖溶于100mL质量分数为1％的醋酸水溶液中得到壳聚糖溶胶，向该溶胶中加入8g凹凸棒石黏土，常温搅拌48h，静置2h后将上层溶液倾倒出，剩余物50℃烘干，研磨、干燥。
优选地，步骤S1乙醇水溶液体积百分浓度为75％。
优选地，步骤S1提取的固液比为1:20。
优选地，步骤S3中1L总皂苷水溶液加入50g壳聚糖/凹凸棒石黏土复合物。
优选地，步骤S3加入壳聚糖/凹凸棒石黏土复合物后搅拌24h，静置2h后过滤。
优选地，步骤S3用盐酸和氨水调节pH。
本发明技术优势：
1、本发明以同属但不同亚属的心籽绞股蓝Gynostemma cardiospermum Cogn.ex Oliv替代绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino作为原料，可以提取分离纯化制备得到大量绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A和达木林B，绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A和达木林B在心籽绞股蓝Gynostemma cardiospermum Cogn.ex Oliv叶中的含量分别是在绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino叶中的含量的10-50倍；而心籽绞股蓝Gynostemma cardiospermum Cogn.ex Oliv没有商品化，漫田遍野无人问津，成本可以忽略。
2、本发明步骤S3用壳聚糖/凹凸棒石黏土复合物对总皂苷水溶液进行精制，有效降低了总皂苷中的杂质，极大简化了后续正相硅胶柱色谱工艺，产物纯度高。
附图说明
图1为步骤S2总皂苷水溶液的高效液相色谱分析谱图；
图2为步骤S3精制总皂苷粉末的高效液相色谱分析谱图；
图3为硅胶柱色谱纯化得到的达木林B的高效液相色谱分析谱图；
图4为硅胶柱色谱纯化得到的达木林A的高效液相色谱分析谱图；
图5为硅胶柱色谱纯化得到的绞股蓝皂苷L的高效液相色谱分析谱图；
图6为硅胶柱色谱纯化得到的绞股蓝皂苷LI的高效液相色谱分析谱图；
图7为硅胶柱色谱纯化得到的绞股蓝皂苷XLVI的高效液相色谱分析谱图；
图8为硅胶柱色谱纯化得到的绞股蓝皂苷LVI的高效液相色谱分析谱图。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于这些具体实施例。
一、实验材料
心籽绞股蓝Gynostemma cardiospermum Cogn.ex Oliv的叶收集自湖北十堰市房县，绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino的叶收集自湖南邵阳绥宁，阴干后使用。
壳聚糖/凹凸棒石黏土复合物制备方法为：1g壳聚糖溶于100mL质量分数为1％的醋酸水溶液中得到壳聚糖溶胶，向该溶胶中加入8g凹凸棒石黏土，常温搅拌48h，静置2h后将上层溶液倾倒出，剩余物50℃烘干，研磨、干燥。
不同浓度乙醇均指不同体积百分浓度的乙醇水溶液。
二、实验方法
1、绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A和达木林B的制备
包括如下步骤：
步骤S1，收集心籽绞股蓝Gynostemma cardiospermum Cogn.ex Oliv的叶，阴干，用体积百分浓度为75％的乙醇水溶液加热回流提取，固液比为1:20，提取3次，每次2h，纱布过滤，合并滤液浓缩至无醇味；
步骤S2，将浓缩至无醇味的提取液上样于D101大孔吸附树脂柱，树脂径高比为1:10，拌样树脂占树脂总量的1/10，湿法装柱，拌树脂上样；先用10BV的30％乙醇以10BV/h的流速洗脱除杂，再用10BV的85％乙醇以10BV/h的流速洗脱，收集3-10BV洗脱液，浓缩至无醇味得到总皂苷水溶液；
步骤S3，将总皂苷水溶液用盐酸调节pH值至6.0，加入壳聚糖/凹凸棒石黏土复合物，1L总皂苷水溶液加入50g壳聚糖/凹凸棒石黏土复合物，搅拌24h，静置2h后过滤，收集滤液，氨水调节pH值至中性，冷冻干燥得到精制总皂苷粉末；
步骤S4，将精制总皂苷粉末上样于正相硅胶柱，硅胶径高比为1:10，拌样硅胶占硅胶总量的1/10，干法装柱，拌硅胶上样(精制总皂苷粉末用甲醇溶解后与拌样硅胶混合均匀、干燥，精制总皂苷粉末与拌样硅胶的质量比1:1)；依次用体积比为20:1:2、10:1:2、5:1:2、2:1:2的二氯甲烷/甲醇/丙酮混合溶剂以12BV/h的速度梯度洗脱，分别洗脱10BV、6BV、5BV、3BV；
步骤S5，分别收集20:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱7-8BV、9-10BV的洗脱液浓缩干燥得到达木林B、达木林A；分别收集10:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱3-4BV、5-6BV的洗脱液浓缩干燥得到绞股蓝皂苷L、绞股蓝皂苷LI；收集5:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱4-5BV的洗脱液浓缩干燥得到绞股蓝皂苷XLVI；收集2:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱2-3BV的洗脱液浓缩干燥得到绞股蓝皂苷LVI。
2、高效液相色谱分析条件
色谱仪：LC-20ADXR高压泵；SPD-M20A二极管阵列紫外可见光检测器；CTO-20AC柱温箱；CBM-20A系统控制器；SIL-20ACXR自动进样器；
色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C18(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相A相：水(含万分之五四氢呋喃)；
流动相B相：乙腈(含万分之五四氢呋喃)；
洗脱程序：0-3min，20％B相；3-15min，20％→40％B相；15-30min，40％→80％B相；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：203nm；
进样量：10μL。
三、实验结果
取步骤S2总皂苷水溶液稀释5倍作为高效液相色谱进样溶液，取步骤S3精制总皂苷粉末用初始比例的流动相溶解成0.5mg/mL的溶液作为高效液相色谱进样溶液。图1为步骤S2总皂苷水溶液的高效液相色谱分析谱图，图2为步骤S3精制总皂苷粉末的高效液相色谱分析谱图。从图1、2可见，步骤S2所得总皂苷水溶液成分复杂，步骤S3精制总皂苷中杂质成分极大降低，说明壳聚糖/凹凸棒石黏土复合物在pH 6.0条件下可以有效吸附去除总皂苷水溶液中的杂质成分。经过除杂，有助于降低后续硅胶柱层析的工艺难度。
精制总皂苷经过步骤S4、S5硅胶柱层析分离纯化后得到绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A和达木林B单体。图3为硅胶柱色谱纯化得到的达木林B的高效液相色谱分析谱图，图4为硅胶柱色谱纯化得到的达木林A的高效液相色谱分析谱图，图5为硅胶柱色谱纯化得到的绞股蓝皂苷L的高效液相色谱分析谱图，图6为硅胶柱色谱纯化得到的绞股蓝皂苷LI的高效液相色谱分析谱图，图7为硅胶柱色谱纯化得到的绞股蓝皂苷XLVI的高效液相色谱分析谱图，图8为硅胶柱色谱纯化得到的绞股蓝皂苷LVI的高效液相色谱分析谱图。从图3-8可见，绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A和达木林B纯度非常高，在95％以上。经过一次硅胶柱层析即可制备得到如此高纯度的绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A和达木林B，主要得益于步骤S3壳聚糖/凹凸棒石黏土复合物的精制除杂。
本发明具有如下优点：
本发明以同属但不同亚属的心籽绞股蓝Gynostemma cardiospermum Cogn.ex Oliv替代绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino作为原料，可以提取分离纯化制备得到大量绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A和达木林B，绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A和达木林B在心籽绞股蓝Gynostemma cardiospermum Cogn.ex Oliv叶中的含量分别是在绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino叶中的含量的12、11、45、37、42、55倍(操作方法：直接用甲醇提取两种绞股蓝的干燥叶，固体比1:40，超声40min，过滤，然后用高效液相色谱法对滤液进行分析，根据绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A和达木林B的峰面积比值粗略计算其在两种滤液中的含量比值)；而心籽绞股蓝Gynostemma cardiospermum Cogn.ex Oliv没有商品化，漫田遍野无人问津，原料成本可以忽略。
本发明步骤S3用壳聚糖/凹凸棒石黏土复合物对总皂苷水溶液进行精制，有效降低了总皂苷中的杂质，极大简化了后续正相硅胶柱色谱工艺，产物纯度高。